CN103048347A - 一种鉴别苦皮藤根皮药材的方法 - Google Patents

一种鉴别苦皮藤根皮药材的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种鉴别苦皮藤根皮药材的方法，包括：对苦皮藤根皮药材进行提取，得到含有活性成分组的苦皮藤根皮药材特征提取物；对特征提取物进行IGD核磁共振碳谱指纹图谱检测，根据指纹图谱得到特征提取物中若干个活性成分特征峰峰强度；并用相同方式测定出各活性成分相应的标准参照品的特征峰峰强度；通过定量分析手段测定得到苦皮藤根皮药材中标准参照品的绝对含量；利用特征峰峰强度的比值和所述绝对含量，计算出苦皮藤根皮药材中各活性成分的含量及活性成分组含量。本发明利用IGD核磁共振碳谱偶联指纹图谱技术，反映苦皮藤根皮中含有4-OH-β-二氢沉香呋喃倍半萜多醇酯类化合物及其比例，完成对苦皮藤根皮药材品种和质量的鉴定。

Description

一种鉴别苦皮藤根皮药材的方法
技术领域
本发明属于天然药用植物的鉴别领域，具体地，涉及一种鉴别苦皮藤根皮药材的方法。
背景技术
苦皮藤（Celastrus angulatus）亦叫马断肠、苦树皮、老虎麻等，系卫矛科（Celastraceae）南蛇藤属（Celastrus）多年生藤状灌木植物，产于河北、山东、河南、陕西、湖北、甘肃、江苏、安徽等省。其根、茎、叶、果实和种子是天然的杀虫剂又是重要的中药资源，民间用其根皮、茎皮、树叶防治蔬菜及各种作物的虫害已有相当长的历史[①中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志.科学出版社，1999，45(3)：102.②柯治国,等.The research and advances on the plant-basedinsect antifeedant Celastrus angulatus[J].武汉植物学研究1993,11(3):265-271]。苦皮藤对菜青虫、猿叶虫、小菜蛾、黄守瓜等害虫有独特的效果，可谓长年不衰的植物杀虫剂。苦皮藤是我国特有的杀虫植物，它具有多种功效，对不同的害虫有不同的生理活性，性能稳定、使用安全、不杀伤天敌、无污染[柯治国，等.杀虫植物——苦皮藤种子的研究.第三届湖北湖南植保农药学术研讨会论文集，2004，94-300]。研究证明其中所含的杀虫活性成分主要是以β-二氢沉香呋喃倍半萜为骨架的多元醇酯化合物及其生物碱。这些物质对昆虫具有毒杀、拒食、麻醉等作用[吴文君.植物杀虫剂苦皮藤素研究与应用[M].化学工业出版社，2010]。自苦皮藤素被国家审批为植物源杀虫剂以来，其乳油、水乳剂、微乳剂[CN 92113104.6；CN94103655.3；CN 99109275.9；CN 02122988.0]已不断投放市场并且收到良好的经济效益和社会效益。
苦皮藤的杀虫活性成分具有多样性、复杂性等特点，而且因产地、气候、光照等自然条件差异或提取溶剂的不同，活性成分的含量会有所变化。因此，在鉴别和评价苦皮藤药材及其产品过程中，仅仅采用某种单一分析检测手段[如高效液相色谱法(HPLC）]测定其中某一种主要活性成分（如采用苦皮藤素Ⅴ(苦皮素A)的含量鉴别代表苦皮藤药材及其产品的含量），这种模式不能全面、综合地反映苦皮藤药材及其产品之间的质量差异，当然也不能全面评价苦皮藤药材及其产品的好坏。指纹图谱技术己成为国际公认的区别评价植物天然产物及其原料的最有效的手段[周玉新.中药指纹图谱研究技术.北京：化学工业出版社，2002]。关于苦皮藤药材的1H NMR指纹图谱[秦海林等，苦皮藤的1H NMR指纹图谱解析.药学学报，2001，36（6）：462-466]和红外指纹图谱[刘惠霞,等.苦皮藤的红外光谱特征及其在鉴别中的应用.西北植物学报1998，305-310]曾见报道，仅能定性分析，未实际应用。并且，IGD核磁共振碳谱偶联指纹图谱未见报道。
IGD核磁共振碳谱偶联指纹图谱技术，也叫反门控去偶核磁共振碳谱（IGD 13C NMR）偶联（coupling）指纹图谱技术，是在已研究多年的核磁共振氢谱（1H NMR）指纹图谱技术[赵天增，等.1HNMR指纹法鉴定植物中药.中草药2000，31(11)：868-870]的基础上联合其他技术（例如目前应用最广泛的高效液相（HPLC）指纹图谱技术[谢培山等.中药色谱指纹图谱.人民卫生出版社，2005]）提出的一种新的非单一手段综合指纹图谱技术。
随着药品、食品安全日益受到国家和社会的高度重视，可广泛应用于无公害蔬菜、农作物和非作物类的害虫防治的苦皮藤素需求量很大，为IGD核磁共振碳谱偶联指纹图谱技术的应用提供了广阔的基础。苦皮藤药材IGD核磁共振碳谱偶联指纹图谱技术的研究与应用，不仅可以解决我国苦皮藤药材（尤其是苦皮藤根皮药材）鉴别和评价的难题，也为加强苦皮藤药材内在成分研究的系统化与标准化，加快植物源农药苦皮藤素现代化的发展，实现与国际接轨提供了科学的保证。随着该技术在其他中药材及其提取物、植物源农药中的推广应用，该技术的重大科学价值必将日趋突出。
发明内容
为了解决现有技术的问题，本发明的目的在于提供一种鉴别苦皮藤根皮药材的方法，该方法利用了IGD核磁共振碳谱偶联指纹图谱技术。
为实现上述目的，本发明提供的鉴别苦皮藤根皮药材的方法，包括以下步骤：
1）对苦皮藤根皮药材进行提取，得到含有活性成分组的苦皮藤根皮药材特征提取物；
2）对所述苦皮藤根皮药材特征提取物进行IGD核磁共振碳谱指纹图谱检测，根据指纹图谱得到所述苦皮藤根皮药材特征提取物中若干个活性成分特征峰峰强度；并用相同方式（IGD核磁共振碳谱指纹图谱）测定出所述各活性成分相应的标准参照品的特征峰峰强度；
