CN104945362A

CN104945362A - 一种半日花烷型二萜化合物及其制备方法和用途

Info

Publication number: CN104945362A
Application number: CN201510301452.8A
Authority: CN
Inventors: 孙实; 赵新杰; 武爱玲; 王一方; 张宏都; 郭畅; 丁震
Original assignee: Henan Luoyang Bonesetting Medicine Science & Technology Co Ltd
Current assignee: Henan Luoyang Bonesetting Medicine Science & Technology Co Ltd
Priority date: 2015-06-04
Filing date: 2015-06-04
Publication date: 2015-09-30

Abstract

一种半日花烷型二萜化合物，其化学结构如下：本发明涉及天然药物领域，具体涉及益母草中一种新的半日花烷型二萜化合物，该化合物的制备方法以及该化合物在制备抗肿瘤药物的医药用途。该化合物是一种新颖的半日花烷型二萜化合物，体外试验具有抗宫颈癌、白血病和乳腺癌的作用，可以用于制备抗宫颈癌、乳腺癌和白血病的药物。

Description

一种半日花烷型二萜化合物及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及天然药物领域，具体涉及一种新的半日花烷型二萜化合物、制备方法及该化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

背景技术

半日花烷型二萜为二环二萜，以十氢萘为母核，包括其去甲、次裂和重排化合物，是结构类型较丰富的一类二萜。最具有代表性的半日花烷型二萜是从穿心莲（Andrographis panis）中分离得到的穿心莲内酯（Andrographolide）和从毛喉鞘蕊花（Coleus forskohlii）中得到的鞘蕊花素（Forskolin）。前者具有较好的抗菌、消炎功效，后者可用于强心、抗抑郁、解痉和治疗哮喘。近年来，又发现了大量新的半日花烷型二萜，结构变化丰富，其中不少具有良好的抗菌、消炎和抗肿瘤等生物活性。

益母草属植物中该类化合物根据C₁₂上连接的五元环的类型，可分为5种类型：呋喃环型（A）、二氢呋喃环型（B）、四氢呋喃环型（C）、内酯环型（D）和α, β –不饱和内酯环型（E）。各种类型代表性化合物结构如下：

申请号为201310541796.7的发明专利，公开了一种萜类化合物及其制备方法和用途，该化合物为降碳半日花烷型二萜，在体外能明显缩短凝血酶原时间（PT）、活化部分凝血酶原时间（APTT）和凝血酶时间（TT），而且还能明显增加血液中血纤蛋白原（FIB）的量，对凝血功能具有一定的增强作用。

申请号为201410326070.6的发明专利，公开了一种二萜类化合物及其制备方法和用途，从益母草中分离获得的双螺环半日花烷型二萜对血小板聚集有一定的抑制作用。

然而，随着现代科学技术的进步，人们对益母草的物质基础不断深入，对其活性成分的研究也迅速开展，近年来对二萜类化合物的活性成分研究也逐渐增多，半日花烷型二萜类化合物也是益母草中非常重要的成分。但是由于萜类化合物的构型种类较多，不同的方法能得到不同的化合物，在成分及活性这方面的研究还很少，从益母草中获得的用于制备抗宫颈癌、乳腺癌和白血病的药物的活性成分还未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种从益母草中分离得到的一种新的半日花烷型二萜新化合物。

本发明的另一目的是提供一种从益母草中分离纯化化合物的制备方法。

本发明的再一目的在于提供化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

根据本发明的一方面，提供具有下列化学结构式的化合物：

根据本发明的另一目的是提供一种从益母草中分离纯化化合物的制备方法，其制备步骤包括：

A. 将益母草用石油醚提取一次或多次脱脂，过滤，收集滤渣；

B. 将益母草用醇或醇溶液提取一次或多次，过滤，收集滤液，减压浓缩得醇提取物；

C. 醇提取物用柱色谱分离纯化得到纯的化合物。

步骤C详细包括：①醇提取物用二氯甲烷和甲醇的混合溶剂（1:1, V/V）溶解，与硅胶混合拌样，挥干溶剂后得拌样均匀的硅胶，装柱。用正己烷-乙酸乙酯梯度洗脱（10:1, 4:1, 2:1, 1:1, 1:4, 0:1, V/V），收集正己烷-乙酸乙酯（1:1）洗脱部分，减压回收溶剂；②取正己烷-乙酸乙酯（1:1）洗脱物进一步用正己烷-乙酸乙酯进行梯度洗脱（3:1, 2:1, 1:1，V/V），收集正己烷-乙酸乙酯（1:1）洗脱部分，减压回收溶剂；③取步骤②正己烷-乙酸乙酯（1:1）洗脱物进行反相硅胶柱层析，用甲醇-水（76:24）等度洗脱，收集5-6柱体积洗脱部位，浓缩；④取步骤③浓缩物用制备型高效液相色谱分离，甲醇-水梯度洗脱，从甲醇-水（体积比74 :26）洗脱部位得到纯的化合物。

