CN103808750B - 一种鉴别藜芦药材的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种鉴别藜芦药材的方法，包括：对藜芦药材进行提取，得到含有活性成分组的藜芦药材特征提取物；对特征提取物进行IGD核磁共振碳谱指纹图谱检测，根据指纹图谱得到特征提取物中若干个活性成分特征峰峰强度；并用相同方式测定出各活性成分相应的标准参照品的特征峰峰强度；通过定量分析手段测定得到藜芦药材中标准参照品的绝对含量；利用特征峰峰强度的比值和所述标准参照品的绝对含量，计算出藜芦药材中各活性成分的含量及活性成分组含量。本发明利用IGD核磁共振碳谱偶联指纹图谱技术，反映藜芦药材中含有的化合物及其间比例，完成对藜芦药材品种和质量的鉴定。
Description
技术领域
本发明属于天然药用植物的鉴别领域，具体地，涉及一种鉴别藜芦药材的方法。
背景技术
藜芦（Veratrumnigrum）亦叫黑藜芦、山葱等，系百合科藜芦属多年生草本植物，始载于本草纲目，产于东北、河北、山东、河南、山西、陕西、内蒙古、甘肃等省。中医用天目黎芦、毛叶黎芦、蒙自黎芦、狭叶黎芦、大理黎芦、毛穗黎芦、兴安黎芦、黑紫黎芦等的根、根茎入药，藜芦因其分布范围广为药用主要品种。藜芦归胃、肺、肝经，性寒，味辛、苦，用于治疗中风痰壅、癫痫、淋巴管炎、虐疾、乳腺炎、骨折、跌打损伤、头癣、疥疮等症，还可用于灭蛆、蝇等[①中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志.科学出版社，2004,45(1):21.②中华本草.科学出版社，1999.]。研究证明藜芦根、根茎中所含的主要活性成分为异胆甾烷型和胆甾烷型生物碱。
藜芦的活性成分具有多样性、复杂性等特点，而且因产地、气候、光照等自然条件差异或提取溶剂的不同，活性成分的含量会有所变化。因此，在鉴别和评价藜芦药材及其产品过程中，仅仅采用某种单一分析检测手段[如高效液相色谱法(HPLC）]测定其中某一种主要活性成分[①丛悦,等.河南大学学报(医学版)2008年,第04期;②张盛，等.色谱2008,26(1):56.]，这种模式不能全面、综合地反映藜芦药材及其产品之间的质量差异，当然也不能全面评价藜芦药材及其产品的好坏。指纹图谱技术己成为国际公认的区别评价植物天然产物及其原料的最有效的手段[周玉新.中药指纹图谱研究技术.北京：化学工业出版社，2002]。
IGD核磁共振碳谱偶联指纹图谱技术，也叫反门控去偶核磁共振碳谱（IGD13CNMR）偶联（coupling）指纹图谱技术，是在已研究多年的核磁共振氢谱（1HNMR）指纹图谱技术[赵天增，等.1HNMR指纹法鉴定植物中药.中草药2000，31(11)：868-870]的基础上联合其他技术（例如目前应用最广泛的高效液相（HPLC）指纹图谱技术[谢培山等.中药色谱指纹图谱.人民卫生出版社，2005]）提出的一种新的非单一手段综合指纹图谱技术。目前为止，并未见在鉴别藜芦药材方面运用IGD核磁共振碳谱偶联指纹图谱技术的报道。
因此，若能对藜芦药材进行IGD核磁共振碳谱偶联指纹图谱技术研究与应用，不仅可以解决我国藜芦药材鉴别和评价的难题，也为加强藜芦药材内在成分研究的系统化与标准化提供了科学的保证。随着该技术在其他中药材及其提取物、植物源农药中的推广应用，该技术的重大科学价值必将日趋突出。
发明内容
为了解决现有技术的问题，本发明的目的在于提供一种鉴别藜芦药材的方法，该方法利用了IGD核磁共振碳谱偶联指纹图谱技术。
为了实现上述目的，本发明提供的鉴别藜芦药材的方法，包括以下步骤：
1）对藜芦药材进行提取，得到含有活性成分组的藜芦药材特征提取物；
2）对所述藜芦药材特征提取物进行IGD核磁共振碳谱指纹图谱检测，根据指纹图谱得到所述藜芦药材特征提取物中若干个活性成分特征峰峰强度；并用相同方式（IGD核磁共振碳谱指纹图谱）测定出所述各活性成分相应的标准参照品的特征峰峰强度；
3）通过定量分析手段测定得到藜芦药材中所述标准参照品的绝对含量；
4）利用所述特征峰峰强度（各活性成分特征峰峰强度及相应标准参照品的特征峰峰强度）的比值和所述标准参照品的绝对含量，计算出藜芦药材中各活性成分的含量及该类活性成分的总含量，即活性成分组的含量。
其中，采用具有获得清晰IGD核磁共振碳谱指纹图谱的提取工艺作为所述藜芦药材特征提取物的提取方式。
其中，步骤1）中，藜芦药材特征提取物的制备方法，包括：称取藜芦药材，进行粉碎，用90～95%的乙醇回流提取2～3次，滤液合并后减压浓缩，回收溶剂至无醇味，即得藜芦药材特征提取物。
进一步地，用乙醇回流提取，每次提取1～2小时。
进一步地，所述藜芦药材与90～95%乙醇的质量体积比（g：mL）为1：（6～10）。
进一步地，藜芦药材粉碎后过10～24目筛。
其中，步骤2）中，在对藜芦药材特征提取物进行IGD核磁共振碳谱指纹图谱检测前，可以进行适当处理，具体方式包括：取藜芦药材特征提取物，分散到pH为1.0～3.5的酸水中，过滤后，用氯仿萃取，酸化层用氨水调pH至9～11，用氯仿萃取后，氯仿层回收溶剂至干。溶于CDCl3（氘代氯仿）中，之后即可以做IGD核磁共振碳谱指纹图谱检测。
其中，步骤2）中，藜芦药材特征提取物的特征峰为δC66.0～72.0的脂环连氧碳、δC168.0～176.0的酯羰基碳、δC206.0～208.0的酮羰基碳。
其中，步骤2）中，根据特征峰峰强度的大小和位置，对藜芦药材特征提取物中若干个活性成分进行排序。