3）通过定量分析手段测定得到苦皮藤根皮药材中所述标准参照品的绝对含量；
4）利用所述特征峰峰强度（各活性成分特征峰峰强度及相应标准参照品的特征峰峰强度）的比值和所述绝对含量，计算出苦皮藤根皮药材中各活性成分的含量及该类活性成分的总含量，即活性成分组的含量。
其中，步骤1）中，苦皮藤根皮药材特征提取物的制备方法，包括：称取苦皮藤根或/和皮药材，粉碎，用6~10倍量90~95%的乙醇回流提取2~3次，滤液合并后减压浓缩，回收溶剂至粉末，即得苦皮藤根皮药材特征提取物。
进一步地，用乙醇回流提取，每次提取1~2小时。
进一步地，苦皮藤根或/和皮药材粉碎后过10~24目筛。
其中，步骤2）中，在对苦皮藤根皮药材特征提取物进行IGD核磁共振碳谱指纹图谱检测前，可以进行适当处理，具体方式包括：取苦皮藤根皮药材特征提取物，加入6~10倍量氯仿，60~80℃下回流提取20~40min，过滤后减压浓缩，回收溶剂至干。溶于CDCl3（氘代氯仿）中，之后即可以做IGD核磁共振碳谱指纹图谱检测。
其中，步骤2）中，所述苦皮藤根皮药材特征提取物中的活性成分特征峰为：C-15吸收峰，其化学位移为δC 60.0~66.0。
其中，步骤2）中所述峰强度，可以采用峰高法、面积积分法或重量法计算。
其中，步骤3）中所述标准参照品的绝对含量是指：用定量分析手段测定的苦皮藤根皮药材中标准参照品的质量百分含量。
其中，步骤3）中，所述定量分析手段为：高效液相法（HPLC法）。
进一步地，所述HPLC法的条件为：色谱柱以十八烷基键合硅胶为填料，流动相为乙腈:水＝(60:40)~(55:45)的混合溶剂，检测波长为242nm。
其中，所述标准参照品为苦皮素B。
本发明主要测定的是苦皮藤根皮药材中4-OH-β-二氢沉香呋喃倍半萜多醇酯类化合物的含量。
其中，步骤4）中，计算各活性成分的含量的偶联公式为：
W n = W 1 M n h n M 1 h 1 ; 其中：
W1为步骤3）用定量分析手段测定的苦皮藤根皮药材中某一活性成分对应的标准参照品的绝对含量；
M1为所述某一活性成分对应的标准参照品的分子量；
h1为由IGD核磁共振碳谱指纹图谱测定的苦皮藤根皮药材特征提取物中所述某一活性成分对应的标准参照品的特征峰峰强度；
Wn为苦皮藤根皮药材中某一活性成分的质量百分含量；
Mn为某一活性成分的分子量；
hn为由IGD核磁共振碳谱指纹图谱测定的苦皮藤根皮药材特征提取物中某一活性成分的特征峰峰强度；
该类活性成分的总含量就是同类的各活性成分的Wn相加之和，即活性成分组的含量。
本发明方法所述活性成分组，是苦皮藤单味根皮药材中的活性成分组。苦皮藤根皮药材，是指苦皮藤植物的根或/和皮的部位。
本发明各活性成分的含量及该类活性成分的总含量的计算，是通过偶联公式将IGD核磁共振碳谱和分析定量手段偶联。和现有技术相比，本发明采用IGD 13C NMR偶联指纹图谱具有下面几个特点：
①稳定性（重复性）：IGD 13C NMR得到的化学位移数据为小数点后第二位，分辩性好，重复性好；HPLC、GC的非色谱条件（如色谱柱内径、长度、固定相牌号、载体粒度、流动相流速、混合流动相各组分比例、柱温、进样量、检测器灵敏度等）改变等，得到的保留时间数据变化很大，意味着整体色谱图形的变异，重复性不好。
②整体性（全面性）：IGD 13C NMR指纹图谱中包含样品中的每一个活性成分碳的相应谱峰；HPLC、GC、UV、IR、MS不存在这种关系。
③可靠性（单一性）：IGD 13C NMR谱峰与样品中不同活性成分及其不同基团上的碳是严格的一一对应关系；HPLC、GC、UV、IR、MS不存在这种关系。
④可行性（易辨性）：IGD 13C NMR指纹图谱规律性很强，一般情况下，可归属图谱中的每一个碳峰；HPLC、GC需要对照品；IR不易解析；UV信息量少；MS则有离子化程度和基质干扰等问题。
本发明针对苦皮藤活性成分的多样性、复杂性及高效液相色谱指纹图谱和核磁共振氢谱（1H NMR）指纹图谱的局限性，构建IGD核磁共振碳谱偶联指纹图谱技术，反映苦皮藤中含有哪些4-OH-β-二氢沉香呋喃倍半萜多醇酯类化合物以及它们之间的比例，达到对苦皮藤根皮药材品种和质量鉴定的目的，准确性和稳定性、重复性和可行性与现有技术相比都有很大的提高。
附图说明
图1-a为安徽毫州苦皮藤根皮药材特征提取物IGD核磁共振碳谱指纹图谱。
图1-b为安徽毫州苦皮藤根皮药材特征提取物IGD核磁共振碳谱指纹图谱特征峰局部拉宽放大图。
图2-a为陕西宝鸡苦皮藤根皮药材特征提取物IGD核磁共振碳谱指纹图谱。
图2-b为陕西宝鸡苦皮藤根皮药材特征提取物IGD核磁共振碳谱指纹图谱特征峰局部拉宽放大图。
图3-a为湖北恩施苦皮藤根皮药材特征提取物IGD核磁共振碳谱指纹图谱。
图3-b为湖北恩施苦皮藤根皮药材特征提取物IGD核磁共振碳谱指纹图谱特征峰局部拉宽放大图。
图4为本发明苦皮藤根皮药材特征提取物获取程序流程图。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步地详细描述，但本发明的保护范围并不局限于此。
1、苦皮藤根皮药材IGD核磁共振碳谱偶联指纹图谱研究步骤
（1）特征提取物获取程序研究
取阴干的苦皮藤根或/和皮100~200g，粉碎后过10~24目筛，用6~10倍量90~95%乙醇回流提取2~3次，每次1~2小时，滤液合并后减压浓缩，回收溶剂蒸干至粉末，即得苦皮藤根皮药材特征提取物（Character Extract，CE）。准确称量得到的CE质量m药材′。其程序流程如图4所示。
（2）特征提取物IGD核磁共振碳谱指纹图谱检测
