CN105669415B - 一种从小叶莲中提取分离半日花烷型二萜类化合物的方法及其应用 - Google Patents

一种从小叶莲中提取分离半日花烷型二萜类化合物的方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及从小叶莲中提取半日花烷型二萜类化合物的方法及其应用，有效解决从小叶莲中提取半日花烷型二萜类化合物及纯度测定和制备抗乳腺癌、肝癌药物中的应用问题，将小叶莲用乙醇提取，将乙醇提取物混悬于蒸馏水中，依次以石油醚、二氯甲烷萃取，将二氯甲烷萃取部位上硅胶柱，石油醚‑丙酮洗脱，收集215个流份，合并流份1–50、51–134、135–178、179–215，得到组份Fr.1‑Fr.4；将组份Fr.4上Sephadex LH‑20柱，甲醇洗脱，收集22个流份，合并流份1–4、5–22，得到亚组份Fr.4‑1、Fr.4‑2；将亚组份Fr.4‑2经开放ODS柱色谱，甲醇‑水洗脱，收集45个流份，硅胶薄层色谱检测分析，分别合并含有labda‑7,13‑diene‑3,15‑diol (I)和14,15‑dinor‑3β‑hydroxy‑7‑labden‑13‑one (II)的流份，本发明方法稳定可靠，易操作，有效用于制备抗乳腺癌、肝癌药物。

Description

一种从小叶莲中提取分离半日花烷型二萜类化合物的方法及 其应用
技术领域
本发明涉及医药，特别是一种从小叶莲中提取分离半日花烷型二萜类化合物的方法及其应用。
背景技术
恶性肿瘤已经成为当前严重影响人类健康、威胁人类生命的主要疾病之一。具有疗程长、难治愈的特点。在世界卫生组织第18届国际抗癌症联盟大会上的一项研究报告表明，未来20年内新增患病人数将由目前的每年1000万增加到1500万，因癌症而死亡的人数也将由每年600万增至1000万。全球癌症状况将日益严重，在我国恶性肿瘤死亡率位居全部疾病死亡率之首。目前临床上广泛使用的合成的抗肿瘤药物普遍存在着毒副作用如脱发、贫血和胃肠不适等现象。因此加强抗肿瘤药物的研究，延长患者的生存期，改善患者的生活质量是药学工作者的当务之急。中草药在抗肿瘤方面的应用历史悠久，从中草药中寻找高效低毒的抗肿瘤活性物质，研制选择性强、毒副作用低的新型抗肿瘤药物是药学科研工作者迫切解决的首要问题。
小叶莲是小檗科桃儿七属植物鬼臼Sinopodophyllum emodi(Wall.)Ying.的干燥成熟果实。鬼臼是一种具有悠久历史的药用植物，古代《神农本草经》中就有记载：杀大毒，疗咳嗽喉疾，风邪烦感，失魄妄见。不入汤。以后的历代本草亦多有记载，主要用于活血散结、祛风除湿、虫蛇咬伤、跌打、心胃痛、风寒咳嗽、月经不调、铁棒锤中毒、风湿筋骨痛及气管炎等症。鬼臼分布比较广泛，我国主要分布在四川、青海、西藏、甘肃、陕西。小叶莲作为传统藏药始载于《月王药诊》，具有悠久的药用历史。化学成分研究表明主要含有木脂素和黄酮类化合物，而半日花烷型二萜类化合物首次在该属植物中被发现。本发明所涉及的从小叶莲中制备半日花烷型二萜类化合物及其抗肝癌和乳腺癌活性，迄今为止未见有专利或文献报道。
由于生物合成的复杂性，天然产物的结构也复杂多样。以常规的色谱学方法为主的分离纯化手段往往很难将结构非常相似的天然产物分离开来，而天然产物中混有痕量的高活性的杂质会导致生物活性的错误结论。据相关报道，天然产物熊果酸具有120种生物活性，有些生物活性在不同的文献中是完全相反的，如抗菌活性，细胞毒活性。出现这样结论的原因是，测试活性所用的熊果酸样品不是单一的熊果酸化学实体，与其共存的杂质严重影响了活性结果。因此建立完善的天然产物纯度评价方法是其准确的生物活性评价的必要条件。同时高纯度的天然产物也是相关药材质量评价所必须的。因此天然产物的纯度评价是非常重要的。
半日花烷型二萜是以十氢萘环合而成的母核为基本骨架的二萜。具有抗炎、抗癌、保肝利胆、降血糖、抗生育等作用。此类化合物的纯度可以通过薄层色谱和高效液相色谱法测定，这两种纯度鉴定方法不仅需要相应的对照品、操作方法复杂耗时长，而且由于天然产物特别是半日花烷型二萜类化合物的结构多样性和复杂性，容易产生误差。定量核磁共振氢谱法，由于其操作快速简便、样品消耗量少、同时给出定性的结构信息和定量分析结果，特别是定量核磁共振氢谱法不依赖于被测物的高纯度标准品，因此定量分析的成本大大降低。利用定量核磁共振氢谱法进行半日花烷型二萜类化合物的纯度测定是一项非常重要的研究工作。但至今尚未见到采用定量核磁共振氢谱法测定具有7(8)双键的半日花烷型二萜类化合物的纯度的公开报道。
发明内容
针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种从小叶莲中提取半日花烷型二萜类化合物的方法及其应用，可有效解决从小叶莲中提取分离(制备)半日花烷型二萜类化合物及纯度测定和制备抗乳腺癌、肝癌药物中的应用问题。
本发明解决的技术方案是，所述的从小叶莲中提取半日花烷型二萜类化合物为labda-7,13-diene-3,15-diol(I)和14,15-dinor-3β-hydroxy-7-labden-13-one(II)，分子结构式分别为：
其制备方法是，将小叶莲6–9kg用小叶莲重量2–5倍、体积浓度为75％–95％的乙醇加热回流提取3次，提取温度为90–95℃，提取时间为1.5–2小时，减压回收乙醇得浸膏状乙醇提取物，将乙醇提取物混悬于2–3.2L的蒸馏水中，依次以石油醚、二氯甲烷萃取3次，每次2–3.2L；将二氯甲烷萃取部位上硅胶柱，依次用体积比为100:0、100:5、100:7、100:10、100:30的石油醚-丙酮混合溶剂进行梯度洗脱，每一梯度用10–15L洗脱液，流速为10–15mLmin-1，每200–300ml体积为一流份，收集215个流份，各个流份用GF254薄层板，以体积比1︰1的石油醚-丙酮作为展开剂，以体积比10︰90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3–5min，进行硅胶薄层色谱检测，根据硅胶薄层色谱检测结果合并流份1–50、51–134、135–178、179–215，得到组份Fr.1、组份Fr.2、组份Fr.3和组份Fr.4；将组份Fr.4上Sephadex LH-20柱，用甲醇洗脱，流速为1–2mLmin-1，每5–10mL为一流份，收集22个流份，各个流份用GF254薄层板，以体积比3︰1的石油醚-丙酮作为展开剂，以体积比10︰90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3–5min，进行硅胶薄层色谱检测分析，根据硅胶薄层色谱检测结果合并流份1–4、5–22，得到亚组份Fr.4-1、亚组份Fr.4-2；将亚组份Fr.4-2经开放ODS柱色谱，用体积比40:60、50:50、60:40、80:20的甲醇-水作洗脱液进行洗脱，流速为1-5mLmin-1，每3–7ml体积为一流份，共收集45个流份，各个流份用GF254薄层板，以体积比4︰1的二氯甲烷-丙酮作为展开剂，以体积比10︰90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3–5min，进行硅胶薄层色谱检测分析，分别合并含有目标物labda-7,13-diene-3,15-diol(I)和14,15-dinor-3β-hydroxy-7-labden-13-one(II)的流份，并分别进行纯度测定，得到labda-7,13-diene-3,15-diol(I)和14,15-dinor-3β-hydroxy-7-labden-13-one(II)。
