CN102893989B - 苦皮藤素原药、以及它的制备方法和质量检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种苦皮藤素原药及其水乳剂，以及它们的制备方法和质量检测方法。所述苦皮藤素原药，含有以下质量百分含量的活性成分：苦皮素A 6.0~9.5%，苦皮素B 7.5~9.5%，苦皮素C和苦皮素F 4.0~6.5%，苦皮素G 6.5~10.5%，苦皮素A、苦皮素E、苦皮藤素C和苦皮藤素XIX 11.5~15.5%，苦皮素H 3.5~6.0%。该苦皮藤素原药采用大孔吸附树脂法制备得到，质量检测方法采用IGD核磁共振碳谱偶联指纹图谱技术；本发明的苦皮藤素原药含量大幅提高，质量检测方法准确性和稳定性、重复性和可行性也较高。
Description
技术领域
本发明属于植物源农药技术领域，具体地，涉及了一种苦皮藤素原药及其水乳剂，以及它们的制备方法和质量检测方法。
背景技术
苦皮藤（Celastrus angulatus MaXim）系卫矛科(Celastraceae)南蛇藤属(Celastrus)多年生藤状灌木植物，分布在河北、山东、河南、陕西、湖北、甘肃、江苏、安徽等省[中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志.科学出版社,1999,45(3):102]。苦皮藤是我国传统的杀虫植物，民间用其根、皮作蔬菜等农作物的天然无毒杀虫剂，故得名“菜药”、“萝卜药”研究证明其中所含的生物活性成分主要是β-二氢沉香呋喃多元醇酯类化合物及其生物碱，这类化合物一般具有强杀虫，抗肿瘤等生理活性。[①赵天增,等.苦皮藤中一个倍半菇醇醋新活性化合物的结构.中草药,1999,30(4):241.②吴文君.植物杀虫剂苦皮藤素研究与应用[M].化学工业出版社,2010]。
目前文献报道的苦皮藤的提取方法均为溶剂回流法，提取溶剂包括石油醚、苯、丙酮、乙醚、甲苯、甲醇、乙醇等；其中工业化生产大多采用苯[朱文丽,等.苦皮藤根皮的化学成分.中国实验方剂学杂志,2011,17(13),271-276.]。虽然乙醇为环保溶剂，但与其他溶剂提取物相比，苦皮藤乙醇提取物化学成分极其复杂、多样，含有大量黄酮、卫矛醇、三萜等其他成分，β-二氢沉香呋喃多元醇酯类化合物含量很低（如苦皮素A含量0.5%左右）左右，溶解性较差，难于制成相应剂型。因此，苦皮藤基本不采用乙醇提取。
大孔吸附树脂（macroporous absorption resin）是近40余年来发展起来的一类有机高聚物吸附剂，利用其多孔结构和选择性吸附功能 可从中药提取液中分离精制有效成分或有效部位，最大限度地去粗取精，并可实现大规模工业化。目前大孔吸附树脂在植物源农药领域已有应用，但应用于苦皮藤相关产品的工业化生产和乙醇提取物的分离均未见报道。
苦皮藤素的品质不在于某个单一成分，其效果是多个成分协同配比的结果。研究证明苦皮藤中主要杀虫活性成分是以4-OH-β-二氢沉香呋喃倍半萜骨架的多元醇酯化合物及其生物碱，统称苦皮藤素。苦皮藤素化学成分非常复杂，含有以苦皮素B、苦皮素A为主的多种杀虫成分，但目前苦皮藤原药中苦皮藤素组分的检测方法一是测定苦皮藤原药中水解后产生的苯甲酸，操作步骤极其复杂，结果不可靠，可行性差；二是参照制剂仅对其中一个组分苦皮素A（或苦皮藤素V）进行定量分析[①吴文君,等.植物杀虫剂0.2%苦皮藤素乳油的研究与开发.Pesticides(农药),2001,40(3):17.②卢桂荣，等.RP-HPLC法测定苦皮藤素中苦皮素A的含量.河南科学，2007，25（3）：395.]。这种针对单一成分进行定量分析的质量控制模式不能有效控制苦皮藤原药的内在质量，无法满足当前对于客观有效地评价和控制苦皮藤产品质量的迫切要求。指纹图谱技术已成为国际公认的区别评价植物天然产物及其原料的最有效的手段[罗国安,等.中药指纹图谱的分类和发展.中国新药杂志,2002,11(1):46.]。目前关于苦皮藤提取物及其产品的指纹图谱未见报道。
IGD核磁共振碳谱偶联（IGD13C NMR coupling）指纹图谱技术，也叫反门控去偶核磁共振碳谱偶联指纹图谱技术，是在已研究多年的核磁共振氢谱（1H NMR）指纹图谱技术[赵天增,等.1HNMR指纹法鉴定植物中药.中草药，2000,31(11):868-870.]的基础上联合其他技术（例如目前应用最广泛的高效液相（HPLC）指纹图谱技术）提出的一种新的非单一手段综合指纹图谱技术。
随着药品、食品安全日益受到国家和社会的高度重视，可广泛应 用于无公害蔬菜、农作物和非作物类的害虫防治的苦皮藤素需求量很大，为IGD核磁共振碳谱偶联指纹图谱技术的应用提供了广阔的基础。苦皮藤素原药及其制剂的IGD核磁共振碳谱偶联指纹图谱技术的研究与应用，不仅可以解决其中活性成分的定性问题，也为加强其内在成分研究的系统化与标准化，加快植物源农药苦皮藤素现代化的发展，实现与国际接轨提供了科学的保证。随着该技术在其他中药材及其提取物、植物源农药中的推广应用，该技术的重大科学价值必将日趋突出。
发明内容
为了解决植物源农药现有技术、质量等方面存在的问题，本发明的目的在于，提供一种优良的植物源农药苦皮藤素原药及其水乳剂。
本发明的另一目的在于，提供一种所述苦皮藤素原药及其水乳剂的制备方法。
本发明的又一目的在于，提供一种所述苦皮藤素原药及其水乳剂的质量检测方法。
为实现上述目的，本发明提供的一种苦皮藤素原药，其中含有以下质量百分含量的活性成分：苦皮素A6.0~9.5%，苦皮素B7.5~9.5%，苦皮素C和苦皮素F4.0~6.5%，苦皮素G6.5~10.5%，苦皮素A、苦皮素E、苦皮藤素C和苦皮藤素XIX11.5~15.5%，苦皮素H3.5~6.0%。
本发明苦皮藤素原药中的所述活性成分均为4-OH-β-二氢沉香呋喃倍半萜多醇酯类化合物。
其中，苦皮藤素C的质量百分含量为0.5~2.0%，苦皮藤素XIX的质量百分含量为0.4~1.5%。
本发明所述苦皮藤原药中各活性成分（4-OH-β-二氢沉香呋喃倍半萜多醇酯类化合物）总的质量百分含量不小于35%。
进一步地，苦皮藤原药中各活性成分总的质量百分含量为 35.0~45.0%。
更进一步地，品种为陕西宝鸡的苦皮藤原药中活性成分总的质量百分含量为35.0~38.5%，品种为陕西华县的苦皮藤原药中活性成分总的质量百分含量为42.0~45.0%。
本发明提供的苦皮藤素原药为固体状。
