CN105601516B - 一种从小叶莲中提取分离的半日花烷型二萜类化合物及其制备方法与应用 - Google Patents

一种从小叶莲中提取分离的半日花烷型二萜类化合物及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及从小叶莲中提取分离的半日花烷型二萜类化合物及其制备方法与应用，可有效解决从小叶莲中提取分离半日花烷型二萜类化合物及在制备抗肝癌、乳腺癌药物中的应用问题，方法是，将小叶莲用乙醇加热回流提取，将乙醇提取物混悬于蒸馏水中，依次以石油醚、二氯甲烷萃取，将二氯甲烷萃取部位上硅胶柱，用石油醚‑丙酮洗脱，收集168个流份，合并流份1–50、51–134、135–168，得到组份Fr.1‑Fr.3；将组份Fr.3经ODS柱色谱，甲醇‑水梯度洗脱，得亚组份Fr.3‑1、Fr.3‑2、Fr.3‑3；将亚组份Fr.3‑3上硅胶柱，用石油醚‑丙酮洗脱，收集38个流份，硅胶薄层色谱检测，分别合并含有目标物桃儿七萜A和桃儿七萜B的流份，本发明方法稳定可靠，易操作，具有抗乳腺癌和抗肝癌的活性。

Description

一种从小叶莲中提取分离的半日花烷型二萜类化合物及其制 备方法与应用
技术领域
本发明涉及医药，特别是一种从小叶莲中提取分离的半日花烷型二萜类化合物及其制备方法与应用。
背景技术
恶性肿瘤已经成为当前严重影响人类健康、威胁人类生命的主要疾病之一。具有疗程长、难治愈的特点。在世界卫生组织第18届国际抗癌症联盟大会上的一项研究报告表明，未来20年内新增患病人数将由目前的每年1000万增加到1500万，因癌症而死亡的人数也将由每年600万增至1000万。全球癌症状况将日益严重，在我国恶性肿瘤死亡率位居全部疾病死亡率之首。目前临床上广泛使用的合成的抗肿瘤药物普遍存在着毒副作用如脱发、贫血和胃肠不适等现象。因此加强抗肿瘤药物的研究，延长患者的生存期，改善患者的生活质量是药学工作者的当务之急。中草药在抗肿瘤方面的应用历史悠久，从中草药中寻找高效低毒的抗肿瘤活性物质，研制选择性强、毒副作用低的新型抗肿瘤药物是药学科研工作者迫切解决的首要问题。
小叶莲是小檗科桃儿七属植物鬼臼Sinopodophyllum emodi(Wall.)Ying.的干燥成熟果实。鬼臼是一种具有悠久历史的药用植物，古代《神农本草经》中就有记载：杀大毒，疗咳嗽喉疾，风邪烦感，失魄妄见。不入汤。以后的历代本草亦多有记载，主要用于活血散结、祛风除湿、虫蛇咬伤、跌打、心胃痛、风寒咳嗽、月经不调、铁棒锤中毒、风湿筋骨痛及气管炎等症。鬼臼分布比较广泛，我国主要分布在四川、青海、西藏、甘肃、陕西。小叶莲作为传统藏药始载于《月王药诊》，具有悠久的药用历史。化学成分研究表明主要含有木脂素和黄酮类化合物，而半日花烷型二萜类化合物首次在该属植物中被发现。本发明所涉及的新型半日花烷型二萜类化合物及其生物活性，迄今为止未见有专利或文献报道。
发明内容
针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种从小叶莲中提取分离的半日花烷型二萜类化合物及其制备方法与应用，可有效解决从小叶莲中提取分离半日花烷型二萜类化合物及在制备抗肝癌、乳腺癌药物中的应用问题。
本发明解决的技术方案是，一种从小叶莲中提取分离的半日花烷型二萜类化合物为桃儿七萜A(Sinoditerpene A)(Ⅰ)和桃儿七萜B(Sinoditerpene B)(Ⅱ)，分子结构式分别为：
其制备方法是：将小叶莲6–9kg加入小叶莲重量2–5倍、体积浓度为75％–95％的乙醇加热回流提取3次，提取温度为90–95℃，提取时间为1.5–2小时，减压回收乙醇，得浸膏状乙醇提取物，将乙醇提取物混悬于2–3.2L的蒸馏水中，依次以石油醚、二氯甲烷各萃取3次，每次2–3.2L；将二氯甲烷萃取部位上硅胶柱，依次用体积比为100:0、100:5、100:7、100:10的石油醚-丙酮混合溶剂进行梯度洗脱，每一梯度用10–15L洗脱液，流速为10–15mLmin-1，每200–300ml体积为一流份，收集168个流份，各个流份用GF254薄层板，以体积比1︰1的石油醚-丙酮作为展开剂，以体积比10︰90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3–5min，进行硅胶薄层色谱检测分析，根据硅胶薄层色谱检测分析结果，合并流份1–50、51–134、135–168，得到组份Fr.1、组份Fr.2、组份Fr.3；将组份Fr.3经ODS柱