CN103134827B - 一种鉴别苦皮藤种子药材的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种鉴别苦皮藤种子药材的方法，包括：对苦皮藤种子药材进行提取，得到含有活性成分组的苦皮藤种子药材特征提取物；对特征提取物进行IGD核磁共振碳谱指纹图谱检测，根据指纹图谱得到特征提取物中若干个活性成分特征峰峰强度；并用相同方式测定出各活性成分相应的标准参照品的特征峰峰强度；通过定量分析手段测定得到苦皮藤种子药材中标准参照品的绝对含量；利用特征峰峰强度的比值和所述绝对含量，计算出苦皮藤种子药材中各活性成分的含量及活性成分组含量。本发明利用IGD核磁共振碳谱偶联指纹图谱技术，反映苦皮藤种子中含有4-H-β-二氢沉香呋喃倍半萜多醇酯类化合物及其间比例，完成对苦皮藤种子药材品种和质量的鉴定。
Description
技术领域
本发明属于天然药用植物的鉴别领域，具体地，涉及一种鉴别苦皮藤种子药材的方法。
背景技术
苦皮藤（Celastrus angulatus）亦叫马断肠、苦树皮、老虎麻等，系卫矛科（Celastraceae）南蛇藤属（Celastrus）多年生藤状灌木植物，产于河北、山东、河南、陕西、湖北、甘肃、江苏、湖北等省[①中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志.科学出版社，1999，45(3)：102.]。苦皮藤对猿叶虫、小菜蛾等害虫有独特的效果，可谓长年不衰的植物杀虫剂。苦皮藤是我国特有的杀虫植物，它具有多种功效，对不同的害虫有不同的生理活性，性能稳定、使用安全，不杀伤天敌、无污染。目前，苦皮藤相关产品绝大多数采用根/皮[CN92113104.6，CN94103655.3，CN99109275.9，CN02122988.0]，由于挖根制药，资源开发的规模受到一定限制。
研究证明苦皮藤种子中所含的杀虫活性成分与根皮不同，主要是以4-H-β-二氢沉香呋喃倍半萜为骨架的多元醇酯类化合物及其生物碱。研究发现，苦皮藤种子油对黄守瓜、菜青虫、28星瓢虫、缀叶丛螟、斜纹夜蛾、丝绵木金星、黄杨绢野螟等多种害虫显示出良好的拒食作用；对贮粮害虫赤拟谷盗有较强的忌避作用；对玉米象有明显致死和杀卵作用。种子油生物急性毒性很小，进入机体易被排出体外。利用苦皮藤种子取代挖根制造农药，有利于植物资源的生态保护，减少水土流失，还可增加农民收入；以种子为原料生产的植物源农药在城乡推广应用，生产无公害食品或绿色食品，具有现实意义[柯治国，等.杀虫植物——苦皮藤种子的研究.第三届湖北湖南植保农药学术研讨会论文集，2004，94-300]。
苦皮藤种子的杀虫活性成分具有多样性、复杂性等特点，而且因产地、气候、光照等自然条件差异或提取溶剂的不同，活性成分的含量会有所变化。因此，在鉴别和评价苦皮藤种子药材及其产品过程中，仅仅采用某种单一分析检测手段[如高效液相色谱法(HPLC）]测定其中某一种主要活性成分，这种模式不能全面、综合地反映苦皮藤种子药材及其产品之间的质量差异，当然也不能全面评价苦皮藤种子药材及其产品的好坏。指纹图谱技术己成为国际公认的区别评价植物天然产物及其原料的最有效的手段[周玉新.中药指纹图谱研究技术.北京：化学工业出版社，2002]。关于苦皮藤种子药材的检测方法，包括液相方法和指纹图谱方法等，均未见报道。
IGD核磁共振碳谱偶联指纹图谱技术，也叫反门控去偶核磁共振碳谱（IGD13C NMR）偶联（coupling）指纹图谱技术，是在已研究多年的核磁共振氢谱（1H NMR）指纹图谱技术[赵天增，等.1HNMR指纹法鉴定植物中药.中草药2000，31(11)：868-870]的基础上联合其他技术（例如目前应用最广泛的高效液相（HPLC）指纹图谱技术[谢培山等.中药色谱指纹图谱.人民卫生出版社，2005]）提出的一种新的非单一手段综合指纹图谱技术。
若能对苦皮藤种子药材IGD核磁共振碳谱偶联指纹图谱技术进行研究与应用，不仅可以解决我国苦皮藤种子药材鉴别和评价的难题，也为加强苦皮藤种子药材内在成分研究的系统化与标准化提供了科学的保证。随着该技术在其他中药材及其提取物、植物源农药中的推广应用，该技术的重大科学价值必将日趋突出。
发明内容
为了解决现有技术的问题，本发明的目的在于提供一种鉴别苦皮藤种子药材的方法，该方法利用了IGD核磁共振碳谱偶联指纹图谱技术。
为了实现上述目的，本发明提供的鉴别苦皮藤种子药材的方法，包括以下步骤：
1）对苦皮藤种子药材进行提取，得到含有活性成分组的苦皮藤种子药材特征提取物；
2）对所述苦皮藤种子药材特征提取物进行IGD核磁共振碳谱指纹图谱检测，根据指纹图谱得到所述苦皮藤种子药材特征提取物中若干个活性成分特征峰峰强度；并用相同方式（IGD核磁共振碳谱指纹图谱）测定出所述各活性成分相应的标准参照品的特征峰峰强度；
3）通过定量分析手段测定得到苦皮藤种子药材中所述标准参照品的绝对含量；