该方法制备的labda-7,13-diene-3,15-diol(I)和14,15-dinor-3β-hydroxy-7-labden-13-one(II)具有抗乳腺癌、肝癌的活性，实现labda-7,13-diene-3,15-diol(I)和14,15-dinor-3β-hydroxy-7-labden-13-one(II)在制备抗乳腺癌、肝癌药物中的应用。
本发明方法稳定可靠，易操作，所得产物经(1H-NMR、13C-NMR、DEPT、1H-1H COSY、HSQC、HMBC、NOESY)及高分辨质谱(HR-ESI-MS)光谱技术鉴定为半日花烷型二萜类化合物labda-7,13-diene-3,15-diol(I)和14,15-dinor-3β-hydroxy-7-labden-13-one(II)，并对人乳腺癌细胞株MCF-7和人肝癌细胞HepG2具有细胞毒活性，有效用于制备抗乳腺癌、肝癌药物，开拓了小叶莲的药用价值，是抗乳腺癌、肝癌药物上的创新，有显著的经济和社会效益。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体实施方式作详细说明。
本发明在具体实施中可由以下实施例给出。
实施例1
本发明在具体实施中，是将小叶莲9kg用小叶莲重量3倍、体积浓度为95％的乙醇加热回流提取3次，提取温度为95℃，提取时间为1.5小时，减压回收乙醇得浸膏状乙醇提取物，将乙醇提取物混悬于3.2L的蒸馏水中，依次以石油醚、二氯甲烷萃取3次，每次3.2L；将二氯甲烷萃取部位上硅胶柱，依次用体积比为100:0、100:5、100:7、100:10、100:30的石油醚-丙酮混合溶剂进行梯度洗脱，每一梯度用15L洗脱液，流速为15mLmin-1，每300ml体积为一流份，收集215个流份，各个流份用GF254薄层板，以体积比1︰1的石油醚-丙酮作为展开剂，以体积比10︰90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热5min，进行硅胶薄层色谱检测，根据硅胶薄层色谱检测结果合并流份1–50、51–134、135–178、179–215，得到组份Fr.1、组份Fr.2、组份Fr.3和组份Fr.4；将组份Fr.4上Sephadex LH-20柱，用甲醇洗脱，流速为2mLmin-1，每10mL为一流份，收集22个流份，各个流份用GF254薄层板，以体积比3︰1的石油醚-丙酮作为展开剂，以体积比10︰90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热5min，进行硅胶薄层色谱检测分析，根据硅胶薄层色谱检测结果合并流份1–4、5–22，得到亚组份Fr.4-1、亚组份Fr.4-2；将亚组份Fr.4-2经开放ODS柱色谱，用体积比40:60、50:50、60:40、80:20的甲醇-水作洗脱液进行洗脱，流速为3mLmin-1，每7ml体积为一流份，共收集45个流份，各个流份用GF254薄层板，以体积比4︰1的二氯甲烷-丙酮作为展开剂，以体积比10︰90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3min，进行硅胶薄层色谱检测分析，分别合并含有目标物labda-7,13-diene-3,15-diol(I)和14,15-dinor-3β-hydroxy-7-labden-13-one(II)的流份，并分别进行纯度测定，得到labda-7,13-diene-3,15-diol(I)和14,15-dinor-3β-hydroxy-7-labden-13-one(II)。
实施例2
本发明在具体实施中，也可将小叶莲6kg用小叶莲重量5倍、体积浓度为75％的乙醇加热回流提取3次，提取温度为92℃，提取时间为1.8小时，减压回收乙醇得浸膏状乙醇提取物，将乙醇提取物混悬于2L的蒸馏水中，依次以石油醚、二氯甲烷萃取3次，每次2L；将二氯甲烷萃取部位上硅胶柱，依次用体积比为100:0、100:5、100:7、100:10、100:30的石油醚-丙酮混合溶剂进行梯度洗脱，每一梯度用10L洗脱液，流速为10mLmin-1，每200ml体积为一流份，收集215个流份，各个流份用GF254薄层板，以体积比1︰1的石油醚-丙酮作为展开剂，以体积比10︰90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3min，进行硅胶薄层色谱检测，根据硅胶薄层色谱检测结果合并流份1–50、51–134、135–178、179–215，得到组份Fr.1、组份Fr.2、组份Fr.3和组份Fr.4；将组份Fr.4上Sephadex LH-20柱，用甲醇洗脱，流速为1mLmin-1，每6mL为一流份，收集22个流份，各个流份用GF254薄层板，以体积比3︰1的石油醚-丙酮作为展开剂，以体积比10︰90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热4min，进行硅胶薄层色谱检测分析，根据硅胶薄层色谱检测结果合并流份1–4、5–22，得到亚组份Fr.4-1、亚组份Fr.4-2；将亚组份Fr.4-2经开放ODS柱色谱，用体积比40:60、50:50、60:40、80:20的甲醇-水作洗脱液进行洗脱，流速为5mLmin-1，每5ml体积为一流份，共收集45个流份，各个流份用GF254薄层板，以体积比4︰1的二氯甲烷-丙酮作为展开剂，以体积比10︰90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热4min，进行硅胶薄层色谱检测分析，分别合并含有目标物labda-7,13-diene-3,15-diol(I)和14,15-dinor-3β-hydroxy-7-labden-13-one(II)的流份，并分别进行纯度测定，得到labda-7,13-diene-3,15-diol(I)和14,15-dinor-3β-hydroxy-7-labden-13-one(II)。
实施例3