色谱，以体积比20-85:15-80的甲醇-水作为洗脱液进行梯度洗脱，分别收集体积比40:60、60:40、85:15的甲醇-水洗脱液，得亚组份Fr.3-1、亚组份Fr.3-2、亚组份Fr.3-3；将亚组份Fr.3-3上硅胶柱，用体积比100:20的石油醚-丙酮洗脱，流速为1–2mLmin-1，每3–7ml为一流份，共收集亚组份Fr.3-3的38个流份，各个流份用GF254薄层板，分别以体积比2-3︰1的石油醚-丙酮作为展开剂，以体积比10︰90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3–5min，由硅胶薄层色谱检测分析，分别合并含有目标物桃儿七萜A和桃儿七萜B的流份，得到桃儿七萜A(I)和桃儿七萜B(II)。
该方法制备的桃儿七萜A(I)和桃儿七萜B(II)具有抗肝癌、乳腺癌的活性，实现桃儿七萜A(I)和桃儿七萜B(II)在制备抗肝癌、乳腺癌药物中的应用。
本发明方法稳定可靠，易操作，首次从小叶莲中制备的半日花烷型二萜类化合物经鉴定为桃儿七萜A、桃儿七萜B(sinoditerpene A、sinoditerpene B)，并具有抗乳腺癌和抗肝癌的活性，开辟了小叶莲的新用途，经济和社会效益显著。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体实施方式作详细说明。
本发明在具体实施中，可由以下实施例实现。
实施例1
本发明在具体实施中，将小叶莲9kg加入小叶莲重量3倍、体积浓度为95％的乙醇加热回流提取3次，提取温度为95℃，提取时间为1.5小时，减压回收乙醇，得浸膏状乙醇提取物，将乙醇提取物混悬于3.2L的蒸馏水中，依次以石油醚、二氯甲烷各萃取3次，每次3.2L；将二氯甲烷萃取部位上硅胶柱，依次用体积比为100:0、100:5、100:7、100:10的石油醚-丙酮混合溶剂进行梯度洗脱，每一梯度用15L洗脱液，流速为15mLmin-1，每300ml体积为一流份，收集168个流份，各个流份用GF254薄层板，以体积比1︰1的石油醚-丙酮作为展开剂，以体积比10︰90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热5min，进行硅胶薄层色谱检测分析，根据硅胶薄层色谱检测分析结果，合并流份1–50、51–134、135–168，得到组份Fr.1、组份Fr.2、组份Fr.3；将组份Fr.3经ODS柱色谱，以体积比20-85:15-80的甲醇-水作为洗脱液进行梯度洗脱，分别收集体积比40:60、60:40、85:15的甲醇-水洗脱液，得亚组份Fr.3-1、亚组份Fr.3-2、亚组份Fr.3-3；将亚组份Fr.3-3上硅胶柱，用体积比100:20的石油醚-丙酮洗脱，流速为2mLmin-1，每7ml为一流份，共收集亚组份Fr.3-3的38个流份，各个流份用GF254薄层板，分别以体积比3︰1的石油醚-丙酮作为展开剂，以体积比10︰90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热5min，由硅胶薄层色谱检测分析，分别合并含有目标物桃儿七萜A和桃儿七萜B的流份，得到桃儿七萜A(I)和桃儿七萜B(II)。
实施例2
本发明在具体实施中，也可以是将小叶莲6kg加入小叶莲重量5倍、体积浓度为75％的乙醇加热回流提取3次，提取温度为92℃，提取时间为1.5小时，减压回收乙醇，得浸膏状乙醇提取物，将乙醇提取物混悬于2L的蒸馏水中，依次以石油醚、二氯甲烷各萃取3次，每次2L；将二氯甲烷萃取部位上硅胶柱，依次用体积比为100:0、100:5、100:7、100:10的石油醚-丙酮混合溶剂进行梯度洗脱，每一梯度用10L洗脱液，流速为10mLmin-1，每200ml体积为一流份，收集168个流份，各个流份用GF254薄层板，以体积比1︰1的石油醚-丙酮作为展开剂，以体积比10︰90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3min，进行硅胶薄层色谱检测分析，根据硅胶薄层色谱检测分析结果，合并流份1–50、51–134、135–168，得到组份Fr.1、组份Fr.2、组份Fr.3；将组份Fr.3经ODS柱色谱，以体积比20-85:15-80的甲醇-水作为洗脱液进行梯度洗脱，分别收集体积比40:60、60:40、85:15的甲醇-水洗脱液，得亚组份Fr.3-1、亚组份Fr.3-2、亚组份Fr.3-3；将亚组份Fr.3-3上硅胶柱，用体积比100:20的石油醚-丙酮洗脱，流速为1mLmin-1，每3ml为一流份，共收集亚组份Fr.3-3的38个流份，各个流份用GF254薄层板，分别以体积比3︰1的石油醚-丙酮作为展开剂，以体积比10︰90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3min，由硅胶薄层色谱检测分析，分别合并含有目标物桃儿七萜A和桃儿七萜B的流份，得到桃儿七萜A(I)和桃儿七萜B(II)。