4）利用所述特征峰峰强度（各活性成分特征峰峰强度及相应标准参照品的特征峰峰强度）的比值和所述绝对含量，计算出苦皮藤种子药材中各活性成分的含量及该类活性成分的总含量，即活性成分组的含量。
其中，步骤1）中，苦皮藤种子药材特征提取物的制备方法，包括：称取苦皮藤种子药材，粉碎，用6~10倍量（体积）石油醚回流提取2~3次，滤液合并后减压浓缩，回收溶剂至油状浸膏，即得苦皮藤种子药材特征提取物。
进一步地，用石油醚回流提取，每次提取1~2小时。
进一步地，苦皮藤种子药材粉碎后过10~24目筛。
其中，步骤2）中，在对苦皮藤种子药材特征提取物进行IGD核磁共振碳谱指纹图谱检测前，可以进行适当处理，具体方式包括：取苦皮藤种子药材特征提取物，加入1~2倍量（体积）80%~95%（质量浓度）的甲醇萃取20~40min，甲醇层过滤后减压浓缩，回收溶剂至干。溶于CDCl3（氘代氯仿）中，之后即可以做IGD核磁共振碳谱指纹图谱检测。
其中，步骤2）中，所述苦皮藤种子药材特征提取物中的活性成分特征峰为：C-15吸收峰，其化学位移为δC60.0~66.0。
其中，步骤2）中所述峰强度，可以采用峰高法、面积积分法或重量法计算。
其中，步骤3）中所述标准参照品的绝对含量是指：用定量分析手段测定的苦皮藤种子药材中标准参照品的质量百分含量。
其中，步骤3）中，所述定量分析手段为：高效液相法（HPLC法）。
进一步地，所述HPLC法的条件为：色谱柱以十八烷基键合硅胶为填料，流动相为(甲醇/乙腈):水=[(40/20):40]~[(47/23):30]的混合溶剂，检测波长为231nm。
其中，所述标准参照品为苦皮藤种素C（Angulateoid C）。
本发明主要测定的是苦皮藤种子药材中4-H-β-二氢沉香呋喃倍半萜多醇酯类化合物的含量。
其中，步骤4）中，计算各活性成分的含量的偶联公式为：
W1为步骤3）用定量分析手段测定的苦皮藤种子药材中某一活性成分对应的标准参照品的绝对含量；
M1为所述某一活性成分对应的标准参照品的分子量；
h1为由IGD核磁共振碳谱指纹图谱测定的苦皮藤种子药材特征提取物中所述某一活性成分对应的标准参照品的特征峰峰强度；
Wn为苦皮藤种子药材中某一活性成分的质量百分含量；
Mn为某一活性成分的分子量；
hn为由IGD核磁共振碳谱指纹图谱测定的苦皮藤种子药材特征提取物中某一活性成分的特征峰峰强度；
该类活性成分的总含量就是同类的各活性成分的Wn相加之和，即活性成分组的含量。
本发明方法所述活性成分组，是苦皮藤单味种子药材中的活性成分组。苦皮藤种子药材，是指苦皮藤植物的果实部位。
该发明获“国家科技支撑计划资助（2012BAB18B04）”。
本发明各活性成分的含量及该类活性成分的总含量的计算，是通过偶联公式将IGD核磁共振碳谱和分析定量手段偶联。和现有技术相比，本发明采用IGD13C NMR偶联指纹图谱具有下面几个特点：
①稳定性（重复性）：IGD13C NMR得到的化学位移数据为小数点后第二位，分辩性好，重复性好；HPLC、GC的非色谱条件（如色谱柱内径、长度、固定相牌号、载体粒度、流动相流速、混合流动相各组分比例、柱温、进样量、检测器灵敏度等）改变等，得到的保留时间数据变化很大，意味着整体色谱图形的变异，重复性不好。
②整体性（全面性）：IGD13C NMR指纹图谱中包含样品中的每一个活性成分碳的相应谱峰；HPLC、GC、UV、IR、MS不存在这种关系。
③可靠性（单一性）：IGD13C NMR谱峰与样品中不同活性成分及其不同基团上的碳是严格的一一对应关系；HPLC、GC、UV、IR、MS不存在这种关系。
④可行性（易辨性）：IGD13C NMR指纹图谱规律性很强，一般情况下，可归属图谱中的每一个碳峰；HPLC、GC需要对照品；IR不易解析；UV信息量少；MS则有离子化程度和基质干扰等问题。
本发明针对苦皮藤种子活性成分的多样性、复杂性及高效液相色谱指纹图谱和核磁共振氢谱（1H NMR）指纹图谱的局限性，构建IGD核磁共振碳谱偶联指纹图谱技术，反映苦皮藤种子中含有哪些4-H-β-二氢沉香呋喃倍半萜多醇酯类化合物以及它们之间的比例，达到对苦皮藤种子药材品种和质量的鉴定的目的，准确性和稳定性、重复性和可行性与现有技术相比有很大的提高。
附图说明
图1-a为实施例1中湖北恩施(2010)苦皮藤种子药材特征提取物IGD核磁共振碳谱指纹图谱。
图1-b为实施例1中湖北恩施(2010)苦皮藤种子药材特征提取物IGD核磁共振碳谱指纹图谱特征峰局部拉宽放大图。
图2-a为实施例2中湖北恩施(2011)苦皮藤种子药材特征提取物IGD核磁共振碳谱指纹图谱。
图2-b为实施例2中湖北恩施(2011)苦皮藤种子药材特征提取物IGD核磁共振碳谱指纹图谱特征峰局部拉宽放大图。
图3-a为实施例3中湖北武汉(2011)苦皮藤种子药材特征提取物IGD核磁共振碳谱指纹图谱。
图3-b为实施例3中湖北武汉(2011)苦皮藤种子药材特征提取物IGD核磁共振碳谱指纹图谱特征峰局部拉宽放大图。