本发明提供的苦皮藤素原药的制备方法包括：称取苦皮藤根或/和皮粉碎，加入体积为2~6倍量、90~95%的乙醇于60~80℃下回流或超声提取2~3次，每次提取1~2小时，过滤后合并滤液，减压浓缩；取浓缩后的滤液，用其重量为1~2倍量的大孔吸附树脂装柱，先后以20~25%乙醇、40~50%乙醇、75%~85%乙醇和90~95%乙醇冲柱，收集75%~85%乙醇洗脱液，减压蒸干，即得苦皮藤素原药。这里表示乙醇浓度的百分数均为质量比。
进一步地，所述大孔吸附树脂的型号为HP-20、D-101、D-201或SP-70，优选HP-20，D-101。
进一步地，所述大孔吸附树脂的径高比为8:1~15:1，优选10~12:1。
进一步地，苦皮藤根或/和皮粉碎后过10~24目筛。
进一步地，浓缩后滤液的密度为0.90~1.19。
进一步地，用于冲柱的乙醇的体积为浓缩后滤液的20~40倍，优选四次冲柱的体积分别为25，30，40，20倍。
苦皮藤根或/和皮中的活性成分，除了本发明苦皮藤素原药所述的成分外，还包括苦皮素U、X；苦皮素P、苦皮藤素IV、苦皮藤素VII、苦皮藤素XIX；苦皮素J、苦皮藤素III等4-OH-β-二氢沉香呋喃倍半萜多醇酯类化合物，以及黄酮、生物碱、三萜等其他类别的成分。
本发明提供的苦皮藤原药，可以制成水悬浮剂、可湿性粉剂、水乳剂等各种剂型用于植物源农药杀虫剂。
本发明提供的一种苦皮藤素水乳剂，包含所述苦皮藤素原药。
本发明提供的所述苦皮藤素水乳剂，包括以下重量份的成分：所述苦皮藤素原药8~10份，乳化剂8~12份，抗冻剂3~5份。
本发明提供的所述苦皮藤素水乳剂，优选地，包括以下重量份的成分：所述苦皮藤素原药8~9份，乳化剂9~10份，抗冻剂5份。
其中，所述乳化剂为：烷基芳基聚氧乙烯聚氧丙烯醚或烷基芳基聚氧乙烯聚氧乙烯醚，优选烷基芳基聚氧乙烯聚氧丙烯醚。
其中，所述抗冻剂为：乙二醇或丙二醇，优选乙二醇。
本发明提供的一种苦皮藤素水乳剂，还包括溶剂。
其中，溶剂为水。
本发明所述的苦皮藤素水乳剂，其中的辅料，即乳化剂、抗冻剂以及溶剂，也可以是本领域的常规种类及用量。还可以使用助剂，也是本领域的常规选择。
本发明所述苦皮藤素水乳剂中各活性成分（4-OH-β-二氢沉香呋喃倍半萜多醇酯类化合物）的总的质量百分含量不小于3%。
进一步地，苦皮藤水乳剂中各活性成分总的质量百分含量为3.0~4.0%。
更进一步地，品种为陕西宝鸡的苦皮藤原药中活性成分总的质量百分含量为3.0~3.5%，品种为陕西华县的苦皮藤原药中活性成分总的质量百分含量为3.0~3.5%。
本发明提供的所述苦皮藤素水乳剂的制备方法，包括：将所述苦皮藤素原药与乳化剂、抗冻剂和溶剂按所述比例混合，即得。
本发明提供的苦皮藤素原药的质量检测方法，包括以下步骤：
1）对苦皮藤素原药进行提取，得到含有活性成分组的苦皮藤素原药特征提取物；
2）对苦皮藤素原药特征提取物进行IGD核磁共振碳谱指纹图谱检测，根据指纹图谱得到所述苦皮藤素原药特征提取物中若干个活性成分特征峰峰强度；并用相同方式（IGD核磁共振碳谱指纹图谱）测 定出所述各活性成分相应的标准参照品的特征峰峰强度；
3）通过定量分析手段测定得到苦皮藤素原药中所述标准参照品的绝对含量；
4）利用所述特征峰峰强度（各活性成分特征峰峰强度及相应的标准参照品的特征峰峰强度）的比值和所述绝对含量，计算出苦皮藤素原药中各活性成分的含量及该类活性成分的总含量，即活性成分组的含量。
其中，步骤1）中，苦皮藤素原药特征提取物的制备方法，包括：称取苦皮藤素原药，加入体积为6~12倍的氯仿，75~85℃下超声或回流提取20~40min，过滤后减压浓缩，回收溶剂至干，即得苦皮藤素特征提取物。
苦皮藤素原药特征提取物处理及检测方法如下：取苦皮藤素原药特征提取物，溶于CDCl3中，作IGD核磁共振碳谱指纹图谱检测。
其中，步骤2）中，所述苦皮藤素原药特征提取物中的活性成分特征峰为：C-15吸收峰，其化学位移为δC 60.0~66.0。
进一步地，选择C-8作为特征峰进一步区别苦皮素A、苦皮素E、苦皮藤素C和苦皮藤素XIX，其（C-8）化学位移为δC73.3~74.7；选择C-9作为特征峰进一步区别苦皮素C、苦皮素F，其（C-9）化学位移为δC70.6~72.6。
其中，步骤2）中，所述峰强度，可以采用峰高法、面积积分法或重量法计算。
其中，步骤3）中，所述标准参照品的绝对含量是指：用定量分析手段测定的苦皮藤素原药中标准参照品的质量百分含量。
其中，所述定量分析手段为高效液相色谱（HPLC）法。
进一步地，HPLC法的条件为：色谱柱以十八烷基键合硅胶为填料，流动相为甲醇：乙腈和水=（30~40）：（20~30）：（35~45）的混合溶剂，流速为1mL/min，检测波长为242nm。乙腈：水优选35:25:40。
其中，所述标准参照品为苦皮素B。
其中，苦皮藤素原药中各活性成分的含量及该类活性成分的总含量计算是通过偶联计算公式将IGD核磁共振碳谱和定量分析手段偶联，即步骤4）中，计算各活性成分的含量的偶联公式为：
W1为步骤3）用定量分析手段测定的苦皮藤素原药中某一活性成分对应的标准参照品的绝对含量（质量百分含量）；
M1为所述某一活性成分对应的标准参照品的分子量；
h1为由IGD核磁共振碳谱指纹图谱测定的苦皮藤素原药特征提取物中所述某一活性成分对应的标准参照品的特征峰峰强度；
Wn为苦皮藤素原药中某一活性成分的质量百分含量；
Mn为某一活性成分的分子量；
hn为由IGD核磁共振碳谱指纹图谱测定的苦皮藤素原药特征提取物中某一活性成分的特征峰峰强度。
通过偶联公式还可计算苦皮藤素原药中各活性成分的系数和总系数。
进一步地，所述系数的计算公式为：
其中Fn为苦皮藤素原药中某一活性成分与其对应的标准参照品质量百分含量的比值系数。M1、h1、Mn和hn的含义同计算苦皮藤素原药中各活性成分含量偶联公式中的相应定义。总系数指各成分的系数之和。
该系数Fn也同样适用于计算苦皮藤素水乳剂中的活性成分及活性成分组。
本发明提供的苦皮藤素水乳剂的质量检测方法，利用上述方法检测得到苦皮藤素原药中某各活性成分的含量，再推算出苦皮藤素水乳 剂中各活性成分的质量百分含量。这里的苦皮藤素水乳剂是由苦皮藤素原药制备得到。
其中，苦皮藤素水乳剂中各活性成分的含量计算公式为：
Xn=X1Fn；其中：
Xn为苦皮藤素水乳剂中某一活性成分质量百分含量；
X1为用定量分析手段测定的苦皮藤素水乳剂中某一活性成分对应的标准参照品的绝对含量（质量百分含量）。
其中，所述定量分析手段为上述的高效液相色谱法。
苦皮藤素原药或苦皮藤素水乳剂中该类活性成分的总含量就是同类的各活性成分的Xn相加之和，即活性成分组的含量，单个活性化合物系数Fn相加之和即苦皮藤素总系数。