本发明在具体实施中，还可将小叶莲7kg用小叶莲重量4倍、体积浓度为80％的乙醇加热回流提取3次，提取温度为93℃，提取时间为2小时，减压回收乙醇得浸膏状乙醇提取物，将乙醇提取物混悬于2.5L的蒸馏水中，依次以石油醚、二氯甲烷萃取3次，每次2.5L；将二氯甲烷萃取部位上硅胶柱，依次用体积比为100:0、100:5、100:7、100:10、100:30的石油醚-丙酮混合溶剂进行梯度洗脱，每一梯度用13L洗脱液，流速为13mLmin-1，每260ml体积为一流份，收集215个流份，各个流份用GF254薄层板，以体积比1︰1的石油醚-丙酮作为展开剂，以体积比10︰90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3min，进行硅胶薄层色谱检测，根据硅胶薄层色谱检测结果合并流份1–50、51–134、135–178、179–215，得到组份Fr.1、组份Fr.2、组份Fr.3和组份Fr.4；将组份Fr.4上Sephadex LH-20柱，用甲醇洗脱，流速为2mLmin-1，每8mL为一流份，收集22个流份，各个流份用GF254薄层板，以体积比3︰1的石油醚-丙酮作为展开剂，以体积比10︰90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热5min，进行硅胶薄层色谱检测分析，根据硅胶薄层色谱检测结果合并流份1–4、5–22，得到亚组份Fr.4-1、亚组份Fr.4-2；将亚组份Fr.4-2经开放ODS柱色谱，用体积比40:60、50:50、60:40、80:20的甲醇-水作洗脱液进行洗脱，流速为5mLmin-1，每5ml体积为一流份，共收集45个流份，各个流份用GF254薄层板，以体积比4︰1的二氯甲烷-丙酮作为展开剂，以体积比10︰90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热5min，进行硅胶薄层色谱检测分析，分别合并含有目标物labda-7,13-diene-3,15-diol(I)和14,15-dinor-3β-hydroxy-7-labden-13-one(II)的流份，并分别进行纯度测定，得到labda-7,13-diene-3,15-diol(I)和14,15-dinor-3β-hydroxy-7-labden-13-one(II)。
实施例4
本发明在具体实施中，还可是将小叶莲8kg用小叶莲重量4倍、体积浓度为85％的乙醇加热回流提取3次，提取温度为95℃，提取时间为1.5小时，减压回收乙醇得浸膏状乙醇提取物，将乙醇提取物混悬于2.8L的蒸馏水中，依次以石油醚、二氯甲烷萃取3次，每次2.8L；将二氯甲烷萃取部位上硅胶柱，依次用体积比为100:0、100:5、100:7、100:10、100:30的石油醚-丙酮混合溶剂进行梯度洗脱，每一梯度用14L洗脱液，流速为14mLmin-1，每280ml体积为一流份，收集215个流份，各个流份用GF254薄层板，以体积比1︰1的石油醚-丙酮作为展开剂，以体积比10︰90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热4min，进行硅胶薄层色谱检测，根据硅胶薄层色谱检测结果合并流份1–50、51–134、135–178、179–215，得到组份Fr.1、组份Fr.2、组份Fr.3和组份Fr.4；将组份Fr.4上Sephadex LH-20柱，用甲醇洗脱，流速为1.5mLmin-1，每9mL为一流份，收集22个流份，各个流份用GF254薄层板，以体积比3︰1的石油醚-丙酮作为展开剂，以体积比10︰90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热4min，进行硅胶薄层色谱检测分析，根据硅胶薄层色谱检测结果合并流份1–4、5–22，得到亚组份Fr.4-1、亚组份Fr.4-2；将亚组份Fr.4-2经开放ODS柱色谱，用体积比40:60、50:50、60:40、80:20的甲醇-水作洗脱液进行洗脱，流速为1mLmin-1，每4ml体积为一流份，共收集45个流份，各个流份用GF254薄层板，以体积比4︰1的二氯甲烷-丙酮作为展开剂，以体积比10︰90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热4min，进行硅胶薄层色谱检测分析，分别合并含有目标物labda-7,13-diene-3,15-diol(I)和14,15-dinor-3β-hydroxy-7-labden-13-one(II)的流份，并分别进行纯度测定，得到labda-7,13-diene-3,15-diol(I)和14,15-dinor-3β-hydroxy-7-labden-13-one(II)。
发明内容部分技术方案所制备的labda-7,13-diene-3,15-diol(I)和14,15-dinor-3β-hydroxy-7-labden-13-one(II)，以及实施例1-4所制备的labda-7,13-diene-3,15-diol(I)和14,15-dinor-3β-hydroxy-7-labden-13-one(II)，其纯度测定方法是：
称取6-15mg的内标物，溶解于0.8-1.2mL的CDCl3中，制备成内标物溶液；称取40-55mg的半日花烷型二萜类化合物，溶解于0.8-1.2mL的CDCl3中，制备成目标分析物溶液；量取80-120μL的内标物溶液、180-220μL的目标分析物溶液、180-220μL的CDCl3，转移到离心管中，制成样品溶液，将样品溶液混悬25-35s，转移至核磁管中，进行定量核磁测试，定量核磁测试的条件：扫描次数(NS)为8次、16次或32次，光谱宽度(SW)为15-25ppm，弛豫时间(D1)为16-35s，测试温度20-30℃，脉冲角度为30°、或45°、或90°，采集时间(AQ)2.5-3.5s，测定内标物上烯氢质子和半日花烷型二萜H-7的峰面积，得出目标分析物相对于内标物的摩尔质量比，再通过目标分析物与内标物的质量比依据公式：
计算出目标分析物的纯度PX，其中：
Ix为目标分析物的峰面积；IStd为内标的峰面积；Nx为目标分析物的原子核的数目；NStd为内标的原子核的数目；Mx为目标分析物的摩尔质量；MStd为内标的摩尔质量；Mx为目标分析物的质量；mStd为内标的质量；Px为目标分析物的纯度；PStd为内标物的纯度；
所述的内标物为1,4-二硝基苯，吡嗪，二甲基甲酰胺中的任一种。
所述的labda-7,13-diene-3,15-diol(I)和14,15-dinor-3β-hydroxy-7-labden-13-one(II)和纯度测定方法，还可以是：
实施例5