进一步地，步骤2）中，根据特征峰峰强度的大小和位置，对藜芦药材特征提取物中的活性成分：Veratramine、epi-rubijervine、Jervine、SOLANIDINE、Veramarine、deacetylprotoveratrineB、cevadine、Isoverazine、Clyclopamine、Germidine、Isojurubidine、Dihydroleptinidine、germerine、zygacine、Pesudojervine、3-epi-Jervine、veramanine、etioline进行排序。
其中，步骤2）中所述峰强度，可以采用峰高法、面积积分法或重量法计算。
其中，步骤3）中所述标准参照品的绝对含量是指：用定量分析手段测定的藜芦药材中标准参照品的质量百分含量。
其中，步骤3）中，所述定量分析手段为：高效液相（HPLC法）。
进一步地，所述高效液相法的条件包括：流动相为乙腈/水。
其中，所述标准参照品为Veratramine（藜芦胺碱）。
本发明主要测定的是藜芦药材中生物碱类化合物的含量。
其中，步骤4）中，计算各活性成分的含量的偶联公式为：
W1为步骤3）用定量分析手段测定的藜芦药材中某一活性成分对应的标准参照品的绝对含量；
M1为所述某一活性成分对应的标准参照品的分子量/定量峰对应的碳个数；
h1为由IGD核磁共振碳谱指纹图谱测定的藜芦药材特征提取物中所述某一活性成分对应的标准参照品的特征峰峰强度；
Wn为藜芦药材中某一活性成分的质量百分含量；
Mn为某一活性成分的分子量/定量峰对应的碳个数；
hn为由IGD核磁共振碳谱指纹图谱测定的藜芦药材特征提取物中某一活性成分的特征峰峰强度；该类活性成分的总含量就是同类的各活性成分的Wn相加之和，即活性成分组的含量。
上述公式的推导过程为：
本发明方法所述活性成分组，是藜芦单味种子药材中的活性成分组。
本发明中的藜芦药材，是指藜芦植物的根、根茎部位。
本发明各活性成分的含量及该类活性成分的总含量的计算，是通过偶联公式将IGD核磁共振碳谱和分析定量手段偶联。和现有技术相比，本发明采用IGD13CNMR偶联指纹图谱具有下面几个特点：
①稳定性（重复性）：IGD13CNMR得到的化学位移数据为小数点后第二位，分辩性好，重复性好；HPLC、GC的非色谱条件（如色谱柱内径、长度、固定相牌号、载体粒度、流动相流速、混合流动相各组分比例、柱温、进样量、检测器灵敏度等）改变等，得到的保留时间数据变化很大，意味着整体色谱图形的变异，重复性不好。
②整体性（全面性）：IGD13CNMR指纹图谱中包含样品中的每一个活性成分碳的相应谱峰；HPLC、GC、UV、IR、MS不存在这种关系。
③可靠性（单一性）：IGD13CNMR谱峰与样品中不同活性成分及其不同基团上的碳是严格的一一对应关系；HPLC、GC、UV、IR、MS不存在这种关系。
④可行性（易辨性）：IGD13CNMR指纹图谱规律性很强，一般情况下，可归属图谱中的每一个碳峰；HPLC、GC需要对照品；IR不易解析；UV信息量少；MS则有离子化程度和基质干扰等问题。
本发明的优势在于：
1、本发明中的四个步骤是一个整体，缺一不可；四个步骤都有各自的独到之处；如若分开或简单组合则不能检测药用植物中复杂成分的比例和含量。
众所周知，虽然中药、植物源农药是历史悠久的药物，但其分析检测一直是个难题。因此，特别需要一种方法能够鉴别植物品种及其提取物中的各种活性成分，并且将其定量，然后选择出最好的提取物成分或其组合物，以便充分发挥其效果。另外，中药、植物源农药走出国门的障碍之一是没有组成成分及其定量标识，原因即为目前现有技术解决鉴别植物品种和评价植物源产品质量的定性和定量分析方面存在着很大的局限性（具体见本申请背景技术描述的内容）。事实证明，IGD核磁共振碳谱偶联指纹图谱技术正是解决这个问题的关键技术，这些在本申请说明书中已体现出来。
2、虽然常规提取工艺为普通技术人员所熟知，但却从未有人将得到清晰图谱和具有代表性的活性成分组作为标准来选择工艺参数得到特征提取物。利用此方法，会使最终对于提取物的鉴别效果更好，这是本发明的难点之一，也是本发明的创新点之一。
3、IGD13CNMR偶联指纹图谱是多个活性成分的混合谱，不可避免会引起一根根棒峰的拥挤，甚至重叠。为了使计算结果准确，选择化学位移差别较大的活性成分组中各活性成分碳峰指定特征峰是必要的。由于不同类型化合物碳谱差别很大，特征峰的选择可以千变万化；相同类型化合物碳谱差别很小，很多谱峰重叠严重，需有深厚的核磁共振波谱知识指导，经多方比较、反复考虑，才能选择较好的特征峰；而特征峰选择不好，是没有办法对活性成分组进行准确定量分析的，这也正是本发明需要解决的问题。根据藜芦中生物碱类成分的特点，选择δC66.0～72.0脂环连氧碳、δC168.0～176.0酯羰基碳、δC206.0～208.0酮羰基碳吸收峰作为特征峰区别该类成分。所以，根据不同活性成分的特点需要选择不同的活性成分碳峰指定特征峰也是本申请的又一创新点。