取苦皮藤根皮药材特征提取物1~2g，加入六倍量氯仿，60~80℃下回流提取20~40min，过滤后减压浓缩，回收溶剂至干。溶于0.5mLCDCl3中，作IGD核磁共振碳谱检测，即得到IGD核磁共振碳谱指纹图谱。
（3）特征提取物IGD核磁共振碳谱指纹图谱解析
1）鉴别
特征提取物IGD核磁共振碳谱指纹图谱中，应清楚地显示4-OH-β-二氢沉香呋喃倍半萜多醇酯类化合物的特征信号，且全部或大部分含有苦皮素A、E、H、U、X、celangulatin C；苦皮素B、C、F、G、P、苦皮藤素IV、苦皮藤素VII、苦皮藤素XIX；苦皮素J、苦皮藤素III信号。
具体数据如下：
δC74.9-75.5或70.5-70.9或75.8-76.0，66.9-68.1，41.1-42.1，72.1-72.2或69.7-69.9，91.3-91.7分别为A环1，2，3，4，5位脂环碳信号；76.2-77.0或75.0-75.6，53.0-53.8，73.3-74.7或75.6-76.5或69.7-69.8，74.9-75.5或70.6-72.6，50.1-50.8或53.9-54.5或52.9-53.0分别为B环6,7,8,9,10位脂环碳信号，82.5-84.6为4-OH-β-二氢沉香呋喃倍半萜多醇酯类化合物C-11碳信号，29.3-30.1，26.2-26.4或25.4-25.7或24.3-24.4，24.1-24.6为4-OH-β-二氢沉香呋喃倍半萜多醇酯类化合物C-12、C-13、C-14甲基碳信号，61.4-61.8或65.0-65.7或60.2-60.7为4-OH-β-二氢沉香呋喃倍半萜多醇酯类化合物C-15亚甲基碳信号。
2）各活性成分特征峰选取
由于特征提取物中含有一系列活性成分4-OH-β-二氢沉香呋喃倍半萜多醇酯类化合物，碳峰交叉得较多，为了测定各活性成分的比例，必须选择化学位移差别较大的相应峰作为特征峰。为此，经实际考察，选择了δC 60.0~66.0左右一组C-15峰。其原因为：一般情况下，C-15峰作为连氧碳，易于辨认；C-15位受C-9上α和β位取代基的γ效应不同，其化学位移差别较大。如苦皮素A、E、H、U、X、celangulatin C、苦皮藤素XIX的化学位移为δC 61.0左右；苦皮素B、C、F、G、P、苦皮藤素IV、VII的化学位移为δC 65.0左右；苦皮素J、苦皮藤素Ⅲ的化学位移为δC 60.0左右。
3）标准参照品的选择
苦皮素B是杀虫植物苦皮藤的主要杀虫活性成分之一，其特征峰的化学位移为δC 65.4，与其他主要活性成分特征峰在此没有重叠。因此，选择苦皮素B作为标准参照品。
（4）采用HPLC测定苦皮藤根皮药材中苦皮素B的含量
1）HPLC检测
①色谱条件
仪器：Agilent（安捷伦）1200
流动相：乙腈：水＝60：40
流速：1mL/min
色谱柱:Agilent C18（安捷伦十八烷基键合硅胶）4.6*250mm
检测器：紫外
波长：242nm
进样量：20μL；
②标准参照品溶液的配制
精确称取苦皮素B 5mg，置50mL容量瓶中，用甲醇溶解稀释至刻度，摇匀后即得标准参照品溶液（苦皮素B 100μg/mL）。
③标准曲线和检出限
浓度范围：1-100μg/mL（ppm）；标准参照品浓度分别为：1μg/mL、5μg/mL、50μg/mL、100μg/mL。
在上述色谱条件下，进行HPLC分析，苦皮素B总峰面积Y对浓度C的线性回归方程为：Y=2.69593+4.66649C（n=5,R=0.9999）。
检出限为：0.5ug/mL(S/N=3)。
根据标准曲线图,在所选的浓度范围内，苦皮素B的标准溶液的工作曲线线性关系良好。
④供试品溶液的制备
准确称取苦皮藤根皮药材特征提取物200mg于100mL容量瓶中，加适量甲醇溶解，超声振荡后稀释至刻度，摇匀后即得苦皮藤根皮药材特征提取物供试品溶液。
⑤精密度测定
供试品溶液重复进样3次，峰面积相对标准偏差RSD=0.26%，保留时间相对标准偏差RSD=0.19%。
⑥供试品的测定
吸取各供试品溶液，进样，测其峰面积，求得苦皮素B含量。
⑦回收率测定
采用标准加入方法，在供试品1中加标100μg/mL，平均回收率在87.0-102.9%之间。
2）苦皮素B绝对含量计算
①由下式计算供试品溶液中苦皮素B质量浓度：
C X = C R × A X A R
CX：苦皮藤根皮药材特征提取物供试品溶液中苦皮素B质量浓度（ug/mL）；
CR：标准参照品溶液苦皮素B质量浓度（ug/mL）；
AX：由HPLC测定的苦皮藤根皮药材特征提取物供试品溶液中苦皮素B峰面积；
AR：由HPLC测定的标准参照品溶液苦皮素B峰面积。
②由下式计算苦皮藤根皮药材特征提取物中苦皮素B质量百分含量：
Figure BDA00002017241600101
W′苦皮素B(%)：苦皮藤根皮药材特征提取物中苦皮素B质量百分含量；
CX：苦皮藤根皮药材特征提取物供试品溶液中苦皮素B质量浓度（ug/mL）；
m供试品：称取的苦皮藤根皮药材特征提取物供试品溶液质量(mg)。
③由下式计算苦皮藤根皮药材中苦皮素B质量百分含量：
Figure BDA00002017241600102
W苦皮素B（%）：苦皮藤根皮药材中苦皮素B质量百分含量（标准参照品的绝对含量）；
W′苦皮素B(%)：苦皮藤根皮药材特征提取物中苦皮素B质量百分含量；
m药材′：得到的苦皮藤根皮药材特征提取物的总质量(mg)；
m：称取的苦皮藤根皮药材的质量(mg)。
（5）通过偶联公式计算苦皮藤根皮药材中主要活性成分含量及总量
W n = W 1 M n h n M 1 h 1
Wn：苦皮藤根皮药材中其他某一活性成分质量百分含量；
W1：苦皮藤根皮药材中苦皮素B质量百分含量（标准参照品的绝对含量），即W苦皮素B（%）；