所述的labda-7,13-diene-3,15-diol(I)和14,15-dinor-3β-hydroxy-7-labden-13-one(II)和纯度测定方法是，称取12.60mg的1,4-二硝基苯，溶解于1.0mL的CDCl3中，制备成1,4-二硝基苯内标物溶液；称取44.95mg的labda-7,13-diene-3,15-diol，溶解于1.0mL的CDCl3中，制备成labda-7,13-diene-3,15-diol目标分析物溶液；量取100μL的1,4-二硝基苯内标物溶液，200μL的labda-7,13-diene-3,15-diol目标分析物溶液，200μL的CDCl3，转移到离心管中，即得样品溶液，将样品溶液混悬30s，转移至核磁管中，进行定量核磁测试，所述的定量核磁测试的条件：扫描次数16次；光谱宽度(SW)，15ppm；弛豫时间(D1)，16s；测试温度，25℃；脉冲角度，90°；采集时间(AQ)，3.2s；测定1,4-二硝基苯上芳香质子和labda-7,13-diene-3,15-diol的H-7的峰面积，得出labda-7,13-diene-3,15-diol相对于1,4-二硝基苯的摩尔质量比，再通过去labda-7,13-diene-3,15-diol与1,4-二硝基苯的质量比依据公式计算出labda-7,13-diene-3,15-diol的纯度。
实施例6
本发明所述的纯度测定方法包括以下步骤：称取12.75mg的1,4-二硝基苯，溶解于1.0mL的CDCl3中，制备成1,4-二硝基苯内标物溶液；称取41.05mg的14,15-dinor-3β-hydroxy-7-labden-13-one，溶解于1.0mL的CDCl3中，制备成14,15-dinor-3β-hydroxy-7-labden-13-one目标分析物溶液；量取100μL的1,4-二硝基苯内标物溶液，200μL的14,15-dinor-3β-hydroxy-7-labden-13-one目标分析物溶液，200μL的CDCl3，转移到离心管中，即得样品溶液；将该样品溶液混悬30s，转移至核磁管中，进行定量核磁测试，所述的定量核磁测试的条件：扫描次数(NS)，8；光谱宽度(SW)，20ppm；弛豫时间(D1)，16s；测试温度，25℃；脉冲角度，30°；采集时间(AQ)，2.2s；测定1,4-二硝基苯上芳香质子和14,15-dinor-3β-hydroxy-7-labden-13-one的H-7的峰面积，得出14,15-dinor-3β-hydroxy-7-labden-13-one相对于1,4-二硝基苯的摩尔质量比，再通过14,15-dinor-3β-hydroxy-7-labden-13-one与1,4-二硝基苯的质量比依据公式计算出14,15-dinor-3β-hydroxy-7-labden-13-one的纯度。
实施例7
本发明所述的纯度测定方法包括以下步骤：称取6.95mg的吡嗪，溶解于1.0mL的CDCl3中，制备成1,4-吡嗪内标物溶液；称取53.19mg的labda-7,13-diene-3,15-diol，溶解于1.0mL的CDCl3中，制备成labda-7,13-diene-3,15-diol目标分析物溶液；量取100μL的吡嗪内标物溶液，200μL的labda-7,13-diene-3,15-diol目标分析物溶液，200μL的CDCl3，转移到离心管中，即得样品溶液，将该样品溶液混悬30s，转移至核磁管中，进行定量核磁测试，所述的定量核磁测试的条件：扫描次数(NS)，32；光谱宽度(SW)，25ppm；弛豫时间(D1)，35s；测试温度，30℃；脉冲角度，90°；采集时间(AQ)，3.5s；测定吡嗪烯氢质子和labda-7,13-diene-3,15-diol的H-7的峰面积，得出labda-7,13-diene-3,15-diol相对于1,4-二硝基苯的摩尔质量比，再通过labda-7,13-diene-3,15-diol与吡嗪的质量比依据公式计算出labda-7,13-diene-3,15-diol的纯度。
实施例8
本发明所述的纯度测定方法包括以下步骤：称取6.84mg的二甲基甲酰胺，溶解于1.0mL的CDCl3中，制备成二甲基甲酰胺内标物溶液；称取48.84mg的labda-7,13-diene-3,15-diol，溶解于1.0mL的CDCl3中，制备成labda-7,13-diene-3,15-diol目标分析物溶液；量取100μL的二甲基甲酰胺内标物溶液，200μL的labda-7,13-diene-3,15-diol目标分析物溶液，200μL的CDCl3，转移到离心管中，即得样品溶液，将该样品溶液混悬30s，转移至核磁管中，进行定量核磁测试，所述的定量核磁测试的条件：扫描次数(NS)，16；光谱宽度(SW)，15ppm；弛豫时间(D1)，16s；测试温度，20℃；脉冲角度，45°；采集时间(AQ)，3.2s；测定二甲基甲酰胺的质子和labda-7,13-diene-3,15-diol的H-7的峰面积，得出labda-7,13-diene-3,15-diol相对于二甲基甲酰胺的摩尔质量比，再通过labda-7,13-diene-3,15-diol与二甲基甲酰胺的质量比依据公式计算出labda-7,13-diene-3,15-diol的纯度。
上述实施例5-8的参数和半日花烷型二萜类化合物纯度的结果如下表
本发明方法稳定可靠，可以准确地测定半日花烷型二萜类化合物的纯度，有关实验资料如下：
1.实验材料
labda-7,13-diene-3,15-diol。1,4-二硝基苯购买于日本东京化成工业株式会社。色谱甲醇购买于天津四友精细化学品有限公司，CDCl3购买于剑桥同位素实验室。定量核磁谱图采用Bruker Avance 500MHz核磁共振仪测定。高效液相色谱采用WatersAlliance 2695分离系统和Empower色谱工作站进行测定。
2.方法学确证
2.1.线性考察
精确称取一定量的labda-7,13-diene-3,15-diol和1,4-二硝基苯于5ml的样品管中，加0.5ml的CDCl3溶解，得到不同摩尔比例(0.946、0.6291、0.3078、1.516、2.947)的labda-7,13-diene-3,15-diol和1,4-二硝基苯的混合标准样品溶液。通过对定量核磁共振法测定的labda-7,13-diene-3,15-diol与1,4-二硝基苯摩尔比和重量分析法测定的摩尔比进行线性回归，得出线性方程，Y＝1.011X–0.008，R2＝0.999。表明该方法具有良好的线性。线性样品的制备及测试结果见表1。
表1线性样品的制备和测试结果
2.2.专属性
通过测定标准样品溶液中可能存在的干扰的核磁氢信号考察来考察该方法的专属性。测试结果表明，化学位移从δ5.3至9.0这一范围内，基线是平的，目标测试物中的H-7和1,4-二硝基苯上的芳氢质子信号没有收到任何氢信号的干扰，峰形是对称的，且这两个信号的信噪比大于1000。因此该方法的专属性较强。
2.3.准确性