4、由于特征峰化学位移差别很小，很多情况下，仅在小数点后第1位差别，所以特征峰的排序是确定主要活性成分及其比例的关键，没有深厚的核磁共振波谱知识和分离基础，很难确定特征峰代表的活性成分及其比例，也就无法对活性成分组进行准确定性定量分析，根据藜芦中生物碱类成分的碳谱核磁数据的特点，对该类成分（Veratramine、epi-rubijervine、Jervine、SOLANIDINE、Veramarine、deacetylprotoveratrineB、cevadine、Isoverazine、Clyclopamine、Germidine、Isojurubidine、Dihydroleptinidine、germerine、zygacine、Pesudojervine、3-epi-Jervine、veramanine、etioline）的特征峰进行了准确排序；这是本发明的难点之一，也是本发明的创新点之一。
5、偶联计算关键是选择标准品和定量分析技术的选择。分析定量手段可以选择高效液相、气相色谱、薄层色谱法和称量法等，标准参照品可以是某一活性成分作为内标，也可以是外加参照品作为外标。根据藜芦中生物碱类成分的特点，分析定量手段选择的为液相，标准参照品选择的是Veratramine（藜芦胺碱）。这是本发明的难点之一，也是本发明的创新点之一。
本发明针对藜芦活性成分的多样性、复杂性及高效液相色谱指纹图谱和核磁共振氢谱（1HNMR）指纹图谱的局限性，构建IGD核磁共振碳谱偶联指纹图谱技术，反映藜芦中含有哪些甾体生物碱类化合物以及它们之间的比例，达到对藜芦药材品种和质量的鉴定的目的，准确性和稳定性、重复性和可行性与现有技术相比有很大的提高。
附图说明
图1-a为实施例1市售藜芦药材A藜芦碱特征提取物的IGD核磁共振碳谱指纹图谱。
图1-b和1-c为实施例1市售藜芦药材A藜芦碱特征提取物的IGD核磁共振碳谱指纹图谱特征峰局部拉宽放大图。
图2-a为实施例2市售藜芦药材B藜芦碱特征提取物的IGD核磁共振碳谱指纹图谱。
图2-b和2-c为实施例2市售藜芦药材B藜芦碱特征提取物的IGD核磁共振碳谱指纹图谱特征峰局部拉宽放大图。
图3-a为实施例3市售藜芦药材C藜芦碱特征提取物的IGD核磁共振碳谱指纹图谱。
图3-b和3-c为实施例3市售藜芦药材C特征提取物的IGD核磁共振碳谱指纹图谱特征峰局部拉宽放大图。
图4-a为实施例4市售藜芦药材D藜芦碱特征提取物的IGD核磁共振碳谱指纹图谱。
图4-b和4-c为实施例4市售藜芦药材D特征提取物的IGD核磁共振碳谱指纹图谱特征峰局部拉宽放大图。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步地详细描述，但本发明的保护范围并不局限于此。
若未特别指明，本发明中使用的物料均为本领域的常规物料，未提及的操作均为本领域的常规操作。
本发明中，乙醇的百分浓度均为体积百分数。
1、藜芦药材IGD核磁共振碳谱偶联指纹图谱研究步骤
（1）特征提取物获取程序研究
取阴干的藜芦药材100～200g，粉碎后过10～24目筛，用6～10体积倍量、体积比为90～95%的乙醇回流提取2～3次，每次提取1～2小时，滤液合并后减压浓缩，回收溶剂至无醇味，即得藜芦药材特征提取物（CharacterExtract，CE）。准确称量得到的CE质量m药材'。
（2）特征提取物IGD核磁共振碳谱指纹图谱检测
取藜芦药材特征提取物1～2g，分散到pH约为1.0-2.0酸水中，过滤后，用氯仿萃取，酸化层用氨水调pH至9～11左右，用氯仿萃取后，氯仿层回收溶剂至干。取该样品65mg，溶于0.5mLCDCl3中，作IGD核磁共振碳谱检测，即得到IGD核磁共振碳谱指纹图谱。
（3）特征提取物IGD核磁共振碳谱指纹图谱解析
1）鉴别
特征提取物IGD核磁共振碳谱指纹图谱中，应清楚地显示甾体生物碱类化合物的特征信号。
2）各活性成分特征峰选取
根据不同活性成分的特点需要选择不同的活性成分碳峰指定特征峰。选择原则如下：①同类化合物的指定特征峰最好为各个化合物位置相同的碳碳峰；②每个化合物的指定特征峰与其他碳峰之间化学位移差别较大；③各个化合物的指定特征峰之间化学位移差别较大；④影响各个化合物的指定特征峰本身的化学位移效应差别较大。
由于特征提取物中含有一系列活性成分甾体生物碱类化合物，碳峰交叉得较多，为了测定各活性成分的比例，必须选择化学位移差别较大且易识别的相应峰作为特征峰。经实际考察，分别选择连氧酯环碳、酯羰基碳、酮羰基碳峰作为不同生物碱活性成分碳峰指定特征峰：Veratramine+epi-rubijervine+Jervine+SOLANIDINE、Veramarine+deacetylprotoveratrineB、cevadine+Isoverazine+Clyclopamine、cevadine+Isoverazine+Clyclopamine、veratramine的区别选择脂环连氧碳，其化学位移为δC66.0～72.0左右；Germerine、zygacine、cevadine的区别选择酯羰基碳，其化学位移为δC168.0～176.0左右；Pesudojervine+3-epi-Jervine、Jervine、veramanine的区别选择酮羰基碳，其化学位移为δC206.0～208.0左右。
3）标准参照品的选择
藜芦胺碱(veratramine)是藜芦的主要活性成分之一，其特征峰的化学位移为δC61.7左右，与其他主要活性成分特征峰在此没有重叠。因此，选择Veratramine作为标准参照品。
（4）采用HPLC测定藜芦药材中Veratramine的含量
1）HPLC检测
①色谱条件
仪器：岛津LC-20AT
流动相：乙腈/水
色谱柱:AgilentC18（安捷伦十八烷基键合硅胶）4.6*250mm
②标准参照品溶液的配制