本发明的质量检测方法可以用来检测本发明35%的苦皮藤原药或其他浓度的苦皮藤原药，以及本发明3%的苦皮藤水乳剂或其他浓度的苦皮藤素水乳剂。
本发明方法所述活性成分组，尤其是将苦皮藤药材进行提取后，得到的苦皮藤素原药和苦皮藤素水乳剂中的活性成分组。
本发明的苦皮藤药材，是指苦皮藤植物的根或/和皮的部位。
本发明各活性成分的含量及该类活性成分的总含量的计算，是通过偶联公式将IGD核磁共振碳谱和分析定量手段偶联。和现有技术相比，本发明采用IGD13C NMR偶联指纹图谱具有下面几个特点：
①稳定性（重复性）：IGD13C NMR得到的化学位移数据为小数点后第二位，分辩性好，重复性好；HPLC、GC的非色谱条件（如色谱柱内径、长度、固定相牌号、载体粒度、流动相流速、混合流动相各组分比例、柱温、进样量、检测器灵敏度等）改变等，得到的保留时间数据变化很大，意味着整体色谱图形的变异，重复性不好。
②整体性（全面性）：IGD13C NMR指纹图谱中包含样品中的每一个活性成分碳的相应谱峰；HPLC、GC、UV、IR、MS不存在这种 关系。
③可靠性（单一性）：IGD13C NMR谱峰与样品中不同活性成分及其不同基团上的碳是严格的一一对应关系；HPLC、GC、UV、IR、MS不存在这种关系。
④可行性（易辨性）：IGD13C NMR指纹图谱规律性很强，一般情况下，可归属图谱中的每一个碳峰；HPLC、GC需要对照品；IR不易解析；UV信息量少；MS则有离子化程度和基质干扰等问题。
本发明针对苦皮藤素原药中活性成分的多样性、复杂性，及高效液相色谱指纹图谱和核磁共振氢谱（1H NMR）指纹图谱的局限性，构建IGD核磁共振碳谱偶联指纹图谱技术，反映出苦皮藤素原药中含有哪些4-OH-β-二氢沉香呋喃倍半萜多醇酯类化合物，及其它们各自的含量、比例关系以及总含量，达到对苦皮藤素原药及其制剂质量检测和控制的目的。准确性和稳定性、重复性和可行性与现有技术相比有很大的提高。使得苦皮藤素原药及苦皮藤素制剂（尤其是水乳剂）成分明确、含量清楚、质量可控、性能稳定，加强了苦皮藤素原药及其制剂内在成分研究的系统化与标准化。
我们对苦皮藤醇提物进行了深入、系统的研究，找到了一系列杀虫活性成分并确定了其化学结构，并针对苦皮藤乙醇提取物有效成分少、杂质多、难以制成制剂和苦皮藤苯提取物毒性大等局限性，采用大孔吸附树脂法富集杀虫活性成分，得到的苦皮藤素原药与现有的苦皮藤素原药（即6%苦皮藤素原药）相比，含量大幅提高，且杂质含量少。本工艺具有设备简单、指标可控、易操作、收率高、无环境污染等特点，适合工业化生产。
并且，由本发明苦皮藤素原药（35%）配制的苦皮藤素水乳剂（3%）属于生产环境友好型农药，而6%苦皮藤素原药配制的1%苦皮藤素乳油，由于污染较大，环保性差，工业和信息化部在工原[2009]第29号文件中第四项明文规定：“自2009年8月1日起不再颁发农药乳油 产品批准证书”，也就是说，其生产已与其他农药乳油产品一起叫停。
微乳剂在发展初期曾因乳化剂、助溶剂用量较大而引起人们的忧虑，而且稳定性较差、成本较高，微乳剂在国际上不是剂型开发的趋势[华乃震.水基化制剂的开发和前景.农药2006,45(12):805.]。另外，0.5%苦皮藤素微乳剂由于临时批号到期已不再生产。
因此，本发明苦皮藤素原药活性成分含量高，苦皮藤素水乳剂的防治效果已超过1%苦皮藤素乳油和其他的现有产品，其优点突出表现在污染小，属于生产环境友好型农药；且见效快、稳定性好、成本低，利于推广，具有很高的应用价值与经济价值。
附图说明
图1-a为实施例1的35%T9苦皮藤素原药甲特征提取物IGD核磁共振碳谱指纹图谱。
图1-b为实施例1的35%T9苦皮藤素原药甲特征提取物IGD核磁共振碳谱指纹图谱特征峰局部拉宽放大图。
图2-a为实施例2的35%T9苦皮藤素原药乙特征提取物IGD核磁共振碳谱指纹图谱。
图2-b为实施例2的35%T9苦皮藤素原药乙特征提取物IGD核磁共振碳谱指纹图谱特征峰局部拉宽放大图。
图3-a为实施例3的35%T9苦皮藤素原药丙特征提取物IGD核磁共振碳谱指纹图谱。
图3-b为实施例3的35%T9苦皮藤素原药丙特征提取物IGD核磁共振碳谱指纹图谱特征峰局部拉宽放大图。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步地详细描述，但本发明的保护范围并不局限于此。
1.苦皮藤素原药、水乳剂的制备方法
（1）35%苦皮藤素原药
称取阴干的苦皮藤根或/和皮粉碎（过10~24目筛），加入体积为2~6倍量、90~95%的乙醇于60~80℃下回流或超声提取2~3次，每次提取1~2小时，过滤后合并滤液，减压浓缩；取浓缩后的滤液（密度为0.90~1.19），用其重量为1~2倍量的大孔吸附树脂装柱，先后以20~25%乙醇、40~50%乙醇、75%~85%乙醇和90~95%乙醇冲柱，收集75%~85%乙醇洗脱液，减压蒸干，即得苦皮藤素原药。大孔吸附树脂的型号为HP-20、D-101、D-201或SP-70；大孔吸附树脂的径高比为8:1~15:1；用于冲柱的乙醇的体积为浓缩后滤液的20~40倍。大孔吸附树脂HP20为三菱DIAION系列，D-101购自南开大学化工厂。
（2）3%苦皮藤素水乳剂
35%苦皮藤素原药与与乳化剂、抗冻剂和溶剂按所述比例混合，即得3%苦皮藤素水乳剂。
3%苦皮藤素水乳剂混合比例如下：35%苦皮藤素原药8~9份，乳化剂9~10份，抗冻剂5份，溶剂（水）补足余量。这里的百分号“%”为质量百分比。其中，乳化剂烷基芳基聚氧乙烯聚氧丙烯醚购自：山东天道生物工程有限公司。
2.IGD核磁共振碳谱指纹图谱质量检测方法
（1）IGD核磁共振碳谱指纹图谱质量检测方法研究步骤
1）特征提取物获取程序研究
准确称取35%苦皮藤素原药，加入体积为6~12倍的氯仿，75~85℃下超声或回流提取20~40min，过滤后减压浓缩，回收溶剂至干，即得苦皮藤素原药特征提取物。
2）特征提取物IGD核磁共振碳谱指纹图谱检测
取上述35%苦皮藤素原药特征提取物55~65mg，溶于0.5mLCDCl3中，作IGD核磁共振碳谱指纹图谱检测，即得到IGD核磁共振碳谱指纹图谱。
3）特征提取物IGD核磁共振碳谱指纹图谱解析
①鉴别
特征提取物IGD核磁共振碳谱指纹图谱中，应清楚地显示4-OH-β-二氢沉香呋喃倍半萜多醇酯类化合物的特征信号，且全部或大部分含有苦皮素A、E、H、celangulatin C；苦皮素B、C、F、G、苦皮藤素IV；苦皮素J、苦皮藤素III信号。