根据本发明的再一目的，提供化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

由于采用了上述技术方案，本发明具有如下有益效果：益母草属植物Leonurus japonicus Houtt.的新鲜或干燥地上部分，始载于《神农本草经》，味辛、微苦，性微寒，入心包、肝经，具有活血调瘀、利尿消肿之功效。临床上用于月经不调、产后瘀痛、心脑血管疾病、血液病等疾病的治疗。半日花烷型二萜类化合物是益母草中非常重要的成分。本发明在对益母草化学成分研究的过程中，分离得到了一种新的半日花烷型二萜。发明人对该化合物进行了多种药理活性筛选，发现该化合物具有抗宫颈癌、白血病和乳腺癌的作用，可以用于制备抗宫颈癌、乳腺癌和白血病的药物。

根据本发明的再一目的，提供化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。为实现该目的，本发明采用标准的MTT法对多种肿瘤细胞进行体外筛选，包括：人宫颈癌HeLa、人乳腺癌MCF-7、人急性早幼粒白血病细胞HL-60、人肺癌A549、人结肠癌HCT15。结果表明，化合物对人宫颈癌HeLa细胞、急性早幼粒白血病HL-60细胞和人乳腺癌MCF-7细胞的抗增殖活性强并呈良好的时效与量效关系，对A549和HCT15活性弱；同时将其作用正常肝细胞L-O2，未发现毒性反应。因此，化合物具有抗宫颈癌、白血病和乳腺癌的作用，可以用于制备抗宫颈癌、乳腺癌和白血病的药物。

附图说明

图1为不同浓度本发明化合物作用不同细胞株24小时后的抑制生长效果。

图2为不同浓度本发明化合物作用不同细胞株72小时后的抑制生长效果。

具体实施方式

本发明半日花烷型二萜化合物的制备方法

取益母草地上部分干燥粉末（购自上海康桥中药饮片有限公司，产地安徽） 5kg，室温条件下采用渗漉法用石油醚提取3次脱脂，每次体积15L；药渣再用95%乙醇提取3次，每次体积15L，合并乙醇提取液，减压回收，得乙醇浸膏280g。浸膏用300ml二氯甲烷和甲醇的混合溶剂（1:1, V/V）溶解，与硅胶混合拌样（500g，200-300目），挥干溶剂后得拌样均匀的硅胶。采用200-300目硅胶（1500g）装柱，对拌样硅胶进行分离。用正己烷-乙酸乙酯梯度洗脱（10:1, 4:1, 2:1, 1:1, 1:4, 0:1, V/V）。收集正己烷-乙酸乙酯（1:1）洗脱部分，减压回收溶剂后，进一步用正己烷-乙酸乙酯进行梯度洗脱（3:1, 2:1, 1:1，V/V），收集正己烷-乙酸乙酯（1:1）洗脱部分，减压回收溶剂。取该洗脱物进行反相硅胶柱层析，用甲醇-水（76:24）等度洗脱，收集5-6柱体积洗脱部位，浓缩；④取步骤③浓缩物用制备型高效液相色谱分离，甲醇-水梯度洗脱，从甲醇-水（体积比72 :28）洗脱部位得到纯的化合物（12.6mg）。

化合物结构确证：淡黄色粉末；HR-ESIMS显示[M+H]⁺为m/z 335.4462；¹H NMR (CDCl₃, δppm, J in Hz, 600 MHz)和¹³C NMR(CDCl₃, δppm, 150 MHz)数据见表1。结合DEPT、HSQC、HMBC、NOESY谱及该类化合物核磁数据可确定其平面结构和相对构型。绝对构型通过ECD确证。

表1 ¹H NMR和¹³C NMR信号归属

本发明半日花烷型二萜化合物的体外抗肿瘤作用

分别取对数生长期的人乳腺癌MCF-7细胞、人急性早幼粒白血病细胞HL-60细胞、人宫颈癌HeLa细胞、人肺癌A549、人结肠癌HCT15及正常肝细胞L-O2，根据细胞的大小接种4～10×10³个于96孔板，待生长2小时后，弃上清，然后按以下分组给药：肿瘤细胞设不加药组和加药组。（浓度1～25μM），每组设5个复孔，培养24或72小时，弃上清，加入100μl含0.5mg/ml的MTT无血清培养液培养4小时，加入100μl DMSO，放置于微型振荡仪上振荡10min，再置于酶标仪上570nm处测OD值。正常人细胞系L-O2 做毒性评价，每次实验重复3次。结果见表2和附图1、2，表2表示的是加药组的实验数据。图1和图2为加药组的实验数据，不加药组基本上都在0点附近。