通过测定三组样品的平均回收率和相对标准偏差(RSD)来考察该方法的精确性。结果见表2，三组样品的平均回收为99.8％，相对标准偏差(RSD)为0.39％。说明该方法能够准确地测定半日花烷型二萜类化合物的纯度。
表2. labda-7,13-diene-3,15-diol的准确性测定结果，
组号 labda-7,13-diene-3,15-diol 1.4-二硝基苯(mg) 纯度(％) 回收率(％)
Set-1 8.99 1.26 98.11 99.9
Set-1 8.05 1.27 98.20 100.0
Set-1 8.57 1.30 98.14 99.9
Set-2 10.38 1.17 98.13 99.9
Set-2 10.59 1.09 98.15 99.9
Set-2 11.01 1.18 98.17 100.0
Set-3 13.28 1.15 97.01 98.8
Set-3 13.10 1.10 98.19 100.0
Set-3 13.64 1.29 98.22 100.0
Mean 98.04 99.8
RSD(％) 0.39
2.4.精密度
日内精密度和日间精密度的结果分别见表3和表4。日内精密度和日间精密度的相对标准偏差(RSD)分别为0.51％和0.62％，表明该方法精密度良好。
表3 labda-7,13-diene-3,15-diol的日内精密度测定结果
编号 labda-7,13-diene-3,15-diol(mg) 1.4-二硝基苯(mg) 纯度(％)
1 8.86 1.26 97.01
2 8.99 1.26 98.40
3 8.57 1.32 97.98
4 8.96 1.37 98.41
5 8.07 1.54 97.85
6 8.21 1.40 97.91
Mean 97.93
RSD(％) 0.51
表4 labda-7,13-diene-3,15-diol的日间精密度测定结果
编号 labda-7,13-diene-3,15-diol(mg) 1.4-二硝基苯(mg) 纯度(％)
1 8.86 1.26 97.15
2 8.99 1.26 98.42
3 8.57 1.32 97.99
4 8.96 1.37 98.50
5 8.07 1.54 98.07
6 8.21 1.40 97.07
Mean 97.87
RSD(％) 0.62
2.5.稳定性
制备好的标准样品溶液分别在0、8、16和24小时后测定纯度，RSD为0.24％，表明样品溶液在24小时内是稳定存在的。结果见表5。
表5 labda-7,13-diene-3,15-diol的稳定性测定结果
2.6.定量核磁测定法和高效液相色谱法对半日花烷型二萜类化合物纯度测定的比较实验
为进一步确证该方法的准确性，采用高效液相色谱法对半日花烷型二萜类化合物的纯度进行了测定。液相色谱条件为，甲醇-水梯度洗脱(35-75％，0-20min；75-100％，20-40min)；流速1.5ml/ml；柱温25℃；ELSD气化室温度40℃；氮气压力2.5×105Pa。统计结果表明，定量核磁测定法和高效液相色谱法对半日花烷型二萜类化合物纯度的测定结果是基本一致的。具体见表6。
表6定量核磁测定法和高效液相色谱法对半日花烷型二萜类化合物纯度的测定结果
根据本实验的分析结果，与传统的高效液相色谱方法相比，定量核磁共振氢谱法具有以下优点：①快速。对于每个定量核磁共振样品的前处理及分析需要15min即可。而高效液相色谱法每个样品的前处理和分析共计55min(样品前处理5min；色谱柱平衡10min；色谱分析40min)。每个样品定量核磁共振氢谱法可节约时间40min。②可行性。定量核磁共振氢谱法检测的是氢核，对于有机化合物来说氢核是普遍存在的，无论目标分析物和与其共存的有机杂质结构如何，定量核磁共振氢谱法都能对其准确的检测出来。高效液相色谱法，需要目标物的标准品约10mg,labda-7,13-diene-3,15-diol和14,15-dinor-3β-hydroxy-7-labden-13-one在市场上很难买到，因此对于这两种半日花烷型二萜类化合物的绝对纯度测定无法通过高效液相色谱法进行测定。上述实验可以清楚的表明，本发明公开了半日花烷型二萜类化合物纯度测定方法，定量核磁共振氢谱法可以快速地测定半日花烷型二萜类化合物的纯度，将为半日花烷型二萜类化合物进一步准确的生物活性评价和相关药材的质量控制提供了前期基础，为天然产物的纯度评价做出创造性贡献。
本发明方法稳定可靠，易操作，所得产物经(1H-NMR、13C-NMR、DEPT、1H-1H COSY、HSQC、HMBC、NOESY)及高分辨质谱(HR-ESI-MS)光谱技术鉴定为半日花烷型二萜类化合物labda-7,13-diene-3,15-diol(I)和14,15-dinor-3β-hydroxy-7-labden-13-one(II)，并对人乳腺癌细胞株MCF-7和人肝癌细胞HepG2具有细胞毒活性，有效用于制备抗乳腺癌、肝癌药物，开拓了小叶莲的药用价值，是抗乳腺癌、肝癌药物上的创新，并经实验和测试，取得了非常满意的有益技术效果，有关资料如下：
1.实验材料
人肝癌细胞株(HepG2)和人乳腺癌细胞株MCF-7由中国医学科学院药物研究所提供，胎牛血清购自Gibco公司。
2.细胞培养
HepG2和MCF-7细胞培养于含有10％经加热灭活的胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素的RPMI1640培养基中，将培养瓶置于37℃，5％CO2饱和湿度培养箱培养，每1～2天换培养液一次。当细胞生长到足以覆盖瓶底壁的大部分表面时，用0.25％胰蛋白酶消化，传代。
3.MTT法
对数生长期细胞培养于96孔培养板内，每孔100μL(含4000个肿瘤细胞)，置37℃、5％CO2温箱中培养。次日，给药组加入含有不同浓度的测试化合物的稀释液，设4–5个剂量组，每组至少设五个平行孔。对照组加入与给药组等体积的溶剂。置37℃、5％CO2温箱中培养。2天后弃培养液，每孔加50μL(1mg/ml)MTT溶液(培养基配置)。37℃孵育4小时，弃去上清液，每孔加入DMSO 200μL溶解甲簪颗粒，轻度振荡溶解。用酶标仪，在检测波长490nm条件下测定光密度值(OD)，以溶剂对照处理的细胞为对照组，用下面公式计算药物对细胞的抑制率，根据计算得到的各浓度的抑制率通过SPSS 13.0软件处理得到半数抑制浓度(IC50)，重复测试3次，取平均值为最终结果。
4.实验结果
通过MTT法采用人肝癌细胞株(HepG2)和人乳腺癌细胞株(MCF-7)对labda-7,13-diene-3,15-diol(I)和14,15-dinor-3β-hydroxy-7-labden-13-one(II)进行细胞毒活性测试，结果见Table 1。
Table 1化合物I-II对HepG2和MCF-7细胞的细胞毒活性(IC50,μM)
化合物 MCF-7 HepG2
I 5.73±0.46 3.85±0.29