实施例3
本发明在具体实施中，还可将小叶莲7kg加入小叶莲重量4倍、体积浓度为80％的乙醇加热回流提取3次，提取温度为93℃，提取时间为1.8小时，减压回收乙醇，得浸膏状乙醇提取物，将乙醇提取物混悬于2.5L的蒸馏水中，依次以石油醚、二氯甲烷各萃取3次，每次2.5L；将二氯甲烷萃取部位上硅胶柱，依次用体积比为100:0、100:5、100:7、100:10的石油醚-丙酮混合溶剂进行梯度洗脱，每一梯度用13L洗脱液，流速为13mLmin-1，每260ml体积为一流份，收集168个流份，各个流份用GF254薄层板，以体积比1︰1的石油醚-丙酮作为展开剂，以体积比10︰90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3min，进行硅胶薄层色谱检测分析，根据硅胶薄层色谱检测分析结果，合并流份1–50、51–134、135–168，得到组份Fr.1、组份Fr.2、组份Fr.3；将组份Fr.3经ODS柱色谱，以体积比20-85:15-80的甲醇-水作为洗脱液进行梯度洗脱，分别收集体积比40:60、60:40、85:15的甲醇-水洗脱液，得亚组份Fr.3-1、亚组份Fr.3-2、亚组份Fr.3-3；将亚组份Fr.3-3上硅胶柱，用体积比100:20的石油醚-丙酮洗脱，流速为2mLmin-1，每5ml为一流份，共收集亚组份Fr.3-3的38个流份，各个流份用GF254薄层板，分别以体积比2︰1的石油醚-丙酮作为展开剂，以体积比10︰90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3min，由硅胶薄层色谱检测分析，分别合并含有目标物桃儿七萜A和桃儿七萜B的流份，得到桃儿七萜A(I)和桃儿七萜B(II)。
实施例4
本发明在具体实施中，将小叶莲8kg加入小叶莲重量3倍、体积浓度为90％的乙醇加热回流提取3次，提取温度为95℃，提取时间为1.5小时，减压回收乙醇，得浸膏状乙醇提取物，将乙醇提取物混悬于2.8L的蒸馏水中，依次以石油醚、二氯甲烷各萃取3次，每次2.8L；将二氯甲烷萃取部位上硅胶柱，依次用体积比为100:0、100:5、100:7、100:10的石油醚-丙酮混合溶剂进行梯度洗脱，每一梯度用14L洗脱液，流速为14mLmin-1，每280ml体积为一流份，收集168个流份，各个流份用GF254薄层板，以体积比1︰1的石油醚-丙酮作为展开剂，以体积比10︰90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热4min，进行硅胶薄层色谱检测分析，根据硅胶薄层色谱检测分析结果，合并流份1–50、51–134、135–168，得到组份Fr.1、组份Fr.2、组份Fr.3；将组份Fr.3经ODS柱色谱，以体积比20-85:15-80的甲醇-水作为洗脱液进行梯度洗脱，分别收集体积比40:60、60:40、85:15的甲醇-水洗脱液，得亚组份Fr.3-1、亚组份Fr.3-2、亚组份Fr.3-3；将亚组份Fr.3-3上硅胶柱，用体积比100:20的石油醚-丙酮洗脱，流速为1mLmin-1，每6ml为一流份，共收集亚组份Fr.3-3的38个流份，各个流份用GF254薄层板，分别以体积比3︰1的石油醚-丙酮作为展开剂，以体积比10︰90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热4min，由硅胶薄层色谱检测分析，分别合并含有目标物桃儿七萜A和桃儿七萜B的流份，得到桃儿七萜A(I)和桃儿七萜B(II)。
上述实施例1-4制备的桃儿七萜A(I)和桃儿七萜B(II)具有抗乳腺癌和抗肝癌的活性，有效用于制备抗肝癌、乳腺癌的药物，并经实验和测试取得了非常好的有益技术效果，有关资料如下：
一、化合物的鉴定
经过核磁共振光谱(1H-NMR、13C-NMR、DEPT、1H-1H COSY、HSQC、HMBC、NOESY)及高分辨质谱(HR-ESI-MS)光谱技术鉴定了其化学结构。