M1：苦皮素B（标准参照品）分子量；
h1：由IGD核磁共振碳谱指纹图谱测定的苦皮藤根皮药材特征提取物中苦皮素B（标准参照品）特征峰峰强度；
Mn：其他某一活性成分分子量；
hn：由IGD核磁共振碳谱指纹图谱测定的苦皮藤根皮药材特征提取物中其他某一活性成分特征峰峰强度。
2、仪器、试剂与材料
核磁共振波谱仪Bruker DPX 400型。
质谱仪：Waters Micromass Q-Tof MicroTM型。
半制备高效液相色谱仪：Waters 600型。
高效液相色谱仪：Agilent 1200型。
2000mL蒸馏烧瓶、5000mL蒸馏烧瓶、球型冷凝管、2000mL分液漏斗。
DE-52AA旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂。
DEF-6020型真空干燥箱：上海精宏实验设备有限公司。
柱层析硅胶G和薄层层析硅胶H：青岛海洋化工厂。
硅胶层析柱6cm×70cm（直径×高度）。
苦皮藤根皮药材（安徽毫州，2009年11月大量收购自当地）、苦皮藤根皮药材（陕西宝鸡，2009年11大量收购自当地）、苦皮藤根皮药材（湖北恩施，2009年11大量收购自当地），均经河南省农业大学朱长山教授鉴定。
苦皮素B，标准参照品，实验室自制（经光谱数据鉴定）。
试剂：色谱纯（甲醇，天津市四友精细化学品有限公司）及分析纯（天津市化学试剂一厂）。
3、基础研究
（1）分离提取流程1
称取阴干的河南淅川产苦皮藤根、皮1kg，粉碎，用6倍量体积苯回流提取3次，滤液合并后60℃减压浓缩，回收溶剂至浸膏状，浸膏用6倍量体积纯度80%的甲醇溶解后，60mL的石油醚萃取1次，甲醇层过滤后减压浓缩，回收溶剂得浸膏（27.5g）。取此浸膏用硅胶柱色谱分离，用石油醚-乙酸乙酯（10：1~4：6）溶剂体系进行梯度洗脱，每250mL收集1份，合并相同馏分。第38份经制备色谱纯化，得苦皮素E（18mg）；第42~43份得苦皮素A纯品（60mg）；第54份经制备色谱纯化，得苦皮素B（25mg），苦皮素H（40mg）；第61份得苦皮素G（95mg）；第69~70份经制备色谱纯化，得苦皮素F（45mg）；第76份经制备色谱纯化得苦皮素J（45mg）。
称取阴干的河南西峡苦皮藤根或/和皮粉末1kg，加3倍量苯80℃温度下回流提取三次，过滤，合并滤液。减压真空浓缩为浸膏。按此方法共提取苦皮藤根或/和皮粉末7kg，合并所有粗提液。粗提液经过减压真空浓缩为膏状物质（粗提物）。粗提物浸膏为206g。在粗提物浸膏中加入4200mL80%甲醇溶解后，300mL石油醚萃取1次，得甲醇部分浸膏113.3g。取此浸膏用硅胶柱色谱分离，用石油醚-乙酸乙酯（10:1~4:6）溶剂体系进行梯度洗脱（每500mL收集一份），经高效液相制备纯化[Sunfire C18色谱柱(150mm×10mm,10μm)；流动相：甲醇-水；柱温：25℃；流速：10mL/min；检测波长：232nm；进样量：200μl得到下列β-二氢沉香呋喃多元醇酯类化合物。第66~70份经制备纯化，得苦皮素A纯品（60mg）；第80份经制备纯化得苦皮素E（18mg）；第127份经制备纯化得苦皮素H（40mg）和苦皮素B（60mg）；第161份经制备纯化得苦皮素G（95mg），第193份经制备纯化得化合物苦皮藤素XIX（25mg），第203份经制备纯化得苦皮素C；第289份经制备纯化得苦皮素J(45mg)。
（2）分离提取流程2
称取1kg苦皮藤根或/和皮粉末，依次加入3︰2︰2倍量95%乙醇80℃下回流提取2h，过滤，合并三次滤液，减压浓缩至浸膏。按此方法共提取苦皮藤根或/和皮粉末7kg，总共得浸膏1120g。称取上述醇提物浸膏，加入六倍量氯仿，80℃下回流提取40min，过滤，减压浓缩至浸膏，得浸膏147g。此浸膏硅胶拌样后上柱，采用石油醚／乙酸乙酯(10:1～4:6)进行梯度洗脱，经高效液相制备纯化[Sunfire C18色谱柱(150mm×10mm,10μm)；流动相：甲醇-水；柱温：25℃；流速：10mL/min；检测波长：232nm；进样量：200μl]得到下列β-二氢沉香呋喃多元醇酯类化合物。第381-385份经制备纯化[甲醇-水65:35]得苦皮素E(27mg)；第420份经制备纯化[甲醇-水62:38]得苦皮素A(80mg)；第546-554份经制备纯化[甲醇-水60:40]得celangulatin C(57mg)和苦皮藤素XIX(43mg)；第590-594份经制备纯化[甲醇-水68:32]得苦皮素C(28mg)和苦皮素P(16mg)；第613-614份经制备纯化[甲醇-水62:38]得苦皮素B(95mg)、苦皮素H(60mg)和苦皮素U(新化合物，9mg)；第679-681份经制备纯化[甲醇-水60:40]得苦皮藤素III(26mg)；第820份经制备纯化[甲醇-水68:32]得苦皮素J(29mg)。
苦皮素X、苦皮藤素IV和苦皮藤素VII数据见[吴文君.植物杀虫剂苦皮藤素研究与应用[M].化学工业出版社,2010]。
（3）苦皮藤根皮药材中主要活性成分的结构及核磁共振碳谱数据
Figure BDA00002017241600131
苦皮素A:R1=R4=OiBu,R2=R5=H,R3=OBz,R6=OH,R7=OAc
苦皮素B:R1=R5=OiBu,R2=OFu,R3=R4=H,R6=R7=OAc
苦皮素C:R1=R5=OiBu,R2=OBu,R3=R4=H,R6=R7=OAc
苦皮素E:R1=OiPet,R2=R5=H，R3=OBz,R4=OiBu,R6=OH,R7=OAc
苦皮素F:R1=R6=R7=OAc,R2=R5=OFu,R3=R4=H