精确称取Veratramine5mg，置50mL容量瓶中，用甲醇溶解稀释至刻度，摇匀后即得标准参照品溶液（Veratramine100μg/mL）。
③标准曲线和检出限
浓度范围：1-200μg/mL（ppm）；标准参照品浓度分别为：1μg/mL、5μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL。
④供试品溶液的制备
准确称取藜芦药材特征提取物200mg于100mL容量瓶中，加适量甲醇溶解，超声振荡后稀释至刻度，摇匀后即得藜芦药材特征提取物供试品溶液。
⑤精密度测定
供试品溶液重复进样3次，峰面积相对标准偏差RSD=1.32%，保留时间相对标准偏差RSD=0.26%。
⑥供试品的测定
吸取各供试品溶液，进样，测其峰面积，求得Veratramine含量。
2）Veratramine绝对含量计算
①由下式计算供试品溶液中Veratramine质量浓度：
CX：藜芦药材特征提取物供试品溶液中Veratramine质量浓度（ug/mL）；
CR：标准参照品溶液Veratramine质量浓度（ug/mL）；
AX：由HPLC测定的藜芦药材特征提取物供试品溶液中Veratramine峰面积；
AR：由HPLC测定的标准参照品溶液Veratramine峰面积。
②由下式计算藜芦药材特征提取物中Veratramine质量百分含量：
W'Veratramine(%)：藜芦药材特征提取物中Veratramine质量百分含量；
CX：藜芦药材特征提取物供试品溶液中Veratramine质量浓度（ug/mL）；
m供试品：称取的藜芦药材特征提取物供试品溶液质量(mg)。
③由下式计算藜芦药材中Veratramine质量百分含量：
WVeratramine（%）：藜芦药材中Veratramine质量百分含量（标准参照品的绝对含量）；
W'Veratramine(%)：藜芦药材特征提取物中Veratramine质量百分含量；
m药材'：得到的藜芦药材特征提取物的总质量(mg)；
m：称取的藜芦药材的质量(mg)。
（5）通过偶联公式计算藜芦根皮药材中主要活性成分含量及总量
Wn：藜芦药材中其他某一活性成分质量百分含量；
W1：藜芦药材中Veratramine质量百分含量（标准参照品的绝对含量），即WVeratramine（%）；
M1：Veratramine（标准参照品）分子量/定量峰对应的碳个数；
h1：由IGD核磁共振碳谱指纹图谱测定的藜芦药材特征提取物中Veratramine（标准参照品）特征峰峰强度；
Mn：其他某一活性成分分子量/定量峰对应的碳个数；
hn：由IGD核磁共振碳谱指纹图谱测定的藜芦药材特征提取物中其他某一活性成分特征峰峰强度。
2、仪器、试剂与材料
主要仪器和设备
核磁共振波谱仪BrukerDPX400型。
质谱仪：WatersMicromass公司Q-TofMicroTM型。
半制备高效液相色谱仪：Waters600型。
高效液相色谱仪：Agilent1200型。
2000mL蒸馏烧瓶、5000mL蒸馏烧瓶、球型冷凝管、2000mL分液漏斗。
DE-52AA旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂。
DEF-6020型真空干燥箱：上海精宏实验设备有限公司。
柱层析硅胶G和薄层层析硅胶H：青岛海洋化工厂。
硅胶层析柱6cm×70cm（直径×高度）。
市售藜芦药材A（中原正信公司，2013年6月购自安徽亳州药材市场，产地河南）、市售藜芦药材B（中原正信公司，2013年7月购自安徽亳州药材市场，产地河南）、市售藜芦药材C（中原正信公司，2013年7月购自安徽亳州药材市场，产地河南），均经河南省农业大学朱长山教授鉴定；Veratramine，化学对照品，试验室自制。
试剂：色谱纯（甲醇，天津市四友精细化学品有限公司）及分析纯（天津市化学试剂一厂）。
3、藜芦药材主要活性成分的核磁数据Veratramine（藜芦胺碱）
13CNMR(CDCl3):38.0(C-1),31.3(C-2),71.8(C-3),41.9(C-4),142.4(C-5),122.0(C-6),44.1(C-7),41.2(C-8),56.9(C-9),36.9(C-10),30.3(C-11),140.3(C-12),132.6(C-13),143.9(C-14),119.8(C-15),125.2(C-16),143.0(C-17),15.8(C-18),19.4(C-19),36.1(C-20),19.2(C-21),67.1(C-22),70.8(C-23),30.5(C-24),32.2(C-25),54.0(C-26),18.8(C-27)
SOLANIDINE（龙葵胺）
13CNMR(CDCl3):37.3(C-l),31.6(C-2),71.7(C-3),42.3(C-4),140.8(C-5),121.6(C-6),32.1(C-7),31.6(C-8),50.2(C-9),36.7(C-l0),21.0(C-11),40.0(C-12),40.3(C-13),57.6(C-14),33.3(C-15),69.1(C-16),62.9(C-17),16.8(C-18),19.4(C-19),36.7(C-20),18.1(C-21),74.7(C-22),29.1(C-23),30.9(C-24),31.1(C-25),60.2(C-26),19.4(C-27).