化合物I，无色油状物，溶于氯仿、丙酮、乙酸乙酯。254nm下无暗斑，10％硫酸乙醇显紫红色，提示可能为萜类化合物。(c 0.14,CHCl3)。HR-ESI-MS给出准分子离子峰m/z 443.2771[M﹢Na]+(calcd for C25H40O5Na,443.2773)，确定分子式为C25H40O5，不饱和度为6。IR(KBr,cm-1)显示该化合物具有游离羟基(3464cm-1)，羰基(1736cm-1)。1H NMR(500MHz，CDCl3)谱中给出了特征性的半日花烷型二萜骨架质子信号，即两组烯氢质子信号5.38(1H,br.s)，5.32(1H,t,J＝7.2Hz)；两组与烯碳相连的甲基质子信号δ1.67(3H，s)和1.70(3H，s)，连接在脂肪季碳上的甲基信号δ0.74(3H，s)，0.95(3H，s)和0.83(3H，s)；两组连氧脂肪碳上的氢信号，δ3.22(1H,dd,J＝11.2,4.5Hz)，4.64(2H,d,J＝7.2Hz)；五组CH2质子信号δ1.07(1H，td，J＝13.2，4.2Hz)，1.84(1H，dt，J＝13.2，3.4Hz)，1.60(2H,m)，1.95(2H,m)，1.47(1H,m)，1.25(1H,m)，1.95(1H,m)，2.22(1H,m)。还有一组苹果酸单乙酯结构片段δ4.18(2H，q，J＝7.2Hz)，1.26(3H，t，J＝7.2Hz)，3.22(2H,s)。13C NMR(125MHz，CDCl3)和DEPT谱共给出25个碳信号，除了一组苹果酸单乙酯结构单元δ166.7，41.7，166.6，62.3，14.1之外，还给出特征性的半日花烷型二萜骨架碳信号，包括四个烯碳信号δ122.3、135.0、117.9、143.3，五个甲基碳信号δ21.9，16.6，13.6，27.9，15.0；两个连氧sp3杂化碳信号δ79.1，61.5。1H-1H COSY谱中，H-1/H-2，H-2/H-3相关；H-5/H-6，H-6/H-7相关；H-9/H-11及H-11/H-12，从而确定(C-1to C-3)，(C-5to C-7)，(C9to C11to C12)这三部分的连接方式。在HMBC谱中，两个甲基δ0.95(3H,s,H-18)和0.83(3H,s,H-19)均与C-3(79.1)、C-4(38.6)、C-5(49.5)远程相关，一个甲基δ0.74(3H,s，H-20)与C-1(37.2)、C-10(36.6)、C-9(54.3)远程相关，一个甲基δ1.67(3H,s，H-17)与C-9(54.3)、C-8(135.0)、C-7(122.3)远程相关，一个甲基δ1.70(3H,s，H-16)与C-12(41.9)、C-13(143.2)、C-14(117.9)远程相关，因此确定该化合物骨架的平面结构为3,15-dihydroxy-7,13-labdadiene。亚甲基质子δ4.64(2H,d,J＝7.2Hz)与苹果酸结构单元上的羰基δ166.7(C-1′)的HMBC远程相关，确证苹果酸单乙酯结构单元连接在C-15位。
该化合物的相对构型通过NOESY谱确定。3.22(1H,dd,J＝11.2,4.5Hz,H-3)与0.95(3H,s,H-18)、1.16(1H,dd,J＝10.9,6.1Hz,H-5)、1.07(1H,td,J＝13.2,4.2Hz,H-1α)的NOE相关，表明H-3、H-5、H-18、H-1α均处于α键上。由0.83(3H,s,H-19)与0.74(3H,s,H-20)、0.74(3H,s,H-20)与1.25(1H,m,H-11)的NOE相关，表明20位甲基和9位上的侧链均为β取向。由5.32(1H,t,J＝7.2Hz,H-14)与2.22(1H,m,H-12)、1.95(1H,m,H-12)的NOE相关，表明H-13,14位双键为E式取向。将化合物I碱水解，得到水解产物Ia，通过Ia与(–)-labda-7,13-diene-3,15-diol的比旋光度比较发现，该化合物的骨架上的取代基取向与(–)-labda-7,13-diene-3,15-diol一致。因此化合物I的结构为3β-hydroxy-15-(3′-ethoxy-3′-oxopropionyloxy)-7,13E-labdadien，命名为桃儿七萜A(sinoditerpene A)，为一未见文献报道的新化合物：
桃儿七萜A(I)
Table 1.NMR(CDCl3)assignments for I.