表2化合物作用不同细胞株的IC50结果

细胞株	HeLa	MCF-7	HL-60	A549	HCT15
						24小时作用后的平均IC50 (μM)	10.2	9.5	6.5	65.8	61.3
72小时作用后的平均IC50 (μM)	5.8	6.3	3.5	45.9	52.3

从表2可看出化合物作用MCF-7、HL-60和HeLa细胞24小时后的IC50 均在10μM左右，72小时后IC50均接近6μM，说明化合物对MCF-7、 HL-60和HeLa细胞抑制活性好；化合物对A549和HCT15细胞株的24小时作用的IC50＞50μM，72小时作用后 IC50约50μM，说明化合物对A549和HCT15的抑制作用比较弱。

附图1为不同浓度化合物 (1, 5, 10, 15, 20, 25μM) 对MCF-7、HL-60、HeLa和L-O2细胞株作用24小时后的生长抑制情况，结果表明：随着化合物浓度增加，与相应不加化合物的对照组比较，MCF-7、HL-60和HeLa细胞增殖活性分别下降，提示该化合物呈浓度依赖性抑制肿瘤细胞细胞增殖。化合物不抑制正常肝细胞系L-O2 细胞的增殖。

附图2为不同浓度化合物 (1, 5, 10, 15, 20, 25μM) 对MCF-7、HL-60、HeLa和L-O2细胞株作用72小时后的生长抑制情况，相应浓度作用肿瘤细胞株的抑制率增加但并不抑制正常肝细胞L-O2的生长。

综合上述实验结果，提示化合物对MCF-7、HL-60和HeLa肿瘤细胞株具有良好的抑制作用，呈现时效和量效关系；同时对正常细胞具有低毒的特性。

流式细胞仪检测细胞凋亡

实验设阴性对照组（即不加药物处理组）和化合物处理组(15μM)。细胞经化合物作用12小时后，用不含EDTA的0.1％胰酶消化，含血清培养基终止消化后，收集到10ml玻璃离心管中500rpm离心5min，弃上清，用0.01M 的PBS于500rpm离心5min洗涤2次，然后按Annexin V/PI双染试剂盒说明书添加结合液体并染色后用流式细胞仪(Becton Dickinson FACScan Flow Cytometer)检测，FACS数据由流式细胞仪专业操作人员用FLOWJO software(Tree Star，CA) 软件进行数据分析。结果显示本发明所述半日花烷型二萜化合物可以诱导细胞凋亡。

不加药阴性组18小时细胞凋亡率为4.5±1.5％。加化合物处理18小时的细胞凋亡率为68.2±5.6％。表明本发明所述半日花烷型二萜化合物能诱导细胞凋亡，诱导细胞凋亡是其抑制增殖活性的机制之一。

Claims

1.一种半日花烷型二萜化合物，其化学结构如下：

。

2.一种如权利要求1 所述半日花烷型二萜化合物的制备方法，其制备步骤包括：

A. 将益母草用石油醚提取脱脂，过滤，收集滤渣；

B. 将步骤A中的滤渣用醇或醇溶液提取，提取液合并后，过滤，收集滤液，减压回收溶剂，即得乙醇浸膏；

C. 将步骤B得到的乙醇浸膏用柱色谱分离纯化得到产物半日花烷型二萜化合物。

3.如权利要求2所述的半日花烷型二萜化合物的制备方法，其特征是：步骤C的详细步骤包括：

①步骤B得到的乙醇浸膏用二氯甲烷和甲醇的混合溶剂（1:1, V/V）溶解，然后与硅胶混合拌样，挥干溶剂后得拌样均匀的硅胶，装柱；用正己烷-乙酸乙酯=（10:1, 4:1, 2:1, 1:1, 1:4, 0:1, V/V）梯度洗脱，收集正己烷-乙酸乙酯（1:1, V/V）洗脱部分，减压回收溶剂；

②取正己烷-乙酸乙酯（1:1, V/V）洗脱物，进一步用正己烷-乙酸乙酯=（3:1, 2:1, 1:1，V/V）进行梯度洗脱，收集正己烷-乙酸乙酯（1:1, V/V）洗脱部分，减压回收溶剂；

③取步骤②正己烷-乙酸乙酯（1:1, V/V）洗脱物进行反相硅胶柱层析，用甲醇-水（76:24）等度洗脱，收集5-6柱体积洗脱部位，浓缩得浓缩物；

④取步骤③浓缩物用制备型高效液相色谱分离，甲醇-水梯度洗脱，从甲醇-水（体积比74 :26）洗脱部位得到产物半日花烷型二萜化合物。

4.一种如权利要求1 所述的半日花烷型二萜化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

5.如权利要求4所述的半日花烷型二萜化合物在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征是：肿瘤为宫颈癌、乳腺癌和白血病。