图4为本发明苦皮藤种子药材特征提取物获取程序流程图。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步地详细描述，但本发明的保护范围并不局限于此。
1、苦皮藤种子药材IGD核磁共振碳谱偶联指纹图谱研究步骤
（1）特征提取物获取程序研究
取阴干的苦皮藤种子药材100~200g，粉碎后过10~24目筛，用6~10体积倍量的石油醚回流提取2~3次，每次提取1~2小时，滤液合并后减压浓缩，回收溶剂至油状浸膏，即得苦皮藤种子药材特征提取物（Character Extract，CE）。准确称量得到的CE质量m药材'。其程序流程如图4所示。
（2）特征提取物IGD核磁共振碳谱指纹图谱检测
取苦皮藤种子药材特征提取物1~2g，加入1~2倍体积量、质量浓度为80%~95%的甲醇萃取20~40min，80%~95%甲醇层过滤后减压浓缩，回收溶剂至干。取该样品65mg，溶于0.5mL CDCl3中，作IGD核磁共振碳谱检测，即得到IGD核磁共振碳谱指纹图谱。
（3）特征提取物IGD核磁共振碳谱指纹图谱解析
1）鉴别
特征提取物IGD核磁共振碳谱指纹图谱中，应清楚地显示4-H-β-二氢沉香呋喃倍半萜多醇酯类化合物的特征信号，且全部或大部分含有Angulateoid C、Angulateoid B、Angulateoid E、Angulatinoid I、Angulatinoid III、Angulatinoid IV、Angulatinoid V信号。
具体数据如下：
δC71.0-79.5，22.0-24.0或69.0-70.0，26.0-32.0，32.0-34.0或39.0-40.5，86.0-93.0分别为A环1，2，3，4，5位脂环碳信号；32.0-37.0或74.0-79.0，47.0-54.0，69.0-79.5或34.0-35.0，69.0-80.0，48.5-55.0分别为B环6,7,8,9,10位脂环碳信号，80.0-83.0为4-H-β-二氢沉香呋喃倍半萜多醇酯类化合物C-11碳信号，29.0-32.0，22.5-26.5，14.0-19.0分别为4-H-β-二氢沉香呋喃倍半萜多醇酯类化合物C-12、C-13、C-14甲基碳信号，61.0-66.0为4-H-β-二氢沉香呋喃倍半萜多醇酯类化合物C-15亚甲基碳信号。
2）各活性成分特征峰选取
由于特征提取物中含有一系列活性成分4-H-β-二氢沉香呋喃倍半萜多醇酯类化合物，碳峰交叉得较多，为了测定各活性成分的比例，必须选择化学位移差别较大的相应峰作为特征峰。为此，经实际考察，选择了δC60.0~66.0左右一组C-15峰。其原因为：一般情况下，C-15峰作为连氧碳，易于辨认；而且C-15位不同化合物之间化学位移差别较大。
3）标准参照品的选择
Angulateoid C是杀虫植物苦皮藤种子的主要杀虫活性成分之一，其特征峰的化学位移为δC61.6左右，与其他主要活性成分特征峰在此没有重叠。因此，选择Angulateoid C作为标准参照品。
（4）采用HPLC测定苦皮藤种子药材中Angulateoid C的含量
1）HPLC检测
①色谱条件
仪器：岛津LC-20AT
流动相：(甲醇/乙腈):水=(43:22):35
流速：1mL/min
色谱柱:Agilent C18（安捷伦十八烷基键合硅胶）4.6*250mm
检测器：紫外
波长：231nm
进样量：10μL
②标准参照品溶液的配制
精确称取Angulateoid C5mg，置50mL容量瓶中，用甲醇溶解稀释至刻度，摇匀后即得标准参照品溶液（Angulateoid C100μg/mL）。
③标准曲线和检出限
浓度范围：1-200μg/mL（ppm）；标准参照品浓度分别为：1μg/mL、5μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL。
在上述色谱条件下，进行HPLC分析，Angulateoid C总峰面积Y对浓度C的线性回归方程为：Y=12377X-5305.5（n=5,R=0.9999）。
检出限为：0.5ug/mL(S/N=3)。
根据标准曲线图，在所选的浓度范围内，Angulateoid C的标准溶液的工作曲线线性关系良好。
④供试品溶液的制备
准确称取苦皮藤种子药材特征提取物200mg于100mL容量瓶中，加适量甲醇溶解，超声振荡后稀释至刻度，摇匀后即得苦皮藤种子药材特征提取物供试品溶液。
⑤精密度测定
供试品溶液重复进样3次，峰面积相对标准偏差RSD=1.32%，保留时间相对标准偏差RSD=0.26%。
⑥供试品的测定
吸取各供试品溶液，进样，测其峰面积，求得Angulateoid C含量。
⑦回收率测定
采用标准加入方法，在供试品溶液中加标100μg/mL，平均回收率为105.8％，RSD为1.31％。
2）Angulateoid C绝对含量计算
①由下式计算供试品溶液中Angulateoid C质量浓度：