化合物II，无色油状物，溶于氯仿、丙酮、乙酸乙酯。254nm下无暗斑，10％硫酸乙醇显紫红色，提示可能为萜类化合物。(c 0.16,CHCl3)。HR-ESI-MS给出准分子离子峰m/z 559.3249[M﹢Na]+(calcd for C30H48O8Na,559.3247)，确定化合物II的分子式为C30H48O8，不饱和度为7。IR(KBr,cm-1)显示该化合物具有游离羟基(3465cm-1)，羰基(1734、1718cm-1)。1H NMR(500MHz，CDCl3)谱中给出了特征性的半日花烷型二萜骨架质子信号，即两组烯氢质子信号5.38(1H,br.s)，5.32(1H,t,J＝7.5Hz)；两个连接在烯碳上的甲基信号δ1.68(6H，s)，三个连接在脂肪季碳上的甲基信号δ0.73(3H，s)，0.95(3H，s)和0.83(3H，s)；两组连氧脂肪碳上的氢信号，δ3.22(1H,dd,J＝11.0,4.8Hz)，4.58(2H,d,J＝7.5Hz)；五组CH2质子信号δ1.06(1H,td,J＝13.1,4.5Hz)，1.84(1H,dt,J＝13.1,3.4Hz)，1.60(2H,m)，1.95(2H,m)，1.50(1H,m)，1.25(1H,m)，1.95(1H,m)，2.20(1H,m)。还有一组3-羟基-3,4-二乙氧酰基丁酰氧基结构片段δ4.12(2H，q，J＝7.2Hz)、1.28(3H，t，J＝7.2Hz)、4.26(2H，q，J＝7.2Hz)、1.26(3H，t，J＝7.2Hz)、2.87(1H，d，J＝15.6Hz)、2.76(1H，d，J＝15.6Hz)、2.87(1H，d，J＝15.6Hz)、2.76(1H，d，J＝15.6Hz)。13C NMR(125MHz，CDCl3)和DEPT共给出30个碳信号，除了一组3-羟基-3,4-二乙氧酰基丁酰氧基结构单元δ14.1、61.0、14.0、62.3、169.80、43.2、73.2、43.3、169.76、173.4之外，还给出特征性的半日花烷型二萜骨架碳信号，包括四个烯碳信号δ122.3、135.0、118.0、143.2，五个甲基碳信号δ21.9、16.6、13.6、27.9、15.0；两个连氧sp3杂化碳信号δ79.1、61.8。1H-1H COSY谱中，H-1/H-2，H-2/H-3相关；H-5/H-6，H-6/H-7相关；H-9/H-11及H-11/H-12，从而确定(C-1to C-3),(C-5to C-7),(C9toC11to C12)这三部分的连接方式。在HMBC谱中，两个甲基δ0.95(3H,s,H-18)和0.83(3H,s,H-19)均与C-3(79.1)、C-4(38.6)、C-5(49.5)远程相关，一个甲基δ0.73(3H,s，H-20)与C-1(37.2)、C-10(36.6)、C-9(54.2)远程相关，一个甲基δ1.68(3H,s，H-17)与C-9(54.2)、C-8(135.0)、C-7(122.3)远程相关，一个甲基δ1.68(3H,s，H-16)与C-12(41.8)、C-13(143.2)、C-14(118.0)远程相关，因此确定该化合物骨架的平面结构为3,15-dihydroxy-7,13-labdadiene。亚甲基质子δ4.58(2H,d,J＝7.2Hz)与3-羟基-3,4-二乙氧酰基丁酰氧基结构片段上的羰基信号δ169.80的HMBC远程相关，确证3-羟基-3,4-二乙氧酰基丁酰氧基结构片段连接在C-15位。
该化合物的相对构型通过NOESY谱确定。3.22(1H,dd,J＝11.0,4.8Hz,H-3)与0.95(3H,s,H-18)、1.17(1H,dd,J＝10.9,6.1Hz,H-5)、1.06(1H,td,J＝13.1,4.5Hz,H-1α)的NOE相关，表明H-3处于α键上。由0.83(3H,s,H-19)与0.73(3H,s,H-20)、0.73(3H,s,H-20)与1.25(1H,m,H-11)的NOE相关，表明20位甲基和9位上的侧链均为β取向。由5.32(1H,t,J＝7.5Hz,H-14)与2.20(1H,m,H-12)、1.95(1H,m,H-12)的NOE相关，表明H-13,14位双键为E式取向。将化合物II碱水解，得到水解产物IIa，通过IIa与(–)-labda-7,13-diene-3,15-diol的比旋光度比较发现，该化合物的骨架上的取代基取向与(–)-labda-7,13-diene-3,15-diol一致。因此化合物II的结构为3β-hydroxy-15-[(3′-hydroxy-3′,4′-bis(ethoxycarbonyl)-butyroxy)]-7,13E-Labdadien，命名为桃儿七萜B(sinoditerpene B)，为一未见文献报道的新化合物：
桃儿七萜B(II)
Table 2.NMR(CDCl3)assignments for II.