Jervine（介藜芦碱）
13CNMR(CDCl3):36.8(C-1),31.2(C-2),71.7(C-3),41.4(C-4),142.3(C-5),120.9(C-6),30.7(C-7),38.0(C-8),62.5(C-9),37.0(C-10),206.8(C-11),137.2(C-12),145.8(C-13),44.9(C-14),24.3(C-15),31.0(C-16),85.5(C-17),12.1(C-18),18.5(C-19),40.4(C-20),10.8(C-21),66.6(C-22),76.4(C-23),38.9(C-24),31.6(C-25),54.7(C-26),18.8(C-27)
13CNMR(C5D5N):37.8(C-1),31.1(C-2),71.5(C-3),42.7(C-4),143.2(C-5),120.9(C-6),39.7(C-7),39.0(C-8),63.2(C-9),37.8(C-10),206.8(C-11),137.2(C-12),146.4(C-13),45.1(C-14),24.9(C-15),32.2(C-16),85.8(C-17),12.4(C-18),18.9(C-19),41.4(C-20),11.0(C-21),67.6(C-22),71.1(C-23),31.4(C-24),31.8(C-25),55.4(C-26),18.9(C-27)
Cyclopamine(11-deoxojervine)（环巴胺）
13CNMR(C5D5N):38.8(C-1),32.3(C-2),71.4(C-3),43.0(C-4),142.8(C-5),121.5(C-6),39.7(C-7),42.3(C-8),52.5(C-9),36.9(C-10),29.2(C-11),127.7(C-12),142.0(C-13),49.5(C-14),25.2(C-15),32.4(C-16),85.3(C-17),13.6(C-18),19.2(C-19),40.5(C-20),11.3(C-21),67.3(C-22),76.0(C-23),31.5(C-24),31.7(C-25),55.4(C-26),18.8(C-27)
25-Isoverzine（25-异藜芦嗪）
13CNMR(CDCl3):37.5(C-1),31.8(C-2),71.6(C-3),42.5(C-4),141.2(C-5),121.5(C-6),32.0(C-7),32.0(C-8),50.3(C-9),36.6(C-10),21.2(C-11),29.9(C-12),42.5(C-13),45.7(C-14),24.4(C-15),27.7(C-16),53.3(C-17),12.1(C-18),19.4(C-19),47.0(C-20),18.3(C-21),175.8(C-22),26.7(C-23),27.4(C-24),27.4(C-25),56.4(C-26),19.1(C-27)
3-epi-jervine（3-表-介藜芦碱）
13CNMR(CDCl3):38.2(C-1),28.5(C-2),67.5(C-3),30.8(C-4),139.5(C-5),123.0(C-6),31.5(C-7),38.0(C-8),62.8(C-9),33.5(C-10),207.0(C-11),138.5(C-12),146.5(C-13),45.2(C-14),23.9(C-15),33.5(C-16),86.0(C-17),11.6(C-18),17.9(C-19),39.0(C-20),10.9(C-21),66.4(C-22),76.9(C-23),39.5(C-24),31.0(C-25),54.6(C-26),18.8(C-27)
Epi-rubijervine（红介藜芦胺）
13CNMR(CDCl3):37.2(C-1),31.1(C-2),71.7(C-3),42.3(C-4),140.6(C-5),121.7(C-6),31.8(C-7),31.6(C-8),49.1(C-9),36.3(C-10),33.4(C-11),72.7(C-12),44.4(C-13),43.9(C-14),28.4(C-15),68.3(C-16),54.1(C-17),18.2(C-18),19.5(C-19),36.6(C-20),17.7(C-21),74.6(C-22),29.4(C-23),31.8(C-24),31.1(C-25),60.1(C-26),19.2(C-27)
Veratrosine（藜芦碱苷，藜芦托素）
13CNMR(CDCl3):37.7(C-1),29.2(C-2),70.3(C-3),40.9(C-4),141.9(C-5),121.9(C-6),30.2(C-7),44.3(C-8),56.9(C-9),36.8(C-10),30.2(C-11),132.3(C-12),140.5(C-13),142.5(C-14),119.4(C-15),124.7(C-16),141.9(C-17),15.7(C-18),19.1(C-19),31.7(C-20),19.1(C-21),67.3(C-22),69.6(C-23),34.6(C-24),30.2(C-25),54.0(C-26),20.7(C-27),101.0(C-10),73.6(C-20),77.3(C-30),70.3(C-40),76.9(C-50),61.3(C-60).
Pseudojervine（伪介藜芦碱）
13CNMR(CDCl3):37.6(C-1),30.3(C-2),73.2(C-3),36.5(C-4),141.3(C-5),121.1(C-6),38.3(C-7),37.7(C-8),62.3(C-9),37.5(C-10),206.9(C-11),137.1(C-12),145.4(C-13),44.4(C-14),23.6(C-15),30.5(C-16),85.4(C-17),11.7(C-18),18.3(C-19),39.8(C-20),10.8(C-21),65.9(C-22),75.8(C-23),28.7(C-24),30.9(C-25),53.8(C-26),17.9(C-27),100.9(C-10),75.6(C-20),76.0(C-30),70.0(C-40),78.6(C-50),61.7(C-60).
Veramanine
13CNMR(CDCl3):37.2(C-1),29.5(C-2),65.6(C-3),42.5(C-4),48.0(C-5),71.3(C-6),39.7(C-7),37.0(C-8),63.2(C-9),38.3(C-10),206.0(C-11),125.0(C-12),137.0(C-13),43.8(C-14),23.8(C-15),32.5(C-16),85.6(C-17),12.0(C-18),17.5(C-19),40.8(C-20),10.4(C-21),65.6(C-22),75.4(C-23),30.5(C-24),30.6(C-25),53.5(C-26),18.4(C-27)
Isojurubidine（异戊圆锥茄次碱）
13CNMR(CDCl3):37.2(C-1),31.8(C-2),51.0(C-3),40.1(C-4),45.3(C-5),28.5(C-6),32.2(C-7),35.0(C-8),55.4(C-9),35.6(C-10),21.1(C-11),34.9(C-12),40.6(C-13),56.4(C-14),31.8(C-15),80.9(C-16),62.4(C-17),16.5(C-18),12.3(C-19),42.3(C-20),14.5(C-21),109.3(C-22),31.5(C-23),28.9(C-24),30.3(C-25),66.9(C-26),17.1(C-27).
Dihydroleptinidine（氢化勒帕茄次碱）
13CNMR(CDCl3):37.1(C-l),31.6(C-2),71.4(C-3),38.3(C-4),45.0(C-5),28.7(C-6),32.3(C-7),35.4(C-8),54.5(C-9),35.6(C-10),21.1(C-11),39.6(C-12),41.5(C-13),57.5(C-14),31.6(C-15),69.6(C-16),62.2(C-17),10.8(C-18),12.4(C-19),30.7(C-20),18.9(C-21),79.0(C-22),67.0(C-23),37.1(C-24),26.9(C-25),58.7(C-26),22.4(C-27).
(22R,25S)-3B-ACETYLAMINO-22,26-ACETYLEPIMINO-5α-CHOLESTAN-16α-YLACETATE
13CNMR(CDCl3):37.4(C-l),28.7(C-2),48.9(C-3),35.4(C-4),28.5(C-6),31.8(C-7),34.8(C-8),54.1(C-9),36.5(C-l0),20.8(C-11),43.8(C-13),79.8(C-16),13.6(C-18),18.3(C-19),13.6(C-21),19.4(C-27),170.4,170.6,169.5(C=O),23.4,22.2,21.3(CH3),Othersignals:56.5,53.7,34.8,29.6×2,28.0,20.8.