CX：苦皮藤种子药材特征提取物供试品溶液中Angulateoid C质量浓度（ug/mL）；
CR：标准参照品溶液Angulateoid C质量浓度（ug/mL）；
AX：由HPLC测定的苦皮藤种子药材特征提取物供试品溶液中Angulateoid C峰面积；
AR：由HPLC测定的标准参照品溶液Angulateoid C峰面积。
②由下式计算苦皮藤种子药材特征提取物中Angulateoid C质量百分含量：
W'Angulateoid C(%)：苦皮藤种子药材特征提取物中Angulateoid C质量百分含量；
CX：苦皮藤种子药材特征提取物供试品溶液中Angulateoid C质量浓度（ug/mL）；
m供试品：称取的苦皮藤种子药材特征提取物供试品溶液质量(mg)。
③由下式计算苦皮藤种子药材中Angulateoid C质量百分含量：
WAngulateoid C（%）：苦皮藤种子药材中Angulateoid C质量百分含量（标准参照品的绝对含量）；
W'Angulateoid C(%)：苦皮藤种子药材特征提取物中Angulateoid C质量百分含量；
m药材'：得到的苦皮藤种子药材特征提取物的总质量(mg)；
m：称取的苦皮藤种子药材的质量(mg)。
（5）通过偶联公式计算苦皮藤种子药材中主要活性成分含量及总量
Wn：苦皮藤种子药材中其他某一活性成分质量百分含量；
W1：苦皮藤种子药材中Angulateoid C质量百分含量（标准参照品的绝对含量），即WAngulateoid C（%）；
M1：Angulateoid C（标准参照品）分子量；
h1：由IGD核磁共振碳谱指纹图谱测定的苦皮藤种子药材特征提取物中Angulateoid C（标准参照品）特征峰峰强度；
Mn：其他某一活性成分分子量；
hn：由IGD核磁共振碳谱指纹图谱测定的苦皮藤种子药材特征提取物中其他某一活性成分特征峰峰强度。
2、仪器、试剂与材料
核磁共振波谱仪Bruker DPX400型。
质谱仪：Waters Micromass Q-Tof MicroTM型。
半制备高效液相色谱仪：Waters600型。
高效液相色谱仪：Agilent1200型。
2000mL蒸馏烧瓶、5000mL蒸馏烧瓶、球型冷凝管、2000mL分液漏斗。
DE-52AA旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂。
DEF-6020型真空干燥箱：上海精宏实验设备有限公司。
柱层析硅胶G和薄层层析硅胶H：青岛海洋化工厂。
硅胶层析柱6cm×70cm（直径×高度）。
苦皮藤种子药材（湖北恩施，2010年11月、2011年11月收购自当地）、苦皮藤种子药材（湖北武汉，2011年11月收购自当地）均经河南省农业大学朱长山教授鉴定。
Angulateoid C，标准参照品，实验室自制（经光谱数据鉴定）。
试剂：色谱纯（甲醇，天津市四友精细化学品有限公司）及分析纯（天津市化学试剂一厂）。
3、基础研究
（1）分离提取流程
称取阴干的苦皮藤种子500g，粉碎，用6倍量(体积)石油醚回流提取3次，滤液合并后60℃减压浓缩，回收溶剂至油状。按此方法共提取苦皮藤种子粉末2.0kg，总共得浸膏665g。种油用1倍量(体积)纯度90%的甲醇萃取1次，90%甲醇层过滤后减压浓缩，回收溶剂得浸膏（110g）。取此浸膏用硅胶柱色谱分离，用石油醚-乙酸乙酯（10：1~4：6）溶剂体系进行梯度洗脱，每500mL收集1份，合并相同馏分。第61份经制备色谱纯化，得Angulateoid C（25mg）；第80-81份得Angulatinoid I纯品（90mg）；第111-112份得Angulateoid B纯品（80mg）；第202份经制备色谱纯化，得Angulatinoid II（25mg）；第215份经制备色谱纯化，得Angulatinoid III（25mg）；第325份经制备色谱纯化，得Angulatinoid IV（20mg）和Angulatinoid V（60mg）。
（2）苦皮藤种子药材中主要活性成分的结构及核磁共振碳谱数据
Angulateoid C:R1=R4=R8=OAc,R2=R5=R6=R7=H,R3=OBz
Angulateoid B:R1=R4=R7=R8=OAc,R2=R5=H,R3=OBz,R6=H
Angulateoid E:R1=ONiC,R2=R5=H,R3=OBz,R4=OAc,R6=R7=H,R8=OiBu
Angulatinoid I：R1=R3=R8=OAc,R2=R5=R6=R7=H,R4=OBz
Angulatinoid II:R1=R5=R7=R8=OAc,R2=R4=R6=H,R3=OBz
Angulatinoid III:R1=R5=R7=R8=OAc,R2=R4=R6=H,R3=OBz
Angulatinoid IV:R1=ONiC,R2=R4=R7=H,R3=R5=OBz,R6=R8＝OAc