具体数据如下：
δC74.9-75.5或70.5-70.9或75.8-76.0，66.9-68.1，41.1-42.1，72.1-72.2或69.7-69.9，91.3-91.7分别为A环1，2，3，4，5位脂环碳信号；76.2-77.0或75.0-75.6，53.0-53.8，73.3-74.7或75.6-76.5或69.7-69.8，74.9-75.5或70.6-72.6，50.1-50.8或53.9-54.5或52.9-53.0分别为B环6,7,8,9,10位脂环碳信号，82.5-84.6为4-OH-β-二氢沉香呋喃倍半萜多醇酯类化合物C-11碳信号，29.3-30.1，26.2-26.4或25.4-25.7或24.3-24.4，24.1-24.6为4-OH-β-二氢沉香呋喃倍半萜多醇酯类化合物C-12、C-13、C-14甲基碳信号，61.4-61.8或65.0-65.7或60.2-60.7为4-OH-β-二氢沉香呋喃倍半萜多醇酯类化合物C-15亚甲基碳信号。由于苦皮素A、E、苦皮藤素C、苦皮藤素XIX以及苦皮素C、F的C-15位峰重叠，另选择C-8作为特征峰区别苦皮素A、苦皮素E、苦皮藤素C和苦皮藤素XIX，C-8的化学位移为δC73.3~74.7；选择C-9作为特征峰区别苦皮素C和苦皮素F，C-9的化学位移为δC70.6~72.6。
②35%苦皮藤素原药特征提取物中各活性成分特征峰选取
由于特征提取物中含有一系列活性成分4-OH-β-二氢沉香呋喃倍半萜多醇酯类化合物，碳峰交叉得较多，为了测定各活性成分的比例，必须选择化学位移差别较大的相应峰作为特征峰。为此，经实际考察，选择了δC60.0-66.0左右一组C-15峰。其原因为：一般情况下，C-15峰作为连氧碳，易于辨认；C-15位受C-9上α和β位取代基的γ效应不同，其化学位移差别较大。如苦皮素A、E、H、celangulatin C的化学位移 为δC61.0左右；苦皮素B、C、F、G、苦皮藤素IV的化学位移为δC65.0左右；苦皮素J、苦皮藤素Ⅲ的化学位移为δC60.0左右。
③标准参照品的选择
苦皮素B是杀虫植物苦皮藤的主要杀虫活性成分之一，其特征峰的化学位移为δC65.4，与其他主要活性成分特征峰在此没有重叠。因此，选择苦皮素B作为标准参照品。
4）采用HPLC测定35%苦皮藤素原药或3%苦皮藤素水乳剂中苦皮素B的含量
①HPLC检测
i)色谱条件
仪器：岛津LC-20AT
流动相：（甲醇：乙腈：水）=35:25:40
流速：1mL/min
色谱柱:Agilent C184.6*250mm
检测器：紫外
波长：242nm
进样量：20μL；
ii)标准参照品溶液的配制
精确称取苦皮素B5mg，置50mL容量瓶中，用甲醇溶解稀释至刻度，摇匀后即得标准参照品溶液（苦皮素B100μg/mL）。
iii)标准曲线和检出限
浓度范围：1~100μg/mL（ppm）；标准参照品浓度分别为：1μg/mL、5μg/mL、50μg/mL、100μg/mL。
在上述色谱条件下，进行HPLC分析，苦皮素B总峰面积Y对浓度C的线性回归方程为：
Y=13034.17*C+294.07（n=5,R=0.9999）。
检出限为：0.5ug/mL(S/N=3)。
根据标准曲线图，在所选的浓度范围内，苦皮素B的标准溶液的工作曲线线性关系良好。
iv)供试品溶液的制备
准确称取35%苦皮藤素原药或3%苦皮藤素水乳剂200mg于100mL容量瓶中，加适量甲醇溶解，超声振荡后稀释至刻度，摇匀后即得35%苦皮藤素原药或3%苦皮藤素水乳剂供试品溶液。
v)精密度测定
供试品溶液重复进样5次，峰面积相对标准偏差RSD=1.54%，保留时间相对标准偏差RSD=0.37%。
vi)供试品的测定
吸取各供试品溶液，进样，测其峰面积，求得苦皮素B含量。
vii)回收率测定
采用标准加入方法，在原药供试品中加标100μg/mL，平均回收率为101.7%。
②苦皮素B绝对含量计算
i)由下式计算供试品溶液中苦皮素B质量浓度
CX：35%苦皮藤素原药或3%苦皮藤素水乳剂供试品溶液中苦皮素B质量浓度（ug/mL）；
CR：标准参照品溶液（苦皮素B）质量浓度（ug/mL）；
AX：由HPLC测定的35%苦皮藤素原药或3%苦皮藤素水乳剂供试品溶液中苦皮素B的峰面积；
AR：由HPLC测定的标准参照品溶液中苦皮素B的峰面积。
ii)由下式计算35%苦皮藤素原药或3%苦皮藤素水乳剂苦皮素B质量百分含量
W苦皮素B(%)：35%苦皮藤素原药或3%苦皮藤素水乳剂中苦皮素B质量百分含量，即标准参照品苦皮素B的绝对含量（质量百分含量）；
CX：35%苦皮藤素原药或3%苦皮藤素水乳剂供试品溶液中苦皮素B质量浓度(ug/mL)；
m供试品：称取的35%苦皮藤素原药或3%苦皮藤素苦皮素B质量(mg)。
5）通过偶联公式计算35%苦皮藤素原药中主要活性成分含量
Wn（%）：35%苦皮藤素原药中某一活性成分质量百分含量%；
W1（%）：35%苦皮藤素原药中苦皮素B质量百分含量%，即标准参照品苦皮素B的绝对含量（质量百分含量）；
M1：苦皮素B（标准参照品）分子量；
h1：由IGD核磁共振碳谱指纹图谱测定的35%苦皮藤素原药特征提取物中苦皮素B（标准参照品）特征峰峰强度（峰高）；
Mn：35%苦皮藤素原药特征提取物中某一活性成分分子量；
hn：由IGD核磁共振碳谱指纹图谱测定的35%苦皮藤素原药特征提取物中某一活性成分特征峰峰强度（峰高）。
6）通过偶联公式计算35%苦皮藤素原药中主要单个活性成分系数与总系数
系数计算公式
Fn：35%苦皮藤素原药中某一活性成分与苦皮素B（标准参照品）质量百分含量的比值系数；
M1：苦皮素B（标准参照品）分子量；
h1：由IGD核磁共振碳谱指纹图谱测定的35%苦皮藤素原药特征 提取物中苦皮素B（标准参照品）特征峰峰强度（峰高）；
Mn：35%苦皮藤素原药特征提取物中某一活性成分分子量；
hn：由IGD核磁共振碳谱指纹图谱测定的35%苦皮藤素原药特征提取物中某一活性成分特征峰峰强度（峰高）。
总系数为Fn的加和。
该系数Fn也同样适用于计算3%苦皮藤素水乳剂中的活性成分及活性成分组。
7）3%苦皮藤素水乳剂中主要活性成分含量及总量计算
Xn（%）=X1（%）Fn
Xn：3%苦皮藤素水乳剂中某一活性成分质量百分含量%；
X1：3%苦皮藤素水乳剂中苦皮素B质量百分含量%，即标准参照品苦皮素B的绝对含量。
（2）仪器、试剂与材料
核磁共振波谱仪Bruker DPX 400型。
质谱仪：Waters Micromass Q-Tof MicroTM型。