ETIOLINE（16,28-断茄啶-5,22(28)-二烯-3,16-二醇）
13CNMR(CDCl3):37.1(C-l),31.3(C-2),71.4(C-3),42.2(C-4),140.3(C-5),121.3(C-6),31.7(C-7),31.6(C-8),49.9(C-9),36.5(C-l0),20.8(C-11),40.0(C-12),43.9(C-13),53.4(C-14),35.1(C-15),76.5(C-16),63.4(C-17),13.8(C-18),19.4(C-19),44.4(C-20),18.9(C-21),177.1(C-22),29.7(C-23),27.9(C-24),27.3(C-25),55.7(C-26),19.1(C-27).
Veramarine（藜芦马林碱）
13CNMR(CDCl3):38.2(C-1),31.5(C-2),71.9(C-3),42.0(C-4),141.7(C-5),122.6(C-6),31.3(C-7),38.7(C-8),54.6(C-9),37.0(C-10),29.2(C-11),41.5(C-12),32.7(C-13),43.7(C-14),30.8(C-15),66.1(C-16),50.4(C-17),61.6(C-18),19.1(C-19),73.2(C-20),19.9(C-21),70.0(C-22),18.7(C-23),28.8(C-24),27.6(C-25),62.2(C-26),17.3(C-27)
计莫林碱(Germerine)
13CNMR(CDCl3):32.5(C-1),26.6(C-2),75.5(C-3),105.3(C-4),46.3(C-5),28.6(C-6),66.6(C-7),47.9(C-8),92.9(C-9),45.9(C-10),33.1(C-11),47.4(C-12),33.75(C-13),81.2(C-14),69.7(C-15),69.3(C-16),45.5(C-17),61.4(C-18),19.1(C-19),72.9(C-20),19.9(C-21),69.7(C-22),118.4(C-23),28.9(C-24),27.3(C-25),61.3(C-26),17.04(C-27),176.5(C-1'),74.9(C-2'),33.3(C-3'),7.72(C-4'),25.7(C-5'),175.6(C-1''),41.17(C-2''),26.7(C-3''),11.6(C-4''),16.8(C-5'').
计米定碱（germidine）
13CNMR(CDCl3):32.0(C-1),26.5(C-2),75.2(C-3),104.4(C-4),47.8(C-5),28.6(C-6),66.9(C-7),47.6(C-8),95.9(C-9),45.7(C-10),33.2(C-11),46.1(C-12),34.1(C-13),81.5(C-14),69.8(C-15),70.3(C-16),45.9(C-17),61.2(C-18),19.5(C-19),73.2(C-20),19.1(C-21),70.4(C-22),18.0(C-23),29.4(C-24),28.4(C-25),61.5(C-26),17.8(C-27),170.4(C=O),22.5(OCH3),176.1(C-1''),42.4(C-2''),17.5(C-3''),26.2(C-4''),11.0(C-5'').
原藜芦碱B(ProtoveratrineB)
13CNMR(CDCl3):31.4(C-1),26.8(C-2),75.1(C-3),103.7(C-4),47.5(C-5),70.4(C-6),70.9(C-7),47.9(C-8),95.4(C-9),46.1(C-10),33.4(C-11),46.8(C-12),34.2(C-13),81.5(C-14),69.4(C-15),70.9(C-16),45.5(C-17),61.1(C-18),19.4(C-19),73.8(C-20),19.4(C-21),70.5(C-22),18.7(C-23),29.6(C-24),28.7(C-25),61.6(C-26),17.2(C-27),174.1(C-1'),74.6(C-2'),20.7(C-3'),72.1(C-4'),15.4(C-5'),176.1(C-1''),42.5(C-2''),17.4(C-3''),26.7(C-4''),11.4(C-5'').
脱乙酰基原藜芦碱B(deacetylprotoveratrineB)
13CNMR(CDCl3):31.1(C-1),26.4(C-2),75.2(C-3),104.2(C-4),50.4(C-5),65.4(C-6),73.4(C-7),47.5(C-8),95.2(C-9),46.4(C-10),33.1(C-11),46.4(C-12),33.9(C-13),81.0(C-14),69.2(C-15),70.4(C-16),45.7(C-17),61.7(C-18),19.6(C-19),73.9(C-20),19.7(C-21),70.5(C-22),18.8(C-23),29.2(C-24),28.5(C-25),61.5(C-26),17.9(C-27),174.3(C-1'),74.8(C-2'),21.2(C-3'),71.9(C-4'),15.6(C-5'),175.8(C-1''),42.5(C-2''),17.5(C-3''),26.2(C-4''),11.3(C-5'').
Zygacine(棋盘花辛碱)
13CNMR(CDCl3):32.5(C-1),26.6(C-2),75.3(C-3),104.4(C-4),44.0(C-5),18.9(C-6),17.2(C-7),44.2(C-8),96.2(C-9),45.7(C-10),33.2(C-11),46.0(C-12),33.9(C-13),80.9(C-14),69.9(C-15),69.9(C-16),46.2(C-17),61.5(C-18),18.4(C-19),73.3(C-20),20.2(C-21),70.3(C-22),19.0(C-23),29.0(C-24),27.4(C-25),61.5(C-26),17.2(C-27),171.7(CO),21.4(OCH3).