II 50.2±5.0 39.1±4.7
通过大量的实验证实，本发明制备出的半日花烷型二萜类化合物labda-7,13-diene-3,15-diol(I)和14,15-dinor-3β-hydroxy-7-labden-13-one(II)对人肝癌细胞(HepG2)和乳腺癌细胞(MCF-7)具有细胞毒活性，具有制备临床上抗肝癌和乳腺癌药物的前景。
由以上清楚的表明，本发明方法易操作，稳定可靠，生产效率高，产品纯度高，不但开拓了小叶莲的新用途，而且为小叶莲提取分离得到的具有7(8)双键的半日花烷型二萜类化合物纯度的测定提供了准确可靠的方法，保证该产品的质量，有效用于制备抗乳腺癌、肝癌的药物，具有很强的实用性，经济和社会效益显著。

Claims (9)

1.一种从小叶莲中提取分离半日花烷型二萜类化合物的制备方法，其特征在于，该化合物为labda-7,13-diene-3,15-diol(I)和14,15-dinor-3β-hydroxy-7-labden-13-one(II)，分子结构式分别为：
其制备方法是，将小叶莲6–9kg用小叶莲重量2–5倍、体积浓度为75％–95％的乙醇加热回流提取3次，提取温度为90–95℃，提取时间为1.5–2小时，减压回收乙醇得浸膏状乙醇提取物，将乙醇提取物混悬于2–3.2L的蒸馏水中，依次以石油醚、二氯甲烷萃取3次，每次2–3.2L；将二氯甲烷萃取部位上硅胶柱，依次用体积比为100:0、100:5、100:7、100:10、100:30的石油醚-丙酮混合溶剂进行梯度洗脱，每一梯度用10–15L洗脱液，流速为10–15mLmin-1，每200–300ml体积为一流份，收集215个流份，各个流份用GF254薄层板，以体积比1︰1的石油醚-丙酮作为展开剂，以体积比10︰90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3–5min，进行硅胶薄层色谱检测，根据硅胶薄层色谱检测结果合并流份1–50、51–134、135–178、179–215，得到组份Fr.1、组份Fr.2、组份Fr.3和组份Fr.4；将组份Fr.4上Sephadex LH-20柱，用甲醇洗脱，流速为1–2mLmin-1，每5–10mL为一流份，收集22个流份，各个流份用GF254薄层板，以体积比3︰1的石油醚-丙酮作为展开剂，以体积比10︰90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3–5min，进行硅胶薄层色谱检测分析，根据硅胶薄层色谱检测结果合并流份1–4、5–22，得到亚组份Fr.4-1、亚组份Fr.4-2；将亚组份Fr.4-2经开放ODS柱色谱，用体积比40:60、50:50、60:40、80:20的甲醇-水作洗脱液进行洗脱，流速为1-5mLmin-1，每3–7ml体积为一流份，共收集45个流份，各个流份用GF254薄层板，以体积比4︰1的二氯甲烷-丙酮作为展开剂，以体积比10︰90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3–5min，进行硅胶薄层色谱检测分析，分别合并含有目标物labda-7,13-diene-3,15-diol(I)和14,15-dinor-3β-hydroxy-7-labden-13-one(II)的流份，并分别进行纯度测定，得到labda-7,13-diene-3,15-diol(I)和14,15-dinor-3β-hydroxy-7-labden-13-one(II)。
2.根据权利要求1所述的从小叶莲中提取分离半日花烷型二萜类化合物的制备方法，其特征在于，将小叶莲9kg用小叶莲重量3倍、体积浓度为95％的乙醇加热回流提取3次，提取温度为95℃，提取时间为1.5小时，减压回收乙醇得浸膏状乙醇提取物，将乙醇提取物混悬于3.2L的蒸馏水中，依次以石油醚、二氯甲烷萃取3次，每次3.2L；将二氯甲烷萃取部位上硅胶柱，依次用体积比为100:0、100:5、100:7、100:10、100:30的石油醚-丙酮混合溶剂进行梯度洗脱，每一梯度用15L洗脱液，流速为15mLmin-1，每300ml体积为一流份，收集215个流份，各个流份用GF254薄层板，以体积比1︰1的石油醚-丙酮作为展开剂，以体积比10︰90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热5min，进行硅胶薄层色谱检测，根据硅胶薄层色谱检测结果合并流份1–50、51–134、135–178、179–215，得到组份Fr.1、组份Fr.2、组份Fr.3和组份Fr.4；将组份Fr.4上Sephadex LH-20柱，用甲醇洗脱，流速为2mLmin-1，每10mL为一流份，收集22个流份，各个流份用GF254薄层板，以体积比3︰1的石油醚-丙酮作为展开剂，以体积比10︰90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热5min，进行硅胶薄层色谱检测分析，根据硅胶薄层色谱检测结果合并流份1–4、5–22，得到亚组份Fr.4-1、亚组份Fr.4-2；将亚组份Fr.4-2经开放ODS柱色谱，用体积比40:60、50:50、60:40、80:20的甲醇-水作洗脱液进行洗脱，流速为3mLmin-1，每7ml体积为一流份，共收集45个流份，各个流份用GF254薄层板，以体积比4︰1的二氯甲烷-丙酮作为展开剂，以体积比10︰90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3min，进行硅胶薄层色谱检测分析，分别合并含有目标物labda-7,13-diene-3,15-diol(I)和14,15-dinor-3β-hydroxy-7-labden-13-one(II)的流份，并分别进行纯度测定，得到labda-7,13-diene-3,15-diol(I)和14,15-dinor-3β-hydroxy-7-labden-13-one(II)。