苦皮素G:R1=R6=R7=OAc,R2=OFu,R3=R4=H,R5=OiBu
苦皮素H:R1=R7=OAc,R2=R5=H，R3=OBz,R4=OiBu,R6=OH
苦皮素J:R1=R5=R6=R7=OAc,R2=R4=H,R3=OBz
苦皮素P:R1=OiPet,R2=OBu,R3=R4=H,R5=OiBu,R6=R7=OAc
苦皮素U:R1=R7=OAc,R2=R5=H,R3=OBz,R4=OiPet,R6=OH
苦皮素X:R1=R7=OAc,R2=R5=H,R3=OBz,R4=OiBu,R6=OH
Celangulatin C:R1=OiBu,R2=R5=H,R3=OBz,R4=R7=OAc,R6=OH
苦皮藤素Ⅲ:R1=OiBu,R2=R4=H,R3=OBz,R5=R6=R7=OAc
苦皮藤素IV:R1=OiBu,R2=R5=OFu,R3=R4=H,R6=R7=OAc
苦皮藤素VII:R1=OiBu,R2=OBz,R3=R4=H,R5=OFu,R6=R7=OAc
苦皮藤素XIX:R1=OiBu,R2=R5=H,R3=OBz,R4=OFu,R6=OH,R7=OAc
Figure BDA00002017241600141
苦皮素A
13C NMR(100MHz,CDCl3)δC:75.01(C-1)，67.26(C-2),41.15(C-3),72.13(C-4)，91.41(C-5)，76.89(C-6)，53.51(C-7)，73.69(C-8)，75.28(C-9)，50.52(C-10),84.54(C-11),30.05(C-12)，26.35(C-13)，24.14(C-14)，61.69(C-15)
OAC:169.49,169.60，20.50，21.13
OiBu:175.82,176.77,34.09,34.31,18.46,18.66,19.06,19.14
OBz:165.67,129.26,129.44,128.63,133.45
苦皮素B
13C NMR(100MHz,CDCl3)δC:70.63(C-1)，67.96(C-2),42.00(C-3),69.84(C-4)，91.33(C-5)，75.39(C-6)，52.97(C-7)，76.05(C-8)，71.44(C-9)，53.87(C-10),83.44(C-11),29.59(C-12)，25.45(C-13)，24.47(C-14)，65.45(C-15)
OAC:169.54,169.66,169.79,20.55,21.12,21.48
OiBu:175.74,176.90,33.95,34.10,18.73,18.99,19.00,19.06
OFu:160.91,148.99,117.81,109.69,144.00
苦皮素C
13C NMR(100MHz,CDCl3)δC:70.86(C-1),67.98(C-2),42.04(C-3),69.88(C-4)，91.42(C-5),75.48(C-6),53.04(C-7),76.19(C-8),72.03(C-9),54.10(C-10),83.54(C-11),29.61(C-12),25.66(C-13),24.50(C-14),65.55(C-15);
OAC:169.44,169.57,169.26,20.38,21.13*,21.50*(-CH3)(*归属可互换)
OiBu:175.77,176.95,33.98,34.12,18.78,18.91,19.04,19.08
OBz:164.52,128.31,130.18,128.47,133.87
苦皮素E
13C NMR(100MHz,CDCl3)δC:75.09(C-1)，67.31(C-2),41.21(C-3),72.15(C-4)，91.49(C-5)，76.92(C-6)，53.53(C-7)，73.80(C-8)，75.23(C-9)，50.49(C-10),84.54(C-11),30.08(C-12)，26.31(C-13)，24.06(C-14)，61.68(C-15)
OAC:169.55,169.46,20.48,21.13
OiBu:175.72,34.11,18.48,18.64
OiPet:176.19,41.56,26.59,11.69,16.92
OBz:165.68,129.36,129.49,128.61,133.42
苦皮素F
13C NMR(100MHz,CDCl3)δC:70.53(C-1)，67.80(C-2),41.93(C-3),69.90(C-4)，91.31(C-5)，75.34(C-6)，53.80(C-7)，76.54(C-8)，71.65(C-9)，54.33(C-10),83.12(C-11),25.55(C-12)，29.51(C-13)，24.32(C-14)，65.56(C-15)
OAC:169.51,169.75,169.86,170.52,20.47,21.13,21.52,21.11
OFu:161.61,160.53,148.69,148.87,118.84,118.05,109.96,109.78,144.01,144.01
苦皮素G
13C NMR(100MHz,CDCl3)δC:70.49(C-1)，67.82(C-2),41.92(C-3),69.81(C-4)，91.51(C-5)，75.00(C-6)，53.34(C-7)，76.10(C-8)，72.65(C-9)，53.97(C-10),83.27(C-11),29.45(C-123)，25.48(C-13)，24.35(C-14)，65.67(C-15)