Angulatinoid V:R1=ONiC,R2=R5=H,R3=OBz,R4=R7=R8=OAc,R6=H
Angulatinoid VI：R1=R6=R7=OAc,R2=R4=H,R3=R8=OBz,R5=ONic
Angulatinoid VII：R1=R3=R8=OAc,R2=R4=R6=R7=H,R3=OBz
Celahin B：R1=R6=R7=R8=OAc,R2=R4=R5=H,R3=OBz
Celahin C：R1=R6=R7=OAc,R2=R4=R5=H,R3=OBz,R8＝OH
Angulateoid C（苦皮藤种素C）
13C NMR(100MHz,CDCl3)δC:78.25(C-1)，22.76(C-2),26.46(C-3),39.81(C-4)，88.21(C-5)，36.25(C-6)，47.08(C-7)，75.66(C-8)，76.00(C-9)，50.06(C-10),81.65(C-11),30.78(C-12)，24.45(C-13)，16.94(C-14)，61.59(C-15)
OAC:170.04,170.61,170.65,20.98,21.05,21.50
OBz:165.63,129.86,129.46,128.58,133.14
Angulateoid B（苦皮藤种素B）
13C NMR(100MHz,CDCl3)δC:75.53*(C-1)，69.12*(C-2),31.92(C-3),39.18(C-4)，87.85(C-5)，36.11(C-6)，47.18(C-7)，76.21*(C-8)，76.27*(C-9)，50.59(C-10),81.90(C-11),30.72(C-12)，24.44(C-13)，18.47(C-14)，61.76(C-15)(*归属可互换)
OAC:169.73,169.86,170.43,170.59,20.56,20.99,21.34,21.51
OBz:165.70,129.73,129.48,128.61,133.20
Angulateoid E（苦皮藤种素E）[Liu JK,et al.Phytochemistry1993,32(2):379.]
13C NMR(100MHz,CDCl3)δC:73.4*(C-1)，26.7(C-2),22.9(C-3),40.0(C-4)，88.2(C-5)，36.7(C-6)，47.8(C-7)，78.4(C-8)*，76.3*(C-9)，50.5(C-10),81.9(C-11),30.8(C-12)，24.6(C-13)，17.1(C-14)，63.1(C-15)
OAC:169.9,21.0
OiBu:176.2,34.3,18.6,18.7
OBz:165.6**,130.1,129.5,128.6,133.1
ONiC:165.5**,125.9,123.7,137.1,151.2,153.9
(*，**归属可互换)
Angulatinoid I（苦皮种素I）
13C NMR(100MHz,CDCl3)δC:76.31(C-1)，69.17(C-2),31.00(C-3),39.14(C-4)，87.69(C-5)，36.38(C-6)，47.21(C-7)，75.37(C-8)，76.31(C-9)，50.58(C-10),82.07(C-11),30.64(C-12)，24.47(C-13)，18.64(C-14)，63.38(C-15)
OAC:169.71,169.83,170.51,20.61,21.33,20.88
OBz:165.55,129.55,129.42,128.60,133.24
Angulatinoid II（苦皮种素II）
13C NMR(100MHz,CDCl3)δC:71.08(C-1)，69.80(C-2),30.89(C-3),39.10(C-4)，86.09(C-5)，36.39(C-6)，48.24(C-7)，71.72(C-8)，68.60(C-9)，51.53(C-10),82.34(C-11),31.00(C-12)，25.04(C-13)，18.82(C-14)，64.42(C-15)
OAC:169.39,169.96,169.96,170.55,20.33,20.88,21.34,21.41
OBz:165.79,129.17,130.27,128.29,133.38
Angulatinoid III（苦皮种素III）
13C NMR(100MHz,CDCl3)δC:77.17(C-1)，69.82(C-2),31.41(C-3),39.26(C-4)，87.77(C-5)，32.13(C-6)，48.23(C-7)，69.80(C-8)，73.70(C-9)，49.32(C-10),80.61(C-11),29.85(C-12)，23.07(C-13)，18.38(C-14)，61.97(C-15)
OAC:169.94,170.01,169.96,170.55,20.52,21.34*,21.11*,21.58