本发明方法稳定可靠，其提取分离的新型半日花烷型二萜类化合物桃儿七萜A、桃儿七萜B(sinoditerpene A、sinoditerpene B)经试验，对人乳腺癌细胞株MCF-7和人肝癌细胞HepG2具有细胞毒活性，有关实验资料如下：
1.实验材料
人肝癌细胞株(HepG2)和人乳腺癌细胞株MCF-7由中国医学科学院药物研究所提供，胎牛血清购自Gibco公司。
2.细胞培养
HepG2和MCF-7细胞培养于含有10％经加热灭活的胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素的RPMI1640培养基中，将培养瓶置于37℃，5％CO2饱和湿度培养箱培养，每1～2天换培养液一次。当细胞生长到足以覆盖瓶底壁的大部分表面时，用0.25％胰蛋白酶消化，传代。
3.MTT法
对数生长期细胞培养于96孔培养板内，每孔100μL(含4000个肿瘤细胞)，置37℃、5％CO2温箱中培养。次日，给药组加入含有不同浓度的测试化合物的稀释液，设4–5个剂量组，每组至少设五个平行孔。对照组加入与给药组等体积的溶剂。置37℃、5％CO2温箱中培养。2天后弃培养液，每孔加50μL(1mg/ml)MTT溶液(培养基配置)。37℃孵育4小时，弃去上清液，每孔加入DMSO 200μL溶解甲簪颗粒，轻度振荡溶解。用酶标仪，在检测波长490nm条件下测定光密度值(OD)，以溶剂对照处理的细胞为对照组，用下面公式计算药物对细胞的抑制率，根据计算得到的各浓度的抑制率通过SPSS 13.0软件处理得到半数抑制浓度(IC50)，重复测试3次，取平均值为最终结果。
4.实验结果
通过MTT法采用人肝癌细胞株(HepG2)和人乳腺癌细胞株(MCF-7)对桃儿七萜A、桃儿七萜B(sinoditerpene A、sinoditerpene B)进行细胞毒活性测试，结果见Table 3。
Table 3化合物I-II对HepG2和MCF-7细胞的细胞毒活性(IC50,μM)
化合物 MCF-7 HepG2
桃儿七萜A 74.6±5.5 63.5±6.2
桃儿七萜B 88.3±7.1 75.2±6.8
通过大量的实验证实，本发明制备出的半日花烷型二萜类化合物桃儿七萜A、桃儿七萜B(sinoditerpene A、sinoditerpene B)对人肝癌细胞(HepG2)和乳腺癌细胞(MCF-7)具有细胞毒活性，具有制备临床上抗肝癌和乳腺癌药物的前景，开拓了小叶莲的药用价值，是治疗肝癌、乳腺癌药物上的一大创新，经济和社会效益显著。

Claims (5)

1.一种从小叶莲中提取分离的半日花烷型二萜类化合物的制备方法，其特征在于，该半日花烷型二萜类化合物为桃儿七萜A(Ⅰ)和桃儿七萜B(Ⅱ)，分子结构式分别是：
制备方法是：
将小叶莲6–9kg加入小叶莲重量2–5倍、体积浓度为75％–95％的乙醇加热回流提取3次，提取温度为90–95℃，提取时间为1.5–2小时，减压回收乙醇，得浸膏状乙醇提取物，将乙醇提取物混悬于2–3.2L的蒸馏水中，依次以石油醚、二氯甲烷各萃取3次，每次2–3.2L；将二氯甲烷萃取部位上硅胶柱，依次用体积比为100:0、100:5、100:7、100:10的石油醚-丙酮混合溶剂进行梯度洗脱，每一梯度用10–15L洗脱液，流速为10–15mLmin-1，每200–300ml体积为一流份，收集168个流份，各个流份用GF254薄层板，以体积比1︰1的石油醚-丙酮作为展开剂，以体积比10︰90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3–5min，进行硅胶薄层色谱检测分析，根据硅胶薄层色谱检测分析结果，合并流份1–50、51–134、135–168，得到组份Fr.1、组份Fr.2、组份Fr.3；将组份Fr.3经ODS柱色谱，以体积比20-85:15-80的甲醇-水作为洗脱液进行梯度洗脱，分别收集体积比40:60、60:40、85:15的甲醇-水洗脱液，得亚组份Fr.3-1、亚组份Fr.3-2、亚组份Fr.3-3；将亚组份Fr.3-3上硅胶柱，用体积比100:20的石油醚-丙酮洗脱，流速为1–2mLmin-1，每3–7ml为一流份，共收集亚组份Fr.3-3的38个流份，各个流份用GF254薄层板，分别以体积比2-3︰1的石油醚-丙酮作为展开剂，以体积比10︰90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3–5min，由硅胶薄层色谱检测分析，分别合并含有目标物桃儿七萜A和桃儿七萜B的流份，得到桃儿七萜A(I)和桃儿七萜B(II)。