OAC:169.47,169.69,169.74,,170.53,20.45,21.14,21.52,21.04
OiBu:175.86,33.92,18.81,18.89
OFu:160.91,148.99,117.83,109.71,144.02
苦皮素H
13C NMR(100MHz,CDCl3)δC:74.89(C-1)，67.31(C-2),41.10(C-3),72.11(C-4)，91.44(C-5)，76.87(C-6)，53.59(C-7)，73.36(C-8)，75.40(C-9)，50.64(C-10),84.52(C-11),30.03(C-123)，26.24(C-132)，24.23(C-14)，61.38(C-15)
OAC:169.39,169.55,170.28,20.49,21.10,21.47
OiBu:175.88,34.02,18.41,18.58
OBz:165.72,129.23,129.40,128.64,133.40
苦皮素J
13C NMR(100MHz,CDCl3)δC:75.96(C-1),67.85(C-2),41.92(C-3),69.68(C-4),91.70(C-5),75.00(C-6),53.25(C-7),69.75(C-8),72.01(C-9),52.90(C-10),82.62(C-11),29.28(C-12),24.34(C-13),24.11(C-14),60.23(C-15)
OAC:169.52,169.71,169.52,169.92,170.47,20.27,20.99*,21.22*,21.46*,21.55(*归属可互换)
OBz:164.69,129.00,129.54,128.74,133.59
苦皮素P
13C NMR(100MHz,CDCl3)：δC：70.94（C-1），68.07（C-2），42.09（C-3），69.92（C-4），91.42（C-5），76.22（C-6），52.98（C-7），75.58（C-8），72.01（C-9），54.08（C-10），83.55（C-11），29.62（C-12），25.63.（C-13），24.55（C-14），65.56（C-15）
OAc：169.52，169.75，169.52，20.40,21.10,21.50
OiBu-8：175.77，33.99，18.84，18.84
OiPet-15：176.55，41.21，26.50，11.67，16.57
OBz：164.52，128.47，130.19,128.34,133.85
苦皮素U
13C NMR(100MHz,CDCl3)δC:74.98(C-1),67.40(C-2),41.19(C-3),72.18(C-4),91.55(C-5),76.92(C-6),53.72(C-7),73.42(C-8),75.29(C-9),50.76(C-10),84.57(C-11),30.13(C-12),26.31(C-13),24.06(C-14),61.48(C-15)
OAC-1:169.55,169.46,169.46,20.53,21.15,21.51
OiPet-8:175.46,41.26,26.23,11.25,16.12
OBz-9:165.75,129.37,129.47,128.68,133.46
苦皮素X
13C NMR(100MHz,CDCl3)δC:75.0(C-1)，67.5(C-2),41.3(C-3),72.2(C-4)，91.6(C-5)，76.7(C-6)，53.8(C-7)，73.5(C-8)，75.5(C-9)，50.8(C-10),84.6(C-11),30.1(C-12)，26.3(C-13)，24.3(C-14)，61.5(C-15)
OAC:169.4,169.5，170.2，20.5，21.0,21.5
OiBu:175.9,34.1,18.5,18.6
OBz:165.8,129.5,129.5,128.7,133.4
Celangulatin C（苦皮藤素C）
13C NMR(100MHz,CDCl3)δC：75.07（C-1），67.31（C-2），41.19（C-3），72.14（C-4），91.45（C-5），76.90（C-6），53.48（C-7），74.17（C-8），75.34（C-9），50.64（C-10），84.58（C-11），30.05（C-12），26.28（C-13），24.20（C-14），61.73（C-15）
OAC:169.44,169.54,169.95,20.44,21.10,20.82
OiBu：176.72，34.34，19.05，19.12
OBz：165.63，129.49，129.28,129.66,133.47
苦皮藤素Ⅲ
13C NMR(100MHz,CDCl3)δC:75.84(C-1),67.83(C-2),42.02(C-3),69.73(C-4),91.57(C-5),75.39(C-6),53.27(C-7),69.84(C-8),71.95(C-9),53.05(C-10),82.47(C-11),29.27(C-12),24.45(C-13),24.27(C-14),60.74(C-15)
OAC:169.59*,169.59*,169.59*,170.07*,20.30,20.93**,21.23**,21.50**(*,**归属可互换)
OiBu-15:177.29,33.92,19.12,19.32
OBz-9:164.58,129.07,129.50,128.73,133.59
苦皮藤素IV