OBz:164.86,129.64,129.54,128.53,133.27
Angulatinoid IV（苦皮种素IV）
13C NMR(100MHz,CDCl3)δC:79.22(C-1)，23.30(C-2),26.60(C-3),33.53(C-4)，90.44(C-5)，75.24(C-6)，52.83(C-7)，71.67(C-8)，73.16(C-9)，51.31(C-10),81.50(C-11),30.57(C-12)，24.60(C-13)，16.04(C-14)，62.28(C-15)
OAC:170.12,169.82,20.83,20.88
OBz:166.23,164.93,129.23,129.59,129.48,129.68,128.09,128.47,132.87,133.31
ONiC:165.41,151.40,125.53,137.39,123.05,153.40
Angulatinoid V（1β,2β,8α-triacetoxy-9β-benzoyloxy-15-nicotinoyloxy-β-dihydroagaran,苦皮种素V）[Tu Y Q,et al.Chin Chem Lett1993,4(3):219]
13C NMR(100MHz,CDCl3)δC:76.31(C-1)，69.17(C-2),31.00(C-3),39.14(C-4)，87.69(C-5)，36.38(C-6)，47.21(C-7)，75.37(C-8)，76.31(C-9)，50.58(C-10),82.07(C-11),30.64(C-12)，24.47(C-13)，18.64(C-14)，63.38(C-15)
OAC:169.71,169.83,170.51,20.61,21.33,20.88
OBz:165.55,129.55,129.42,128.60,133.24
ONiC:165.35,150.89,125.75,137.27,123.83,153.68
Angulatinoid VI（苦皮种素VI）[Tu Y Q,et al.J Nat Prod1993,56(1):126.]
13C NMR(100MHz,CDCl3)δC:79.0*(C-1)，23.4(C-2),26.7(C-3),39.9(C-4)，88.5(C-5)，32.0(C-6)，48.0(C-7)，74.3*(C-8)，79.0(C-9)，49.0(C-10),80.5(C-11),29.9(C-12)，22.9(C-13)，16.1(C-14)，61.2(C-15)(*归属可互换)
OAC:169.8,170.5,170.8,20.7,20.9,21.5
OBz:165.3,128.4-133.1
Angulatinoid VII（1β,9β-bisbenzoyloxy-2β,6α,15-triacetoxy-8β-nicotinoyl-
oxy-β-dihydroagaran，苦皮种素VII）[Tu Y Q,et al.J Nat Prod1997,60(2):178.]
13C NMR(100MHz,CDCl3)δC:77.4(C-1)，69.3(C-2),31.3(C-3),32.9(C-4)，90.3(C-5)，74.7(C-6)，53.4(C-7)，72.5(C-8)，71.6(C-9)，51.7(C-10),81.2(C-11),30.3(C-12)，24.6(C-13)，16.6(C-14)，61.1(C-15)
OAC:169.4,169.6,170.7,21.1,21.1,21.3
OBz:164.8**,148.6,132.7,132.6,129.5,129.2,128.0,127.7,129.5,128.9
ONiC:165.0**,126.1,123.2,137.1,151.0,153.6
(*,**归属可互换)
Celahin B（青江藤素B）[Kou Y H,et al.Phytochemistry,1996,41(2):549.]
13C NMR(75.47MHz,CDCl3)δC:13C NMR(100MHz,CDCl3)δC:71.5(C-1),69.5(C-2),30.8(C-3),33.1(C-4),89.2(C-5),78.1(C-6),48.8(C-7),34.8(C-8),69.4(C-9),53.3(C-10),82.7(C-11),30.3(C-12),25.9(C-13),17.8(C-14),65.4(C-15);
OAC-1:169.3,170.0,170.0,170.6,20.4,21.3,21.3,21.4;
OBz:165.3,129.1,130.1,128.3,133.5.
(*归属可互换)。
Celahin C（青江藤素C）[Kou Y H,et al.Phytochemistry,1996,41(2):549.]