半制备高效液相色谱仪：Waters 600型。
2000mL蒸馏烧瓶、5000mL蒸馏烧瓶、球型冷凝管、2000mL分液漏斗。
DE-52AA旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂。
DEF-6020型真空干燥箱：上海精宏实验设备有限公司。
柱层析硅胶G和薄层层析硅胶H：青岛海洋化工厂。
硅胶层析柱6cm×70cm（直径×高度）。
苦皮藤药材（陕西宝鸡，2009年11月、2010年11月大量收购自当地），苦皮藤药材（陕西华县，2010年11月大量收购自当地），苦皮藤药材（河南淅川，2009年11月大量收购自当地），均经河南省农业大学朱长山教授鉴定。
苦皮素B，标准参照品，实验室自制（经光谱数据鉴定）。
试剂：色谱纯（甲醇，天津市四友精细化学品有限公司）及分析纯（天津市化学试剂一厂）。
（3）基础研究
1）分离提取流程1
称取阴干的河南淅川产苦皮藤根、皮1kg，粉碎，用6倍量体积苯回流提取3次，滤液合并后60℃减压浓缩，回收溶剂至浸膏状，浸膏用6倍量体积纯度80%的甲醇溶解后，60mL的石油醚萃取1次，甲醇层过滤后减压浓缩，回收溶剂得浸膏（27.5g）。取此浸膏用硅胶柱色谱分离，用石油醚-乙酸乙酯（10：1~4：6）溶剂体系进行梯度洗脱，每250mL收集1份，合并相同馏分。第38份经制备色谱纯化，得苦皮素E（18mg）；第42~43份得苦皮素A纯品（60mg）；第54份经制备色谱纯化，得苦皮素B（25mg），苦皮素H（40mg）；第61份得苦皮素G（95mg）；第69~70份经制备色谱纯化，得苦皮素F（45mg）；第76份经制备色谱纯化得苦皮素J。
2）分离提取流程2
称取陕西宝鸡1kg苦皮藤根皮粉末，依次加入3︰2︰2倍量95%乙醇80℃下回流提取2h，过滤，合并三次滤液，减压浓缩至浸膏。按此方法共提取苦皮藤根皮粉末7kg，总共得浸膏1120g。称取上述醇提物浸膏，加入六倍量氯仿，80℃下回流提取40min，过滤，减压浓缩至浸膏，得浸膏147g。此浸膏硅胶拌样后上柱，采用石油醚／乙酸乙酯(10:1～4:6)进行梯度洗脱，经高效液相制备纯化[SunfireC18色谱柱(150mm×10mm,10μm)；流动相：甲醇-水；柱温：25℃；流速：10mL/min；检测波长：232nm；进样量：200μl]得到下列β-二氢沉香呋喃多元醇酯类化合物。第381-385份经制备纯化[甲醇-水65:35]得苦皮素E(27mg)；第420份经制备纯化[甲醇-水62:38]得苦皮素A(80mg)；第546-554份经制备纯化[甲醇-水60:40]得celangulatin C(57mg)和苦皮藤素XIX(43mg)；第590-594份经制备 纯化[甲醇-水68:32]得苦皮素C(28mg)；第613-614份经制备纯化[甲醇-水62:38]得苦皮素B(95mg)、苦皮素H(60mg)。
3）35%苦皮藤原药及3%水乳剂中主要活性成分的结构及核磁共振碳谱数据
苦皮素A:R1=R4=OiBu,R2=R5=H,R3=OBz,R6=OH,R7=OAc
苦皮素B:R1=R5=OiBu,R2=OFu,R3=R4=H,R6=R7=OAc
苦皮素C:R1=R5=OiBu,R2=OBu,R3=R4=H,R6=R7=OAc
苦皮素E:R1=OiPet,R2=R5=H，R3=OBz,R4=OiBu,R6=OH,R7=OAc
苦皮素F:R1=R6=R7=OAc,R2=R5=OFu,R3=R4=H
苦皮素G:R1=R6=R7=OAc,R2=OFu,R3=R4=H,R5=OiBu
苦皮素H:R1=R7=OAc,R2=R5=H，R3=OBz,R4=OiBu,R6=OHCelangulatin C:R1=OiBu,R2=R5=H,R3=OBz,R4=R7=OAc,R6=OH
苦皮藤素XIX:R1=OiBu,R2=R5=H,R3=OBz,R4=OFu,R6=OH,R7=OAc
苦皮素A
13C NMR(100MHz,CDCl3)δC:75.01(C-1)，67.26(C-2),41.15(C-3),72.13(C-4)，91.41(C-5)，76.89(C-6)，53.51(C-7)，73.69(C-8)，75.28(C-9)，50.52(C-10),84.54(C-11),30.05(C-12)，26.35(C-13)，24.14(C-14)，61.69(C-15)
OAC:169.49,169.60，20.50，21.13
OiBu:175.82,176.77,34.09,34.31,18.46,18.66,19.06,19.14
OBz:165.67,129.26,129.44,128.63,133.45
苦皮素B
13C NMR(100MHz,CDCl3)δC:70.63(C-1)，67.96(C-2),42.00(C-3),69.84(C-4)，91.33(C-5)，75.39(C-6)，52.97(C-7)，76.05(C-8)，71.44(C-9)，53.87(C-10),83.44(C-11),29.59(C-12)，25.45(C-13)，24.47(C-14)，65.45(C-15)
OAC:169.54,169.66,169.79,20.55,21.12,21.48
OiBu:175.74,176.90,33.95,34.10,18.73,18.99,19.00,19.06
OFu:160.91,148.99,117.81,109.69,144.00
苦皮素C
13C NMR(100MHz,CDCl3)δC:70.86(C-1),67.98(C-2),42.04(C-3),69.88(C-4)，91.42(C-5),75.48(C-6),53.04(C-7),76.19(C-8),72.03(C-9),54.10(C-10),83.54(C-11),29.61(C-12),25.66(C-13),24.50(C-14),65.55(C-15);
OAC:169.44,169.57,169.26,20.38,21.13*,21.50*(-CH3)(*归属可互换)
OiBu:175.77,176.95,33.98,34.12,18.78,18.91,19.04,19.08
OBz:164.52,128.31,130.18,128.47,133.87
苦皮素E