13C NMR(100MHz,CDCl3)δC:70.3*(C-1,)，70.6*(C-2),42.0(C-3),69.9(C-4)，91.4(C-5)，75.6*(C-6)，53.6(C-7)，76.1*(C-8)，68.0*(C-9)，54.4(C-10),83.4(C-11),29.6(C-12)，25.5(C-13)，24.4(C-14)，65.0(C-15)(*归属可互换)
OAC:169.6×3,20.5,21.0,21.4
OiBu:176.7,34.0,18.8,18.9
OFu:161.3,160.6,148.9,148.7,118.8,118.1,109.8,109.7,143.9×2
苦皮藤素VII
13C NMR(150MHz,CDCl3)δC:70.76(C-1,)，67.33(C-2),42.01(C-3),69.89(C-4)，91.32(C-5)，75.62(C-6)，53.54(C-7)，76.18(C-8)，70.92(C-9)，54.48(C-10),83.43(C-11),29.60(C-12)，25.63(C-13)，24.34(C-14)，65.18(C-15)
OAC:169.36,169.61,169.66,20.33,21.00,21.37
OiBu:176.75,33.86,18.82,18.88
OBz:164.18,129.58,130.17,128.38,133.69
OFu:161.31,148.64,118.77,109.81,143.88
苦皮藤素XIX
13C NMR(100MHz,CDCl3)δC:75.08(C-1),67.37(C-2),41.28(C-3),72.17(C-4),91.51(C-5),76.84(C-6),53.39(C-7),74.71(C-8),75.08(C-9),50.06(C-10),84.57(C-11),30.05(C-12),26.31(C-13),24.23(C-14),61.76(C-15)
OAC:169.47*,169.59*,20.43,21.15(*归属可互换)
OiBu-15:176.74,34.37,19.15,19.15
OBz-9:165.74,129.27,129.46,128.62,133.44
OFu-8:161.86,148.25,118.65,109.59,143.87
实施例1：安徽毫州苦皮藤根皮药材IGD核磁共振碳谱偶联指纹图谱
（1）特征提取物制备
选择安徽毫州的苦皮藤根皮药材，按下述方法制备苦皮藤根皮药材特征提取物：称取阴干的苦皮藤根和皮100g，粉碎（过24目筛），用每次6倍量体积（600mL）、质量浓度为95%的乙醇回流提取3次，每次提取2小时，滤液合并后减压浓缩，回收溶剂至粉末，即得苦皮藤根皮药材特征提取物。
（2）药材特征提取物IGD核磁共振碳谱测试
取苦皮藤根皮药材特征提取物1g，加入六倍量（6mL）氯仿，80℃下回流提取20min，过滤后减压浓缩，回收溶剂至干。溶于0.5mL CDCl3中，作IGD核磁共振碳谱。
（3）IGD核磁共振碳谱指纹图谱解析
1）鉴别
安徽毫州产苦皮藤根、皮特征提取物的IGD核磁共振碳谱指纹图谱中，清楚地显示4-OH-β-二氢沉香呋喃倍半萜多醇酯类化合物的特征信号。根据其母核信号及其C-15特征峰信号的化学位移，确证12个4-OH-β-二氢沉香呋喃倍半萜多醇酯类化合物苦皮素A、B、C、E、F、G、J、P、celangulatin C、苦皮藤素IV、VII、XIX在IGD核磁共振碳谱指纹图谱中均有相应的NMR信号。IGD核磁共振碳谱指纹图谱图1-a所示，其特征峰局部拉宽放大图如图1-b所示。
2）安徽毫州苦皮藤根皮药材特征提取物各活性成分比例测定结果如下：
Figure BDA00002017241600201
（4）安徽毫州苦皮藤根皮药材苦皮素B浓度含量测定结果如下：
 称取根皮药材质量   100g
 苦皮藤根皮药材特征提取物总质量m药材′   18.0g
 称取特征提取物质量   200mg
  特征提取物中苦皮素B质量浓度   39.20ug/mL
  特征提取物中苦皮素B质量百分含量   1.96%
  根皮药材中苦皮素B质量百分含量   3.52‰
（5）安徽毫州苦皮藤根皮药材中活性成分含量测定结果如下：
Figure BDA00002017241600211
实施例2：陕西宝鸡苦皮藤根皮药材IGD核磁共振碳谱偶联指纹图谱
（1）特征提取物制备
与实施例1不同之处在于选用陕西宝鸡苦皮藤根皮药材，其他完全相同。
（2）特征提取物IGD核磁共振碳谱测试
与实施例1相同。
（3）IGD核磁共振碳谱指纹图谱解析
1）鉴别
陕西宝鸡产苦皮藤根、皮特征提取物的IGD核磁共振碳谱指纹图谱中，清楚地显示4-OH-β-二氢沉香呋喃倍半萜多醇酯类化合物的特征信号。根据其母核信号及其C-15特征峰信号的化学位移，确证15个4-OH-β-二氢沉香呋喃倍半萜多醇酯类化合物苦皮素A、B、C、E、F、G、H、J、P、U、X、celangulatin C、苦皮藤素III、IV、VII在IGD核磁共振碳谱指纹图谱中均有相应的NMR信号。IGD核磁共振碳谱指纹图谱如图2-a所示，其特征峰局部拉宽放大图如图2-b所示。
2）陕西宝鸡苦皮藤根皮药材特征提取物各活性成分比例测定结果如下：
Figure BDA00002017241600221
（4）陕西宝鸡苦皮藤根皮药材苦皮素B浓度含量测定结果如下：
  称取根皮药材质量   200g
  药材特征提取物总质量m药材′   30.8g
  称取特征提取物质量   200mg
  特征提取物中苦皮素B质量浓度   19.57ug/mL
  特征提取物中苦皮素B质量百分含量   0.98%