2.根据权利要求1所述的从小叶莲中提取分离的半日花烷型二萜类化合物的制备方法，其特征在于，将小叶莲9kg加入小叶莲重量3倍、体积浓度为95％的乙醇加热回流提取3次，提取温度为95℃，提取时间为1.5小时，减压回收乙醇，得浸膏状乙醇提取物，将乙醇提取物混悬于3.2L的蒸馏水中，依次以石油醚、二氯甲烷各萃取3次，每次3.2L；将二氯甲烷萃取部位上硅胶柱，依次用体积比为100:0、100:5、100:7、100:10的石油醚-丙酮混合溶剂进行梯度洗脱，每一梯度用15L洗脱液，流速为15mLmin-1，每300ml体积为一流份，收集168个流份，各个流份用GF254薄层板，以体积比1︰1的石油醚-丙酮作为展开剂，以体积比10︰90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热5min，进行硅胶薄层色谱检测分析，根据硅胶薄层色谱检测分析结果，合并流份1–50、51–134、135–168，得到组份Fr.1、组份Fr.2、组份Fr.3；将组份Fr.3经ODS柱色谱，以体积比20-85:15-80的甲醇-水作为洗脱液进行梯度洗脱，分别收集体积比40:60、60:40、85:15的甲醇-水洗脱液，得亚组份Fr.3-1、亚组份Fr.3-2、亚组份Fr.3-3；将亚组份Fr.3-3上硅胶柱，用体积比100:20的石油醚-丙酮洗脱，流速为2mLmin-1，每7ml为一流份，共收集亚组份Fr.3-3的38个流份，各个流份用GF254薄层板，分别以体积比3︰1的石油醚-丙酮作为展开剂，以体积比10︰90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热5min，由硅胶薄层色谱检测分析，分别合并含有目标物桃儿七萜A和桃儿七萜B的流份，得到桃儿七萜A(I)和桃儿七萜B(II)。
3.根据权利要求1所述的从小叶莲中提取分离的半日花烷型二萜类化合物的制备方法，其特征在于，将小叶莲6kg加入小叶莲重量5倍、体积浓度为75％的乙醇加热回流提取3次，提取温度为92℃，提取时间为1.5小时，减压回收乙醇，得浸膏状乙醇提取物，将乙醇提取物混悬于2L的蒸馏水中，依次以石油醚、二氯甲烷各萃取3次，每次2L；将二氯甲烷萃取部位上硅胶柱，依次用体积比为100:0、100:5、100:7、100:10的石油醚-丙酮混合溶剂进行梯度洗脱，每一梯度用10L洗脱液，流速为10mLmin-1，每200ml体积为一流份，收集168个流份，各个流份用GF254薄层板，以体积比1︰1的石油醚-丙酮作为展开剂，以体积比10︰90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3min，进行硅胶薄层色谱检测分析，根据硅胶薄层色谱检测分析结果，合并流份1–50、51–134、135–168，得到组份Fr.1、组份Fr.2、组份Fr.3；将组份Fr.3经ODS柱色谱，以体积比20-85:15-80的甲醇-水作为洗脱液进行梯度洗脱，分别收集体积比40:60、60:40、85:15的甲醇-水洗脱液，得亚组份Fr.3-1、亚组份Fr.3-2、亚组份Fr.3-3；将亚组份Fr.3-3上硅胶柱，用体积比100:20的石油醚-丙酮洗脱，流速为1mLmin-1，每3ml为一流份，共收集亚组份Fr.3-3的38个流份，各个流份用GF254薄层板，分别以体积比3︰1的石油醚-丙酮作为展开剂，以体积比10︰90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3min，由硅胶薄层色谱检测分析，分别合并含有目标物桃儿七萜A和桃儿七萜B的流份，得到桃儿七萜A(I)和桃儿七萜B(II)。