13C NMR(100MHz,CDCl3)δC:75.09(C-1)，67.31(C-2),41.21(C-3),72.15(C-4)，91.49(C-5)，76.92(C-6)，53.53(C-7)， 73.80(C-8)，75.23(C-9)，50.49(C-10),84.54(C-11),30.08(C-12)，26.31(C-13)，24.06(C-14)，61.68(C-15)
OAC:169.55,169.46,20.48,21.13
OiBu:175.72,34.11,18.48,18.64
OiPet:176.19,41.56,26.59,11.69,16.92
OBz:165.68,129.36,129.49,128.61,133.42
苦皮素F
13C NMR(100MHz,CDCl3)δC:70.53(C-1)，67.80(C-2),41.93(C-3),69.90(C-4)，91.31(C-5)，75.34(C-6)，53.80(C-7)，76.54(C-8)，71.65(C-9)，54.33(C-10),83.12(C-11),25.55(C-12)，29.51(C-13)，24.32(C-14)，65.56(C-15)
OAC:169.51,169.75,169.86,170.52,20.47,21.13,21.52,21.11
OFu:161.61,160.53,148.69,148.87,118.84,118.05,109.96,109.78,144.01,144.01
苦皮素G
13C NMR(100MHz,CDCl3)δC:70.49(C-1)，67.82(C-2),41.92(C-3),69.81(C-4)，91.51(C-5)，75.00(C-6)，53.34(C-7)，76.10(C-8)，72.65(C-9)，53.97(C-10),83.27(C-11),29.45(C-123)，25.48(C-13)，24.35(C-14)，65.67(C-15)
OAC:169.47,169.69,169.74,,170.53,20.45,21.14,21.52,21.04
OiBu:175.86,33.92,18.81,18.89
OFu:160.91,148.99,117.83,109.71,144.02
苦皮素H
13C NMR(100MHz,CDCl3)δC:74.89(C-1)，67.31(C-2),41.10(C-3),72.11(C-4)，91.44(C-5)，76.87(C-6)，53.59(C-7)，73.36(C-8)，75.40(C-9)，50.64(C-10),84.52(C-11),30.03(C-123)，26.24(C-132)，24.23(C-14)，61.38(C-15)
OAC:169.39,169.55,170.28,20.49,21.10,21.47
OiBu:175.88,34.02,18.41,18.58
OBz:165.72,129.23,129.40,128.64,133.40
Celangulatin C（苦皮藤素C）
13C NMR(100MHz,CDCl3)：δC：75.07（C-1），67.31（C-2），41.19（C-3），72.14（C-4），91.45（C-5），76.90（C-6），53.48（C-7），74.17（C-8），75.34（C-9），50.64（C-10），84.58（C-11），30.05（C-12），26.28（C-13），24.20（C-14），61.73（C-15）
OAC:169.44,169.54,169.95,20.44,21.10,20.82
OiBu：176.72，34.34，19.05，19.12
OBz：165.63，129.49，129.28,129.66,133.47
苦皮藤素XIX
13C NMR(100MHz,CDCl3)δC:75.08(C-1),67.37(C-2),41.28(C-3),72.17(C-4),91.51(C-5),76.84(C-6),53.39(C-7),74.71(C-8),75.08(C-9),50.06(C-10),84.57(C-11),30.05(C-12),26.31(C-13),24.23(C-14),61.76(C-15)
OAC:169.47*,169.59*,20.43,21.15(*归属可互换)
OiBu-15:176.74,34.37,19.15,19.15
OBz-9:165.74,129.27,129.46,128.62,133.44
实施例1
（1）35%T9苦皮藤素原药甲制备方法
将筛分后符合规定（24目）的苦皮藤根和皮，依次加入体积为3︰2︰2倍量、质量比为95%的乙醇于80℃下回流提取3次，每次提取2h，过滤，合并三次滤液，减压浓缩至密度0.95的滤液。取该滤液，用它重量为1倍量的HP20树脂装柱（径高比：10:1），先后以20%乙醇、40%乙醇、80%乙醇和95%乙醇冲柱（冲柱的乙醇的体积分别浓缩后滤液的25，30，40和20倍），收集80%乙醇洗脱液，减 压蒸干，即得35%T9苦皮藤素原药甲。
（2）35%T9苦皮藤素原药甲质量检测方法
①特征提取物制备
取35%T9苦皮藤素原药甲1g，加入六倍量（6mL）氯仿，80℃下回流提取30min，过滤后减压浓缩，回收溶剂至干，即得35%T9苦皮藤素原药甲特征提取物。
②特征提取物IGD核磁共振碳谱指纹图谱检测
取上述特征提取物65mg，溶于0.5mL CDCl3中，作IGD核磁共振碳谱指纹图谱。
③IGD核磁共振碳谱指纹图谱解析
1）鉴别
35%T9苦皮藤素原药甲特征提取物的IGD核磁共振碳谱指纹图谱中，清楚地显示4-OH-β-二氢沉香呋喃倍半萜多醇酯类化合物的特征信号。根据其母核信号及其C-15特征峰信号的化学位移，确证9个4-OH-β-二氢沉香呋喃倍半萜多醇酯类化合物苦皮素A、B、C、E、F、G、H、celangulatin C、苦皮藤素XIX在IGD核磁共振碳谱指纹图谱中均有相应的NMR信号。IGD核磁共振碳谱指纹图谱见附图1-a和1-b。
2）35%T9苦皮藤素原药甲各活性成分比例测定结果如下：
3）35%T9苦皮藤素原药甲中苦皮素B浓度含量测定结果如下：
| 称取原药质量 | 200mg |
| 35%T9苦皮藤素原药甲中苦皮素B质量浓度 | 161.62ug/mL |
| 35%T9苦皮藤素原药甲中苦皮素B质量百分含量 | 8.08% |
4）35%T9苦皮藤素原药甲含量测定结果如下：
下表中苦皮素C+苦皮素F的分子式是以苦皮素C作为代表的分子式，苦皮素A+苦皮素E+celangulatin C+苦皮藤素XIX的分子式是以苦皮素A作为代表的分子式（以下实施例均同实施例1）。