Veratroylzygadenine（藜芦酰棋盘花碱）
13CNMR(CDCl3):33.53(C-1),27.56(C-2),76.65(C-3),105.62(C-4),47.22(C-5),l9.72(C-6),l7.90(C-7),44.70(C-8),96.96(C-9),46.56(C-l0),33.95(C-11),47.07(C-12),34.88(C-l3),81.46(C-14),70.44(C-l5),70.99(C-16),45.05(C-l7),62.38(C-l8),l9.72(C-l9),73.98(C-20),20.53(C-21),70.55(C-22),l9.13(C-23),29.67(C-24),28.11(C-25),62.08(C-26),l7.78(C-27),167.88(C-1'),123.04(C-2'),110.99(C-3'),149.50(C-4'),154.16(C-5'),113.07(C-6'),124.50(C-7'),56.77(OMe-4'),56.77(OMe-5')。
cevadine（西藜芦碱、西伐丁、瑟瓦定）
13CNMR(CDCl3):32.8(C-1),18.1(C-2),75.2(C-3),105.2(C-4),46.2(C-5),26.4(C-6),17.0(C-7),44.9(C-8),94.7(C-9),45.6(C-10),42.2(C-ll),81.5(C-12),37.1(C-13),80.5(C-14),31.2(C-15),71.1(C-16),71.7(C-17),51.5(C-18),18.4(C-19),75.5(C-20),15.5(C-21),63.7(C-22),28.8(C-23),18.7(C-24),27.6(C-25),61.4(C-26),17.2(C-27),168.8(C-1'),127.7(C-2'),139.3(C-3'),20.6(2'-CH3),16.0(3'-CH3).
实施例1：市售藜芦药材A的特征提取物IGD核磁共振碳谱偶联指纹图谱
（1）特征提取物制备
取阴干的市售藜芦药材A50g，粉碎后过10目筛，用6、6、6体积倍量（300mL、300mL、300mL）、体积比为95%的乙醇回流提取3次，每次提取2小时，滤液合并后减压浓缩，回收溶剂至无醇味，即得藜芦药材特征提取物。
（2）药材特征提取物IGD核磁共振碳谱测试
取藜芦药材特征提取物，分散到5%HOAC（pH为1.0）中，过滤后，用氯仿萃取，酸化层用氨水调pH至9左右，用氯仿萃取后，氯仿层回收溶剂至干。取该样品30mg，溶于0.5mLCDCl3中，作IGD核磁共振碳谱检测，即得到IGD核磁共振碳谱指纹图谱。
（3）藜芦生物碱特征提取物IGD核磁共振碳谱指纹图谱解析
1）IGD核磁共振碳谱指纹图谱鉴别
市售藜芦药材A的藜芦生物碱特征提取物（CET）的IGD核磁共振碳谱指纹图谱中，清楚地显示藜芦生物碱类化合物的特征信号。藜芦生物碱类：Veratramine、epi-rubijervine、Jervine、SOLANIDINE、Veramarine、deacetylprotoveratrineB、cevadine、Isoverazine、Clyclopamine、Germidine、Isojurubidine、Dihydroleptinidine、germerine、zygacine、Pesudojervine、3-epi-Jervine、veramanine等在IGD核磁共振碳谱指纹图谱中均有相应的NMR信号。IGD核磁共振碳谱指纹图谱见附图1-a，其特征峰局部拉宽放大图见附图1-b和1-c。
2）市售藜芦药材A特征提取物中各活性成分比例测定结果如下：
（4）市售藜芦药材A中质量百分含量测定结果如下：
| 药材中藜芦veratramine质量百分含量Wveratramine（%） | 0.81% |
（5）市售藜芦药材A中藜芦生物碱类活性成分质量百分含量测定结果如下：
实施例2：市售藜芦药材B的特征提取物IGD核磁共振碳谱偶联指纹图谱
（1）特征提取物制备
取阴干的市售藜芦药材B100g，粉碎后过24目筛，用8、8体积倍量（800mL、800mL）、体积比为90%的乙醇回流提取2次，每次提取1小时，滤液合并后减压浓缩，回收溶剂至无醇味，即得藜芦药材特征提取物。
（2）药材特征提取物IGD核磁共振碳谱测试
取藜芦药材特征提取物，分散到5%HOAC（pH为1.0）中，过滤后，用氯仿萃取，酸化层用氨水调pH至9.2左右，用氯仿萃取后，氯仿层回收溶剂至干。取该样品30mg，溶于0.5mLCDCl3中，作IGD核磁共振碳谱检测，即得到IGD核磁共振碳谱指纹图谱。
（3）藜芦生物碱特征提取物IGD核磁共振碳谱指纹图谱解析
1）IGD核磁共振碳谱指纹图谱鉴别
市售藜芦药材B的藜芦生物碱特征提取物（CET）的IGD核磁共振碳谱指纹图谱中，清楚地显示藜芦生物碱类化合物的特征信号。藜芦生物碱类：Veratramine、epi-rubijervine、Jervine、SOLANIDINE、cevadine、Isoverazine、Clyclopamine、Germidine、Isojurubidine、Dihydroleptinidine、etioline、germerine、Pesudojervine、3-epi-Jervine等在IGD核磁共振碳谱指纹图谱中均有相应的NMR信号。IGD核磁共振碳谱指纹图谱见附图2-a，其特征峰局部拉宽放大图见附图2-b和2-c。
2）市售藜芦B特征提取物中各活性成分比例测定结果如下：
（4）市售藜芦药材B中质量百分含量测定结果如下：
| 药材中藜芦veratramine质量百分含量Wveratramine（%） | 0.83% |
（5）市售藜芦药材B中藜芦生物碱类活性成分质量百分含量测定结果如下：
实施例3：市售藜芦药材C的特征提取物IGD核磁共振碳谱偶联指纹图谱
（1）特征提取物制备
取阴干的市售藜芦药材C50g，粉碎后过10目筛，用6、6、6体积倍量、体积比为95%的乙醇回流提取3次，每次提取2小时，滤液合并后减压浓缩，回收溶剂至无醇味，即得藜芦药材特征提取物。
（2）药材特征提取物IGD核磁共振碳谱测试
取藜芦药材特征提取物，分散到5%HOAC中，过滤后，用氯仿萃取，酸化层用氨水调pH至9左右，用氯仿萃取后，氯仿层回收溶剂至干。取该样品30mg，溶于0.5mLCDCl3中，作IGD核磁共振碳谱检测，即得到IGD核磁共振碳谱指纹图谱。