3.根据权利要求1所述的从小叶莲中提取分离半日花烷型二萜类化合物的制备方法，其特征在于，将小叶莲6kg用小叶莲重量5倍、体积浓度为75％的乙醇加热回流提取3次，提取温度为92℃，提取时间为1.8小时，减压回收乙醇得浸膏状乙醇提取物，将乙醇提取物混悬于2L的蒸馏水中，依次以石油醚、二氯甲烷萃取3次，每次2L；将二氯甲烷萃取部位上硅胶柱，依次用体积比为100:0、100:5、100:7、100:10、100:30的石油醚-丙酮混合溶剂进行梯度洗脱，每一梯度用10L洗脱液，流速为10mLmin-1，每200ml体积为一流份，收集215个流份，各个流份用GF254薄层板，以体积比1︰1的石油醚-丙酮作为展开剂，以体积比10︰90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3min，进行硅胶薄层色谱检测，根据硅胶薄层色谱检测结果合并流份1–50、51–134、135–178、179–215，得到组份Fr.1、组份Fr.2、组份Fr.3和组份Fr.4；将组份Fr.4上Sephadex LH-20柱，用甲醇洗脱，流速为1mLmin-1，每6mL为一流份，收集22个流份，各个流份用GF254薄层板，以体积比3︰1的石油醚-丙酮作为展开剂，以体积比10︰90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热4min，进行硅胶薄层色谱检测分析，根据硅胶薄层色谱检测结果合并流份1–4、5–22，得到亚组份Fr.4-1、亚组份Fr.4-2；将亚组份Fr.4-2经开放ODS柱色谱，用体积比40:60、50:50、60:40、80:20的甲醇-水作洗脱液进行洗脱，流速为5mLmin-1，每5ml体积为一流份，共收集45个流份，各个流份用GF254薄层板，以体积比4︰1的二氯甲烷-丙酮作为展开剂，以体积比10︰90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热4min，进行硅胶薄层色谱检测分析，分别合并含有目标物labda-7,13-diene-3,15-diol(I)和14,15-dinor-3β-hydroxy-7-labden-13-one(II)的流份，并分别进行纯度测定，得到labda-7,13-diene-3,15-diol(I)和14,15-dinor-3β-hydroxy-7-labden-13-one(II)。
4.根据权利要求1所述的从小叶莲中提取分离半日花烷型二萜类化合物的制备方法，其特征在于，将小叶莲7kg用小叶莲重量4倍、体积浓度为80％的乙醇加热回流提取3次，提取温度为93℃，提取时间为2小时，减压回收乙醇得浸膏状乙醇提取物，将乙醇提取物混悬于2.5L的蒸馏水中，依次以石油醚、二氯甲烷萃取3次，每次2.5L；将二氯甲烷萃取部位上硅胶柱，依次用体积比为100:0、100:5、100:7、100:10、100:30的石油醚-丙酮混合溶剂进行梯度洗脱，每一梯度用13L洗脱液，流速为13mLmin-1，每260ml体积为一流份，收集215个流份，各个流份用GF254薄层板，以体积比1︰1的石油醚-丙酮作为展开剂，以体积比10︰90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3min，进行硅胶薄层色谱检测，根据硅胶薄层色谱检测结果合并流份1–50、51–134、135–178、179–215，得到组份Fr.1、组份Fr.2、组份Fr.3和组份Fr.4；将组份Fr.4上Sephadex LH-20柱，用甲醇洗脱，流速为2mLmin-1，每8mL为一流份，收集22个流份，各个流份用GF254薄层板，以体积比3︰1的石油醚-丙酮作为展开剂，以体积比10︰90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热5min，进行硅胶薄层色谱检测分析，根据硅胶薄层色谱检测结果合并流份1–4、5–22，得到亚组份Fr.4-1、亚组份Fr.4-2；将亚组份Fr.4-2经开放ODS柱色谱，用体积比40:60、50:50、60:40、80:20的甲醇-水作洗脱液进行洗脱，流速为5mLmin-1，每5ml体积为一流份，共收集45个流份，各个流份用GF254薄层板，以体积比4︰1的二氯甲烷-丙酮作为展开剂，以体积比10︰90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热5min，进行硅胶薄层色谱检测分析，分别合并含有目标物labda-7,13-diene-3,15-diol(I)和14,15-dinor-3β-hydroxy-7-labden-13-one(II)的流份，并分别进行纯度测定，得到labda-7,13-diene-3,15-diol(I)和14,15-dinor-3β-hydroxy-7-labden-13-one(II)。
5.根据权利要求1所述的从小叶莲中提取分离半日花烷型二萜类化合物的制备方法，其特征在于，将小叶莲8kg用小叶莲重量4倍、体积浓度为85％的乙醇加热回流提取3次，提取温度为95℃，提取时间为1.5小时，减压回收乙醇得浸膏状乙醇提取物，将乙醇提取物混悬于2.8L的蒸馏水中，依次以石油醚、二氯甲烷萃取3次，每次2.8L；将二氯甲烷萃取部位上硅胶柱，依次用体积比为100:0、100:5、100:7、100:10、100:30的石油醚-丙酮混合溶剂进行梯度洗脱，每一梯度用14L洗脱液，流速为14mLmin-1，每280ml体积为一流份，收集215个流份，各个流份用GF254薄层板，以体积比1︰1的石油醚-丙酮作为展开剂，以体积比10︰90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热4min，进行硅胶薄层色谱检测，根据硅胶薄层色谱检测结果合并流份1–50、51–134、135–178、179–215，得到组份Fr.1、组份Fr.2、组份Fr.3和组份Fr.4；将组份Fr.4上Sephadex LH-20柱，用甲醇洗脱，流速为1.5mLmin-1，每9mL为一流份，收集22个流份，各个流份用GF254薄层板，以体积比3︰1的石油醚-丙酮作为展开剂，以体积比10︰90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热4min，进行硅胶薄层色谱检测分析，根据硅胶薄层色谱检测结果合并流份1–4、5–22，得到亚组份Fr.4-1、亚组份Fr.4-2；将亚组份Fr.4-2经开放ODS柱色谱，用体积比40:60、50:50、60:40、80:20的甲醇-水作洗脱液进行洗脱，流速为1mLmin-1，每4ml体积为一流份，共收集45个流份，各个流份用GF254薄层板，以体积比4︰1的二氯甲烷-丙酮作为展开剂，以体积比10︰90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热4min，进行硅胶薄层色谱检测分析，分别合并含有目标物labda-7,13-diene-3,15-diol(I)和14,15-dinor-3β-hydroxy-7-labden-13-one(II)的流份，并分别进行纯度测定，得到labda-7,13-diene-3,15-diol(I)和14,15-dinor-3β-hydroxy-7-labden-13-one(II)。