4.根据权利要求1所述的从小叶莲中提取分离的半日花烷型二萜类化合物的制备方法，其特征在于，将小叶莲7kg加入小叶莲重量4倍、体积浓度为80％的乙醇加热回流提取3次，提取温度为93℃，提取时间为1.8小时，减压回收乙醇，得浸膏状乙醇提取物，将乙醇提取物混悬于2.5L的蒸馏水中，依次以石油醚、二氯甲烷各萃取3次，每次2.5L；将二氯甲烷萃取部位上硅胶柱，依次用体积比为100:0、100:5、100:7、100:10的石油醚-丙酮混合溶剂进行梯度洗脱，每一梯度用13L洗脱液，流速为13mLmin-1，每260ml体积为一流份，收集168个流份，各个流份用GF254薄层板，以体积比1︰1的石油醚-丙酮作为展开剂，以体积比10︰90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3min，进行硅胶薄层色谱检测分析，根据硅胶薄层色谱检测分析结果，合并流份1–50、51–134、135–168，得到组份Fr.1、组份Fr.2、组份Fr.3；将组份Fr.3经ODS柱色谱，以体积比20-85:15-80的甲醇-水作为洗脱液进行梯度洗脱，分别收集体积比40:60、60:40、85:15的甲醇-水洗脱液，得亚组份Fr.3-1、亚组份Fr.3-2、亚组份Fr.3-3；将亚组份Fr.3-3上硅胶柱，用体积比100:20的石油醚-丙酮洗脱，流速为2mLmin-1，每5ml为一流份，共收集亚组份Fr.3-3的38个流份，各个流份用GF254薄层板，分别以体积比2︰1的石油醚-丙酮作为展开剂，以体积比10︰90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3min，由硅胶薄层色谱检测分析，分别合并含有目标物桃儿七萜A和桃儿七萜B的流份，得到桃儿七萜A(I)和桃儿七萜B(II)。
5.根据权利要求1所述的从小叶莲中提取分离的半日花烷型二萜类化合物的制备方法，其特征在于，将小叶莲8kg加入小叶莲重量3倍、体积浓度为90％的乙醇加热回流提取3次，提取温度为95℃，提取时间为1.5小时，减压回收乙醇，得浸膏状乙醇提取物，将乙醇提取物混悬于2.8L的蒸馏水中，依次以石油醚、二氯甲烷各萃取3次，每次2.8L；将二氯甲烷萃取部位上硅胶柱，依次用体积比为100:0、100:5、100:7、100:10的石油醚-丙酮混合溶剂进行梯度洗脱，每一梯度用14L洗脱液，流速为14mLmin-1，每280ml体积为一流份，收集168个流份，各个流份用GF254薄层板，以体积比1︰1的石油醚-丙酮作为展开剂，以体积比10︰90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热4min，进行硅胶薄层色谱检测分析，根据硅胶薄层色谱检测分析结果，合并流份1–50、51–134、135–168，得到组份Fr.1、组份Fr.2、组份Fr.3；将组份Fr.3经ODS柱色谱，以体积比20-85:15-80的甲醇-水作为洗脱液进行梯度洗脱，分别收集体积比40:60、60:40、85:15的甲醇-水洗脱液，得亚组份Fr.3-1、亚组份Fr.3-2、亚组份Fr.3-3；将亚组份Fr.3-3上硅胶柱，用体积比100:20的石油醚-丙酮洗脱，流速为1mLmin-1，每6ml为一流份，共收集亚组份Fr.3-3的38个流份，各个流份用GF254薄层板，分别以体积比3︰1的石油醚-丙酮作为展开剂，以体积比10︰90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热4min，由硅胶薄层色谱检测分析，分别合并含有目标物桃儿七萜A和桃儿七萜B的流份，得到桃儿七萜A(I)和桃儿七萜B(II)。
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