实施例2
（1）35%T9苦皮藤素原药乙的制备方法
将筛分后符合规定（24目）的苦皮藤根和皮，依次加入体积为3︰3︰3倍量、质量比为95%的乙醇于60℃下回流提取3次，每次提取1.5h，过滤，合并三次滤液，减压浓缩至密度1.09的滤液。取该滤液，用它重量为2倍量的D-101树脂装柱（径高比：10:1），先后以25%乙醇、50%乙醇、85%乙醇和90%乙醇冲柱（冲柱的乙醇的体积分别浓缩后滤液的25，30，40和20倍），收集85%乙醇洗脱液，减压蒸干，即得35%T9苦皮藤素原药乙。
（2）35%T9苦皮藤素原药乙质量检测方法
①特征提取物制备
取35%T9苦皮藤素原药乙1g，加入六倍量（6mL）氯仿，85℃下回流提取40min，过滤后减压浓缩，回收溶剂至干，即得35%T9苦皮藤素原药乙特征提取物。
②特征提取物IGD核磁共振碳谱指纹图谱检测
同实施例1。
③IGD核磁共振碳谱指纹图谱解析
1）鉴别
35%T9苦皮藤素原药乙特征提取物的IGD核磁共振碳谱指纹图 谱中，清楚地显示4-OH-β-二氢沉香呋喃倍半萜多醇酯类化合物的特征信号。根据其母核信号及其C-15特征峰信号的化学位移，确证9个4-OH-β-二氢沉香呋喃倍半萜多醇酯类化合物苦皮素A、B、C、E、F、G、H、celangulatin C、苦皮藤素XIX在IGD核磁共振碳谱指纹图谱中均有相应的NMR信号。IGD核磁共振碳谱指纹图谱见附图2-a和2-b。
2）35%T9苦皮藤素原药乙各活性成分比例测定结果如下：
3）35%T9苦皮藤素原药乙中苦皮素B浓度含量测定结果如下：
| 称取原药质量 | 200mg |
| 35%T9苦皮藤素原药乙中苦皮素B质量浓度 | 163.56ug/mL |
| 35%T9苦皮藤素原药乙中苦皮素B质量百分含量 | 8.18% |
4）35%T9苦皮藤素原药乙含量测定结果如下：
实施例3
（1）35%T9苦皮藤素原药丙制备方法
将筛分后符合规定（10目）的苦皮藤根和皮，依次加入体积为6︰6倍量、质量比为95%乙醇60℃下超声提取2次，每次提取1h，过滤，合并2次滤液，减压浓缩至密度1.19的滤液。取该滤液，用它重量为1倍量的HP20树脂装柱（径高比：12:1），先后以20%乙醇、50%乙醇、75%乙醇和95%乙醇冲柱（冲柱的乙醇的体积分别浓缩后滤液的25，30，40和20倍），收集75%乙醇洗脱液，减压蒸干，即得35%T9苦皮藤素原药丙。
（2）35%T9苦皮藤素原药丙质量检测方法
①特征提取物制备
取35%T9苦皮藤素原药丙1g，加入12倍量（12mL）氯仿，75℃下超声提取20min，过滤后减压浓缩，回收溶剂至干，即得35%T9苦皮藤素原药丙特征提取物。
②特征提取物IGD核磁共振碳谱指纹图谱检测
取上述特征提取物60mg，溶于0.5mL CDCl3中，作IGD核磁共振碳谱指纹图谱。
③IGD核磁共振碳谱指纹图谱解析
1）鉴别
35%T9苦皮藤素原药丙特征提取物的IGD核磁共振碳谱指纹图谱中，清楚地显示4-OH-β-二氢沉香呋喃倍半萜多醇酯类化合物的特征信号。根据其母核信号及其C-15特征峰信号的化学位移，确证9个4-OH-β-二氢沉香呋喃倍半萜多醇酯类化合物苦皮素A、B、C、E、F、G、H、celangulatin C、苦皮藤素XIX在IGD核磁共振碳谱指纹图谱中均有相应的NMR信号。IGD核磁共振碳谱指纹图谱见附图3-a和3-b。
2）35%T9苦皮藤素原药丙各活性成分比例测定结果如下：
3）35%T9苦皮藤素原药丙中苦皮素B浓度含量测定结果如下：
| 称取原药质量 | 200mg |
| 35%T9苦皮藤素原药丙中苦皮素B质量浓度 | 160.41ug/mL |
| 35%T9苦皮藤素原药丙中苦皮素B质量百分含量 | 8.02% |
4）35%T9苦皮藤素原药丙含量测定结果如下：
实施例4
（1）3%T9苦皮藤素水乳剂配制
将检测合格的35%T9苦皮藤素原药置于反应釜中，按照配比量加入下表中的辅料（乳化剂和抗冻剂），搅拌，再加溶剂至规定含量，搅拌至完全溶解，得到3%T9苦皮藤素水乳剂。配制比例见下表。
（2）苦皮藤素水乳剂梨木虱和梨黄木虱田间药效实验
参照农业部农药检定所生测室制定的农药田间药效试验准则进行。
1）材料与方法
a．试验对象
试验对象为梨木虱和梨黄木虱。选择宁陵酥梨作为试验作物。
b．试验田位置及情况
宁陵三处梨园进行试验。选择对象为单干形的果树或小的孤立树，供试验梨树品种均匀一致，所有试验小区的土壤类型、肥力、耕作均匀一致，且符合当地科学的农业实践。
2）试验设计和安排
a．试验药剂及实施情况
药剂：3%苦皮藤素水乳剂（上面表格中含苦皮藤素原药甲9%的水乳剂），1%苦皮藤素乳油（新乡市东风市化工厂）。
供试制剂是3%苦皮藤素水乳剂，稀释倍数分别为800倍、1000倍、1500倍用喷药车进行均匀喷洒，小区面积：10~15棵梨树，并设保护行。重复次数：3次重复。每小区调查6株，每株按五个方位固定5个短枝，每枝调查100片固定叶上的活动虫数，施药前调查基数，每次施药后1天、3天、7天各调查一次。
b．使用器械
选用的是当地常用喷雾设备，所使用器械类型和操作条件（操作压力、喷孔口径）均匀一致。施药药量准确、分布均匀。用药量偏差不超过10%。
c．气象资料
初次施药于2011年5月26日进行，试验当天为晴天少云天气，平均气温20.5℃。为卵孵初盛期。
3）药效计算方法
防治效果按式计算：
防效(％)=[1一处理区药后活虫数×对照区药前活虫数／(对照区药后活虫数×处理区药前活虫数)]×100
4）对作物的直接影响
整个实验过程中，3%苦皮藤素水乳剂各个稀释倍数对梨树及果实均无影响，梨树生长正常。
5）结果
3%苦皮藤素水乳剂稀释成800倍防效效果较好，其药后5天的防治效果为88.84%~91.54%；明显优于对照药剂1%苦皮藤素乳油对水稀释800倍防效。
按照本实施例配制的其他水乳剂和上述给出田间试验的水乳剂效果相似，以上述给出田间试验的水乳剂为最优。
实施例5
（1）3%T9苦皮藤素水乳剂苦皮藤素系数计算
取实施例1-2的35%T9苦皮藤素原药甲、乙（陕西宝鸡）苦皮藤素总系数的平均值作为苦皮藤素原药（陕西宝鸡）苦皮藤素总系数。
取实施例3的35%T9苦皮藤素原药丙（陕西华县）苦皮藤素总系数作为苦皮藤素原药（陕西华县）苦皮藤素总系数。
| 药材产地 | 苦皮藤素原药苦皮藤素总系数 |
| 陕西宝鸡 | 4.61 |
| 陕西华县 | 5.41 |
（2）3%T9苦皮藤素水乳剂苦皮素B浓度含量测定结果如下：