（3）藜芦生物碱特征提取物IGD核磁共振碳谱指纹图谱解析
1）IGD核磁共振碳谱指纹图谱鉴别
市售藜芦药材C的藜芦生物碱特征提取物（CET）的IGD核磁共振碳谱指纹图谱中，清楚地显示藜芦生物碱类化合物的特征信号。藜芦生物碱类：Veratramine、epi-rubijervine、Jervine、SOLANIDINE、cevadine、Isoverazine、Clyclopamine、Germidine、Isojurubidine、Dihydroleptinidine、etioline、germerine、Pesudojervine、3-epi-Jervine等在IGD核磁共振碳谱指纹图谱中均有相应的NMR信号。IGD核磁共振碳谱指纹图谱见附图3-a，其特征峰局部拉宽放大图见附图3-b和3-c。
2）市售藜芦C特征提取物中各活性成分比例测定结果如下：
（4）市售藜芦药材C中质量百分含量测定结果如下：
| 药材中藜芦veratramine质量百分含量Wveratramine（%） | 0.68% |
（5）市售藜芦药材C中藜芦生物碱类活性成分质量百分含量测定结果如下：
实施例4：市售藜芦药材D的特征提取物IGD核磁共振碳谱偶联指纹图谱
（1）特征提取物制备
称取粉碎（过65目筛）后的市售藜芦药材D（中原正信公司，来源为市售药材市场）50克，加入体积为8、8、10倍量、95%（体积比）的乙醇于90℃下回流提取3次，每次提取2小时，过滤后合并滤液，减压浓缩至无醇味，即得藜芦药材特征提取物。
（2）药材特征提取物IGD核磁共振碳谱测试
取藜芦药材特征提取物，分散到水中，用石油醚、pH3-3.5氯仿、pH9-11氯仿萃取，pH9-11氯仿层蒸干，回收溶剂至干。取该样品30mg，溶于0.5mLCDCl3中，作IGD核磁共振碳谱检测，即得到IGD核磁共振碳谱指纹图谱。
（3）藜芦生物碱特征提取物IGD核磁共振碳谱指纹图谱
1）IGD核磁共振碳谱指纹图谱鉴别
市售藜芦药材D的藜芦生物碱特征提取物（CET）的IGD核磁共振碳谱指纹图谱中，清楚地显示藜芦生物碱类化合物的特征信号。藜芦生物碱类：Veratramine、epi-rubijervine、Jervine、SOLANIDINE、Veramarine、deacetylprotoveratrineB、cevadine、Isoverazine、Clyclopamine、Germidine、Isojurubidine、Dihydroleptinidine、germerine、zygacine、Pesudojervine、3-epi-Jervine、veramanine等在IGD核磁共振碳谱指纹图谱中均有相应的NMR信号。IGD核磁共振碳谱指纹图谱见附图4-a，其特征峰局部拉宽放大图见附图4-b和4-c。
2）市售藜芦D特征提取物中各活性成分比例测定结果如下：
（4）市售藜芦药材D中质量百分含量测定结果如下：
| 市售藜芦药材D中veratramine质量百分含量Wveratramine（%） | 0.85% |
（5）市售藜芦药材D中藜芦生物碱类活性成分质量百分含量测定结果如下：
Claims (7)
1.一种鉴别藜芦药材的方法，包括以下步骤：
1)对藜芦药材进行提取，得到含有活性成分组的藜芦药材特征提取物；
其中，其特征在于，步骤1)中，藜芦药材特征提取物的制备方法，包括：称取藜芦药材，进行粉碎，用90～95％的乙醇回流提取2～3次，滤液合并后减压浓缩，回收溶剂至无醇味，即得藜芦药材特征提取物；
用乙醇回流提取，每次提取1～2小时；
所述藜芦药材与90～95％乙醇的质量体积比为1：(6～10)；
2)对所述藜芦药材特征提取物进行IGD核磁共振碳谱指纹图谱检测，根据指纹图谱得到所述藜芦药材特征提取物中若干个活性成分特征峰峰强度；并用相同方式测定出所述各活性成分相应的标准参照品的特征峰峰强度；
其中，在对藜芦药材特征提取物进行IGD核磁共振碳谱指纹图谱检测前进行处理，所述处理的方式包括：取藜芦药材特征提取物，分散到pH为1.0～3.5的酸水中，过滤后，用氯仿萃取，酸化层用氨水调pH至9～11，用氯仿萃取后，氯仿层回收溶剂至干；
藜芦药材特征提取物的特征峰为δC66.0～72.0的脂环连氧碳、δC168.0～176.0的酯羰基碳、δC206.0～208.0的酮羰基碳；
所述标准参照品为藜芦胺碱；
3)通过定量分析手段测定得到藜芦药材中所述标准参照品的绝对含量；
4)利用各活性成分特征峰峰强度及相应标准参照品的特征峰峰强度的比值和所述绝对含量，计算出藜芦药材中各活性成分的含量及活性成分组的含量。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，采用具有获得清晰IGD核磁共振碳谱指纹图谱的提取工艺作为所述藜芦药材特征提取物的提取方式。
3.根据权利要求1～2任一所述的方法，其特征在于，步骤2)中，根据特征峰峰强度的大小和位置，对藜芦药材特征提取物中若干个活性成分进行排序。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤3)中所述标准参照品的绝对含量是指：用定量分析手段测定的藜芦药材中标准参照品的质量百分含量。
5.根据权利要求1或2或4所述的方法，其特征在于，步骤3)中，所述定量分析手段为：高效液相法。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述高效液相法的条件包括：流动相为乙腈/水。
7.根据权利要求1或2或4或6所述的方法，其特征在于，步骤4)中，计算各活性成分的含量的偶联公式为：
W1为步骤3)用定量分析手段测定的藜芦药材中某一活性成分对应的标准参照品的绝对含量；
M1为所述某一活性成分对应的标准参照品的分子量/定量峰对应的碳个数；
h1为由IGD核磁共振碳谱指纹图谱测定的藜芦药材特征提取物中所述某一活性成分对应的标准参照品的特征峰峰强度；
Wn为藜芦药材中某一活性成分的质量百分含量；
Mn为某一活性成分的分子量/定量峰对应的碳个数；
hn为由IGD核磁共振碳谱指纹图谱测定的藜芦药材特征提取物中某一活性成分的特征峰峰强度。
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