13C NMR(75.47MHz,CDCl3)δC:69.6*(C-1)，73.3*(C-2),29.7(C-3),33.1(C-4)，89.3(C-5)，78.3(C-6)，48.8(C-7)，34.3(C-8)，69.3*(C-9)，54.6(C-10),82.6(C-11),31.9(C-12)，26.0(C-13)，17.9(C-14)，65.2(C-15)
OAC:170.0,170.5,171.4,14.1,21.4,21.7
OBz:165.4,129.5,129.5,128.6,133.1
实施例1：湖北恩施（2010）苦皮藤种子药材IGD核磁共振碳谱偶联指纹图谱
（1）药材特征提取物制备
选择湖北恩施(2010)的苦皮藤种子药材，按下述方法制备苦皮藤种子药材特征提取物：称取阴干的苦皮藤种子药材100g，粉碎（过24目筛），用每次6倍量体积（600mL）石油醚回流提取3次，每次提取2小时，滤液合并后减压浓缩，回收溶剂至油状浸膏，即得苦皮藤种子药材特征提取物。
（2）药材特征提取物IGD核磁共振碳谱测试
取苦皮藤种子药材特征提取物1g，加入1倍量体积（1mL）、质量浓度为85%的甲醇萃取30min，85%甲醇层过滤后减压浓缩，回收溶剂至干。取该样品65mg，溶于0.5mL CDCl3中，作IGD核磁共振碳谱检测，即得到IGD核磁共振碳谱指纹图谱。
（3）IGD核磁共振碳谱指纹图谱解析
1）鉴别
湖北恩施(2010)苦皮藤种子特征提取物的IGD核磁共振碳谱指纹图谱中，清楚地显示4-H-β-二氢沉香呋喃倍半萜多醇酯类化合物的特征信号。根据其母核信号及其C-15特征峰信号的化学位移，确证12个4-H-β-二氢沉香呋喃倍半萜多醇酯类化合物Angulateoid C、
Angulateoid B、Angulateoid E、Angulatinoid I、Angulatinoid II、
Angulatinoid III、Angulatinoid IV、Angulatinoid V、Angulatinoid VI、
Angulatinoid VII、Celahin B、Celahin C在IGD核磁共振碳谱指纹图谱中均有相应的NMR信号。IGD核磁共振碳谱指纹图谱如图1-a所示，
其特征峰局部拉宽放大图如图1-b所示。
2）湖北恩施(2010)苦皮藤种子药材特征提取物各活性成分比例测定结果如下：
（4）湖北恩施(2010)苦皮藤种子药材Angulateoid C浓度含量测定结果如下：
| 称取种子药材质量 | 100g |
| 苦皮藤种子药材特征提取物总质量m药材' | 33.0g |
| 特征提取物中Angulateoid C质量百分含量 | 4.07% |
| 种子药材中Angulateoid C质量百分含量 | 1.34% |
（5）湖北恩施(2010)苦皮藤种子药材中活性成分含量测定结果如下：
实施例2：湖北恩施（2011）苦皮藤种子药材IGD核磁共振碳谱偶联
指纹图谱
（1）药材特征提取物制备
选择湖北恩施(2011)的苦皮藤种子药材，按下述方法制备苦皮藤种子药材特征提取物：称取阴干的苦皮藤种子药材100g，粉碎（过24目筛），用每次6倍量体积（600mL）石油醚回流提取3次，每次提取2小时，滤液合并后减压浓缩，回收溶剂至油状浸膏，即得苦皮藤种子药材特征提取物。
（2）特征提取物IGD核磁共振碳谱测试
取苦皮藤种子药材特征提取物1g，加入1倍量体积（1mL）、质量浓度为90%的甲醇萃取30min，90%甲醇层过滤后减压减压浓缩，回收溶剂至干。取该样品65mg，溶于0.5mL CDCl3中，作IGD核磁共振碳谱检测，即得到IGD核磁共振碳谱指纹图谱。
（3）IGD核磁共振碳谱指纹图谱解析
1）鉴别
湖北恩施（2011）产苦皮藤种子特征提取物的IGD核磁共振碳谱指纹图谱中，清楚地显示4-H-β-二氢沉香呋喃倍半萜多醇酯类化合物的特征信号。根据其母核信号及其C-15特征峰信号的化学位移，确证12个4-H-β-二氢沉香呋喃倍半萜多醇酯类化合物Angulateoid C、Angulateoid B、Angulateoid E、Angulatinoid I、Angulatinoid II、Angulatinoid III、Angulatinoid IV、Angulatinoid V、Angulatinoid VI、Angulatinoid VII、Celahin B、Celahin C在IGD核磁共振碳谱指纹图谱中均有相应的NMR信号。IGD核磁共振碳谱指纹图谱如图2-a所示，其特征峰局部拉宽放大图如图2-b所示。
2）湖北恩施(2011)苦皮藤种子药材特征提取物各活性成分比例测定结果如下：
（4）湖北恩施(2011)苦皮藤种子药材Angulateoid C浓度含量测定结果如下：
| 称取种子药材质量 | 100g |
| 药材特征提取物总质量m药材' | 33.5g |
| 特征提取物中Angulateoid C质量百分含量 | 3.97% |
| 药材中Angulateoid C质量百分含量 | 1.33% |
（5）湖北恩施(2011)苦皮藤种子药材中活性成分含量测定结果如下：
实施例3：湖北武汉（2011）苦皮藤种子药材IGD核磁共振碳谱偶联