  药材中苦皮素B质量百分含量   1.51‰
（5）陕西宝鸡苦皮藤根皮药材中活性成分测定结果如下：
实施例3：湖北恩施苦皮藤根皮药材IGD核磁共振碳谱偶联指纹图谱
（1）药材特征提取物制备
选择湖北恩施的苦皮藤根皮药材，按下述方法制备苦皮藤素药材特征提取物：称取阴干的苦皮藤根和皮200g，粉碎（过10目筛），用每次10倍量体积（2000mL）、质量浓度为90%的乙醇回流提取2次，每次1提取小时，滤液合并后减压浓缩，回收溶剂至粉末，即得苦皮藤根皮药材特征提取物。
（2）药材特征提取物IGD核磁共振碳谱测试
取苦皮藤根皮药材特征提取物2g，加入10倍量（20mL）氯仿，60℃下回流提取40min，过滤后减压浓缩，回收溶剂至干。溶于0.5mLCDCl3中，作IGD 13C NMR。
（3）IGD核磁共振碳谱指纹图谱解析
1）鉴别
湖北恩施产苦皮藤根、皮特征提取物的IGD核磁共振谭坡指纹图谱中，清楚地显示4-OH-β-二氢沉香呋喃倍半萜多醇酯类化合物的特征信号。根据其母核信号及其C-15特征峰信号的化学位移，确证12个4-OH-β-二氢沉香呋喃倍半萜多醇酯类化合物苦皮素A、B、C、E、F、G、H、J、P、celangulatin C、苦皮藤素III、IV在IGD核磁共振碳谱指纹图谱中均有相应的NMR信号。IGD核磁共振碳谱指纹图谱如图3-a所示，其特征峰局部拉宽放大图如图3-b所示。
2）湖北恩施苦皮藤根皮药材特征提取物各活性成分比例测定结果如下：
Figure BDA00002017241600241
（4）湖北恩施苦皮藤根皮药材苦皮素B浓度含量测定结果如下：
  称取根皮药材质量   200g
  药材特征提取物总质量m药材′   41.8g
  称取特征提取物质量   200mg
  特征提取物中苦皮素B质量浓度   20.88ug/mL
  特征提取物中苦皮素B质量百分含量   1.04%
  药材中苦皮素B质量百分含量   2.18‰
（5）湖北恩施苦皮藤根皮药材中活性成分含量测定结果如下：
Figure BDA00002017241600242
Figure BDA00002017241600251
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种鉴别苦皮藤根皮药材的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）对苦皮藤根皮药材进行提取，得到含有活性成分组的苦皮藤根皮药材特征提取物；
2）对所述苦皮藤根皮药材特征提取物进行IGD核磁共振碳谱指纹图谱检测，根据指纹图谱得到所述苦皮藤根皮药材特征提取物中若干个活性成分特征峰峰强度；并用相同方式测定出所述各活性成分相应的标准参照品的特征峰峰强度；
3）通过定量分析手段测定得到苦皮藤根皮药材中所述标准参照品的绝对含量；
4）利用各活性成分特征峰峰强度及相应标准参照品特征峰峰强度的比值和所述绝对含量，计算出苦皮藤根皮药材中各活性成分的含量及活性成分组的含量。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1）中，苦皮藤根皮药材特征提取物的制备方法，包括：称取苦皮藤根或/和皮，粉碎，用6~10倍量90~95%的乙醇回流提取2~3次，滤液合并后减压浓缩，回收溶剂至粉末，即得苦皮藤根皮药材特征提取物。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤2）在对苦皮藤根皮药材特征提取物进行IGD核磁共振碳谱指纹图谱检测前，进行处理的方式包括：取苦皮藤根皮药材特征提取物，加入6~10倍量氯仿，60~80℃下回流提取20~40min，过滤后减压浓缩，回收溶剂至干。
4.根据权利要求1~3任意一项所述的方法，其特征在于，步骤2）中，所述苦皮藤根皮药材特征提取物中的活性成分特征峰为：C-15吸收峰，其化学位移为δC 60.0~66.0。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2）中所述 峰强度，采用峰高法、面积积分法或重量法计算。
6.根据权利要求1~4任意一项所述的方法，其特征在于，步骤3）中所述标准参照品的绝对含量是指：用定量分析手段测定的苦皮藤根皮药材中标准参照品的质量百分含量。
7.根据权利要求1或6所述的方法，其特征在于，步骤3）中，所述定量分析手段为高效液相法。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述高效液相法的条件为：色谱柱以十八烷基键合硅胶为填料，流动相为乙腈:水＝(60:40)~(55:45)的混合溶剂，检测波长为242nm。
9.根据权利要求1~8任意一项所述的方法，其特征在于，步骤4）中，计算各活性成分含量的偶联公式为：
Figure FDA00002017241500021
其中：
W1为步骤3）用定量分析手段测定的苦皮藤根皮药材中某一活性成分对应的标准参照品的绝对含量；
M1为所述某一活性成分对应的标准参照品的分子量；
h1为由IGD核磁共振碳谱指纹图谱测定的苦皮藤根皮药材特征提取物中所述某一活性成分对应的标准参照品的特征峰峰强度；
Wn为苦皮藤根皮药材中某一活性成分的质量百分含量；
Mn为某一活性成分的分子量；
hn为由IGD核磁共振碳谱指纹图谱测定的苦皮藤根皮药材特征提取物中某一活性成分的特征峰峰强度。
10.根据权利要求1~9任意一项所述的方法，其特征在于，所述标准参照品为苦皮素B。
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