（3）3%T9苦皮藤素水乳剂苦皮藤素含量计算
。
Claims (16)
1.一种苦皮藤素原药，含有以下质量百分含量的活性成分：苦皮素A6.0～9.5%，苦皮素B7.5～9.5%，苦皮素C和苦皮素F4.0～6.5%，苦皮素G6.5～10.5%，苦皮素A、苦皮素E、苦皮藤素C和苦皮藤素XIX11.5～15.5%，苦皮素H3.5～6.0%；所述活性成分均为4-OH-β-二氢沉香呋喃倍半萜多醇酯类化合物；
所述苦皮藤素原药的制备方法，包括：称取苦皮藤根或/和皮粉碎，加入体积为2～6倍量、90～95%的乙醇于60～80℃下回流或超声提取2～3次，每次提取1～2小时，过滤后合并滤液，减压浓缩；取浓缩后的滤液，用其重量为1～2倍量的大孔吸附树脂装柱，先后以20～25%乙醇、40～50%乙醇、75%～85%乙醇和90～95%乙醇冲柱，收集75%～85%乙醇洗脱液，减压蒸干，即得苦皮藤素原药。
2.根据权利要求1的苦皮藤素原药，其特征在于，其中苦皮藤素C的质量百分含量为0.5～2.0%，苦皮藤素XIX的质量百分含量为0.4～1.5%。
3.根据权利要求1或2所述的苦皮藤素原药，其特征在于，4-OH-β-二氢沉香呋喃倍半萜多醇酯类化合物总的质量百分含量不小于35%。
4.根据权利要求1或2所述的苦皮藤素原药，其特征在于，4-OH-β-二氢沉香呋喃倍半萜多醇酯类化合物总的质量百分含量为35.0～45.0%。
5.权利要求1～4任意一项所述苦皮藤素原药的制备方法，包括：称取苦皮藤根或/和皮粉碎，加入体积为2～6倍量、90～95%的乙醇于60～80℃下回流或超声提取2～3次，每次提取1～2小时，过滤后合并滤液，减压浓缩；取浓缩后的滤液，用其重量为1～2倍量的大孔吸附树脂装柱，先后以20～25%乙醇、40～50%乙醇、75%～85%乙醇和90～95%乙醇冲柱，收集75%～85%乙醇洗脱液，减压蒸干，即得苦皮藤素原药。
6.一种苦皮藤素水乳剂，包含权利要求1～4任意一项所述的苦皮藤素原药。
7.根据权利要求6所述的苦皮藤素水乳剂，其特征在于，包括以下重量份的成分：所述苦皮藤素原药8～10份，乳化剂8～12份，抗冻剂3～5份。
8.根据权利要求7所述的苦皮藤素水乳剂，其特征在于，所述乳化剂为：烷基芳基聚氧乙烯聚氧丙烯醚或烷基芳基聚氧乙烯聚氧乙烯醚；所述抗冻剂为：乙二醇或丙二醇。
9.根据权利要求6～8任意一项所述的苦皮藤素水乳剂，其特征在于，该苦皮藤素水乳剂中4-OH-β-二氢沉香呋喃倍半萜多醇酯类化合物的总的质量百分含量不小于3%。
10.根据权利要求6～8任意一项所述的苦皮藤素水乳剂，其特征在于，该苦皮藤素水乳剂中4-OH-β-二氢沉香呋喃倍半萜多醇酯类化合物的总的质量百分含量为3.0～4.0%。
11.一种权利要求1～4任意一项所述苦皮藤素原药的质量检测方法，包括以下步骤：
1）对所述苦皮藤素原药进行提取，得到含有活性成分组的苦皮藤素原药特征提取物；
2）对苦皮藤素原药特征提取物进行IGD核磁共振碳谱指纹图谱检测，根据指纹图谱得到所述苦皮藤素原药特征提取物中若干个活性成分特征峰峰强度；并用相同方式测定出所述各活性成分相应的标准参照品的特征峰峰强度；
3）通过定量分析手段测定得到苦皮藤素原药中所述标准参照品的绝对含量；
4）利用各活性成分特征峰峰强度及相应的标准参照品的特征峰峰强度的比值和所述绝对含量，计算出苦皮藤素原药中各活性成分的含量及活性成分组的含量；
所述标准参照品为苦皮素B；
步骤4）中，计算各活性成分的含量的偶联公式为：
W1为步骤3）用定量分析手段测定的苦皮藤素原药中某一活性成分对应的标准参照品的绝对含量；
M1为所述某一活性成分对应的标准参照品的分子量；
h1为由IGD核磁共振碳谱指纹图谱测定的苦皮藤素原药特征提取物中所述某一活性成分对应的标准参照品的特征峰峰强度；
Wn为苦皮藤素原药中某一活性成分的质量百分含量；
Mn为某一活性成分的分子量；
hn为由IGD核磁共振碳谱指纹图谱测定的苦皮藤素原药特征提取物中某一活性成分的特征峰峰强度。
12.根据权利要求11所述的质量检测方法，其特征在于，所述苦皮藤素原药特征提取物的制备方法，包括：称取苦皮藤素原药，加入体积为6～12倍的氯仿，75～85℃下超声或回流提取20～40min，过滤后减压浓缩，回收溶剂至干，即得苦皮藤素原药特征提取物。
13.根据权利要求11所述的质量检测方法，其特征在于，步骤2）中，所述苦皮藤素原药特征提取物中的活性成分特征峰为：C-15吸收峰，其化学位移为δC60.0～66.0；选择C-8作为特征峰进一步区别苦皮素A、苦皮素E、苦皮藤素C和苦皮藤素XIX，C-8的化学位移为δC73.3～74.7；选择C-9作为特征峰进一步区别苦皮素C和苦皮素F，C-9的化学位移为δC70.6～72.6。
14.根据权利要求11～13任意一项所述的质量检测方法，其特征在于，步骤3）中，所述标准参照品的绝对含量是指：用定量分析手段测定的苦皮藤素原药中标准参照品的质量百分含量；所述定量分析手段为高效液相色谱法。
15.根据权利要求11所述的质量检测方法，其特征在于，计算苦皮藤素原药中各活性成分的系数和总系数的公式为：
其中Fn为苦皮藤素原药中某一活性成分与其对应的标准参照品质量百分含量的比值系数；M1、h1、Mn和hn的含义同权利要求11中的相应定义，总系数指各活性成分的系数Fn之和。
16.一种权利要求6～10任意一项所述苦皮藤素水乳剂的质量检测方法，利用权利要求11～15任意一项所述方法检测得到苦皮藤素原药中各活性成分的含量，再利用以下公式推算出苦皮藤素水乳剂中各活性成分的质量百分含量：Xn=X1Fn；其中：
Xn为苦皮藤素水乳剂中某一活性成分质量百分含量；
X1为用定量分析手段测定得到的苦皮藤素水乳剂中某一活性成分对应的标准参照品的绝对含量；
Fn为权利要求15所述的苦皮藤素原药中某一活性成分与其对应的标准参照品质量百分含量的比值系数；
苦皮藤素水乳剂中活性成分组的含量为各活性成分Xn相加之和；该苦皮藤素水乳剂由苦皮藤素原药制备得到。
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| 李广领等.新型植物源农药苦皮藤素的研究综述.《安徽农业科学》.2006,第34卷(第21期),第5594-5595页. |
| 李衍方等.杀虫植物苦皮藤的研究新进展.《农药》.2006,第45卷(第3期),第148-150，154页. |
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