6.权利要求1-5任一项所述的从小叶莲中提取分离半日花烷型二萜类化合物的制备方法，其特征在于，所述的纯度测定，方法是，称取6-15mg的内标物，溶解于0.8-1.2mL的CDCl3中，制备成内标物溶液；称取40-55mg的半日花烷型二萜类化合物，溶解于0.8-1.2mL的CDCl3中，制备成目标分析物溶液；量取80-120μL的内标物溶液、180-220μL的目标分析物溶液、180-220μL的CDCl3，转移到离心管中，制成样品溶液，将样品溶液混悬25-35s，转移至核磁管中，进行定量核磁测试，定量核磁测试的条件：扫描次数为8-32次，光谱宽度为15-25ppm，弛豫时间为16-35s，测试温度20-30℃，脉冲角度为30°、或45°、或90°，采集时间2.5-3.5s，测定内标物上烯氢质子和半日花烷型二萜H-7的峰面积，得出目标分析物相对于内标物的摩尔质量比，再通过目标分析物与内标物的质量比依据公式：
<mrow> <msub> <mi>P</mi> <mi>X</mi> </msub> <mo>=</mo> <mfrac> <msub> <mi>I</mi> <mi>X</mi> </msub> <msub> <mi>I</mi> <mrow> <mi>S</mi> <mi>t</mi> <mi>d</mi> </mrow> </msub> </mfrac> <mo>&amp;CenterDot;</mo> <mfrac> <msub> <mi>N</mi> <mrow> <mi>S</mi> <mi>t</mi> <mi>d</mi> </mrow> </msub> <msub> <mi>N</mi> <mi>X</mi> </msub> </mfrac> <mo>&amp;CenterDot;</mo> <mfrac> <msub> <mi>M</mi> <mi>X</mi> </msub> <msub> <mi>M</mi> <mrow> <mi>S</mi> <mi>t</mi> <mi>d</mi> </mrow> </msub> </mfrac> <mo>&amp;CenterDot;</mo> <mfrac> <msub> <mi>m</mi> <mrow> <mi>S</mi> <mi>t</mi> <mi>d</mi> </mrow> </msub> <mi>m</mi> </mfrac> <mo>&amp;CenterDot;</mo> <msub> <mi>P</mi> <mrow> <mi>S</mi> <mi>t</mi> <mi>d</mi> </mrow> </msub> </mrow> 3
计算出目标分析物的纯度PX，其中：
Ix为目标分析物的峰面积；IStd为内标的峰面积；Nx为目标分析物的原子核的数目；NStd为内标的原子核的数目；Mx为目标分析物的摩尔质量；MStd为内标的摩尔质量；Mx为目标分析物的质量；mStd为内标的质量；Px为目标分析物的纯度；PStd为内标物的纯度；
所述的内标物为1,4-二硝基苯，吡嗪，二甲基甲酰胺中的任一种。
7.根据权利要求6所述的从小叶莲中提取分离半日花烷型二萜类化合物的制备方法，其特征在于，所述的纯度测定，方法是，称取12.60mg的1,4-二硝基苯，溶解于1.0mL的CDCl3中，制备成1,4-二硝基苯内标物溶液；称取44.95mg的labda-7,13-diene-3,15-diol，溶解于1.0mL的CDCl3中，制备成labda-7,13-diene-3,15-diol目标分析物溶液；量取100μL的1,4-二硝基苯内标物溶液，200μL的labda-7,13-diene-3,15-diol目标分析物溶液，200μL的CDCl3，转移到离心管中，即得样品溶液，将样品溶液混悬30s，转移至核磁管中，进行定量核磁测试，所述的定量核磁测试的条件：扫描次数16次；光谱宽度，15ppm；弛豫时间16s；测试温度，25℃；脉冲角度，90°；采集时间，3.2s；测定1,4-二硝基苯上芳香质子和labda-7,13-diene-3,15-diol的H-7的峰面积，得出labda-7,13-diene-3,15-diol相对于1,4-二硝基苯的摩尔质量比，再通过去labda-7,13-diene-3,15-diol与1,4-二硝基苯的质量比依据公式计算出labda-7,13-diene-3,15-diol的纯度。
8.根据权利要求6所述的从小叶莲中提取分离半日花烷型二萜类化合物的制备方法，其特征在于，所述的纯度测定，方法是，称取12.75mg的1,4-二硝基苯，溶解于1.0mL的CDCl3中，制备成1,4-二硝基苯内标物溶液；称取41.05mg的14,15-dinor-3β-hydroxy-7-labden-13-one，溶解于1.0mL的CDCl3中，制备成14,15-dinor-3β-hydroxy-7-labden-13-one目标分析物溶液；量取100μL的1,4-二硝基苯内标物溶液，200μL的14,15-dinor-3β-hydroxy-7-labden-13-one目标分析物溶液，200μL的CDCl3，转移到离心管中，即得样品溶液；将该样品溶液混悬30s，转移至核磁管中，进行定量核磁测试，所述的定量核磁测试的条件：扫描8次；光谱宽度，20ppm；弛豫时间16s；测试温度，25℃；脉冲角度，30°；采集时间，2.2s；测定1,4-二硝基苯上芳香质子和14,15-dinor-3β-hydroxy-7-labden-13-one的H-7的峰面积，得出14,15-dinor-3β-hydroxy-7-labden-13-one相对于1,4-二硝基苯的摩尔质量比，再通过14,15-dinor-3β-hydroxy-7-labden-13-one与1,4-二硝基苯的质量比依据公式计算出14,15-dinor-3β-hydroxy-7-labden-13-one的纯度。
9.根据权利要求6所述的从小叶莲中提取分离半日花烷型二萜类化合物的制备方法，其特征在于，所述的纯度测定，方法是，称取6.95mg的吡嗪，溶解于1.0mL的CDCl3中，制备成1,4-吡嗪内标物溶液；称取53.19mg的labda-7,13-diene-3,15-diol，溶解于1.0mL的CDCl3中，制备成labda-7,13-diene-3,15-diol目标分析物溶液；量取100μL的吡嗪内标物溶液，200μL的labda-7,13-diene-3,15-diol目标分析物溶液，200μL的CDCl3，转移到离心管中，即得样品溶液，将该样品溶液混悬30s，转移至核磁管中，进行定量核磁测试，所述的定量核磁测试的条件：扫描32次；光谱宽度，25ppm；弛豫时间35s；测试温度30℃；脉冲角度90°；采集时间3.5s；测定吡嗪烯氢质子和labda-7,13-diene-3,15-diol的H-7的峰面积，得出labda-7,13-diene-3,15-diol相对于1,4-二硝基苯的摩尔质量比，再通过labda-7,13-diene-3,15-diol与吡嗪的质量比依据公式计算出labda-7,13-diene-3,15-diol的纯度。
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