指纹图谱
（1）药材特征提取物制备
选择湖北武汉（2011）的苦皮藤种子药材，按下述方法制备苦皮藤种子药材特征提取物：称取阴干的苦皮藤种子药材100g，粉碎（过10目筛），用每次10倍量体积（1000mL）石油醚回流提取2次，每次1提取小时，滤液合并后减压浓缩，回收溶剂至油状浸膏，即得苦皮藤种子药材特征提取物。
（2）药材特征提取物IGD核磁共振碳谱测试
取苦皮藤种子药材特征提取物1g，加入2倍量体积（2mL）、质量浓度为95%的甲醇萃取20min，95%甲醇层过滤后减压浓缩，回收溶剂至干。取该样品65mg，溶于0.5mL CDCl3中，作IGD核磁共振碳谱检测，即得到IGD核磁共振碳谱指纹图谱。
（3）IGD核磁共振碳谱指纹图谱解析
1）鉴别
湖北武汉（2011）产苦皮藤种子特征提取物的IGD核磁共振碳谱指纹图谱中，清楚地显示4-H-β-二氢沉香呋喃倍半萜多醇酯类化合物的特征信号。根据其母核信号及其C-15特征峰信号的化学位移，确证11个4-H-β-二氢沉香呋喃倍半萜多醇酯类化合物Angulateoid C、Angulateoid B、Angulateoid E、Angulatinoid I、Angulatinoid II、Angulatinoid III、Angulatinoid IV、Angulatinoid V、Angulatinoid VI、Celahin B、Celahin C在IGD核磁共振碳谱指纹图谱中均有相应的NMR信号。IGD核磁共振碳谱指纹图谱如图3-a所示，其特征峰局部拉宽放大图如图3-b所示。
2）湖北武汉(2011)苦皮藤种子药材特征提取物各活性成分比例测定结果如下：
（4）湖北武汉(2011)苦皮藤种子药材Angulateoid C浓度含量测定结果如下：
| 称取种子药材质量 | 100g |
| 药材特征提取物总质量m药材' | 30.9g |
| 特征提取物中Angulateoid C质量百分含量 | 3.88% |
| 药材中Angulateoid C质量百分含量 | 1.20% |
（5）湖北武汉(2011)苦皮藤种子药材中活性成分含量测定结果如下：
Claims (4)
1.一种鉴别苦皮藤种子药材的方法，包括以下步骤：
1)对苦皮藤种子药材进行提取，得到含有活性成分组的苦皮藤种子药材特征提取物；
其中，苦皮藤种子药材特征提取物的制备方法，包括：称取苦皮藤种子药材，粉碎，用6～10倍量石油醚回流提取2～3次，滤液合并后减压浓缩，回收溶剂至油状浸膏，即得苦皮藤种子药材特征提取物；
2)对所述苦皮藤种子药材特征提取物进行IGD核磁共振碳谱指纹图谱检测，根据指纹图谱得到所述苦皮藤种子药材特征提取物中若干个活性成分特征峰峰强度；并用相同方式测定出所述各活性成分相应的标准参照品的特征峰峰强度；
其中，在对苦皮藤种子药材特征提取物进行IGD核磁共振碳谱指纹图谱检测前，进行处理的方式包括：取苦皮藤种子药材特征提取物，加入1～2倍量80％～95％的甲醇萃取20～40min，甲醇层过滤后减压浓缩，回收溶剂至干；所述苦皮藤种子药材特征提取物中的活性成分特征峰为：C-15吸收峰，其化学位移为δC 60.0～66.0；所述活性成分至少含有Angulateoid C、Angulateoid B、Angulateoid E、Angulatinoid I、Angulatinoid III、Angulatinoid IV、Angulatinoid V；所述标准参照品为Angulateoid C；
3)通过定量分析手段测定得到苦皮藤种子药材中所述标准参照品的绝对含量；
其中，所述定量分析手段为：高效液相法，所述高效液相法的条件为：色谱柱以十八烷基键合硅胶为填料，流动相为甲醇/乙腈∶水＝(40/20)∶40～(47/23)∶30的混合溶剂，检测波长为231nm；
4)利用各活性成分特征峰峰强度及相应标准参照品的特征峰峰强度的比值和所述绝对含量，计算出苦皮藤种子药材中各活性成分的含量及活性成分组的含量。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述峰强度，采用峰高法、面积积分法或重量法计算。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤3)中所述标准参照品的绝对含量是指：用定量分析手段测定的苦皮藤种子药材中标准参照品的质量百分含量。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤4)中，计算各活性成分的含量的偶联公式为：
W1为步骤3)用定量分析手段测定的苦皮藤种子药材中某一活性成分对应的标准参照品的绝对含量；
M1为所述某一活性成分对应的标准参照品的分子量；
h1为由IGD核磁共振碳谱指纹图谱测定的苦皮藤种子药材特征提取物中所述某一活性成分对应的标准参照品的特征峰峰强度；
Wn为苦皮藤种子药材中某一活性成分的质量百分含量；
Mn为某一活性成分的分子量；
hn为由IGD核磁共振碳谱指纹图谱测定的苦皮藤种子药材特征提取物中某一活性成分的特征峰峰强度。
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