CN104130267A - 一种二萜类化合物及其制备方法和用途 - Google Patents

一种二萜类化合物及其制备方法和用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供了式A所示化合物或其药学上可接受的盐：其中，R1选自H、-OH、-OAc、-OMe或-OEt；R2选自H、-Ac、-Me或-Et；R3选自H、-OMe、-OEt、-OH或无；R4选自H、-OMe、-OEt、-OH或无；R5选自H或＝O；X、Y分别独立选自O或C，X、Y为不同元素。本发明研究发现，从益母草中分离获得的双螺环半日花烷型二萜对血小板聚集有一定的抑制作用。

Description

一种二萜类化合物及其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及一种二萜类化合物及其制备方法和用途。
背景技术
益母草始载于《神农本草经》，原名茺蔚，被列为上品。在《本草纲目》中被称之为“血家之圣药”，主治“胎漏难产，胎衣不下，血晕，血风，血痛，崩中漏下，尿血”，为妇科经产要药。
益母草中主要含有生物碱、二萜、黄酮、环烯醚萜苷、苯乙醇苷、挥发油、肽类和脂肪酸类等成分,目前活性研究较多的主要是生物碱和二萜类：
(1)生物碱：主要包括水苏碱、益母草碱、益母草啶和益母草宁等。现代研究表明益母草总生物碱对脑缺血再灌注损伤有治疗作用，其中，益母草碱不仅可通过抗氧化作用保护缺血损伤的心肌细胞，还具有神经保护活性。
(2)二萜：近年来对其活性成分研究增多，其中Leoheteronin A和Leopersin G明显抑制乙酰胆碱酯酶活性，在治疗阿尔茨海默病方面有很好的前景；prehispanolone为一种血小板拮抗因子，可抑制血小板聚集；leojaponin对谷氨酸盐损伤的大脑皮层细胞有保护作用；Khan得到的半日花烷型二萜具有抗炎作用等。
虽然随着人们对益母草认识的加深和现代科学技术的进步，益母草药效部位和活性成分的研究迅速开展，二萜类化学成分研究的较多，活性研究相对较少。抗血小板聚集作用与益母草的传统功效“活血”相关，但有关抗凝血成分的研究十分缺乏。由此可见，从益母草中获得抗凝血成分具有很好的前景和研究价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一种二萜类化合物。本发明的另一目的在于提供该类化合物的制备方法和用途。
本发明提供了式A所示化合物或其药学上可接受的盐：
其中，R1选自H、-OH、-OAc、-OMe或-OEt；
R2选自H、-Ac、-Me或-Et；
R3选自H、-OMe、-OEt、-OH或无；
R4选自H、-OMe、-OEt、-OH或无；
R5选自H或＝O；
X、Y分别独立选自O或C，X、Y为不同元素。
进一步地，所述化合物为：
或
R3选自-OMe、-OEt或-OH。
进一步地，所述化合物为：
或
R4选自-OMe、-OEt或-OH，R5选自H。
更进一步地，R1选自H或-OAc；R2选自H；R3或R4选自-OMe或-OEt。
优选地，所述化合物为如下之一：
本发明还提供了上述式Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ化合物的制备方法，它包括如下操作步骤：
(1)称取益母草药材，粉碎，加95％v/v乙醇提取，提取液减压回收溶剂后，得到乙醇浸膏；
(2)将乙醇浸膏用水分散，依次用乙酸乙酯、正丁醇萃取，合并乙酸乙酯部分，减压回收溶剂，得乙酸乙酯浸膏；
(3)采用硅胶柱色谱对乙酸乙酯浸膏进行分离，石油醚：丙酮＝(100:1)～(0:1)梯度洗脱，取石油醚-丙酮＝5:1洗脱部分上反相聚苯乙烯型树脂柱，50-100％v/v甲醇水溶液梯度洗脱，收集70％甲醇洗脱部分，再通过中压液相色谱，十八烷基键合硅胶色谱柱，50-95％v/v甲醇水溶液梯度洗脱，收集70～75％甲醇水溶液洗脱部分，回收溶剂，剩余物再经Sephadex LH-20葡聚糖凝胶柱色谱分离，石油醚﹕三氯甲烷﹕甲醇＝5﹕5﹕1洗脱，收集洗脱液，回收溶剂，剩余物上反相液相制备色谱，82％v/v甲醇水溶液洗脱，分别收集不同出峰时间的洗脱液，即可得到式Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ化合物。
本发明还提供了上述式Ⅴ或Ⅸ化合物的制备方法，它包括如下操作步骤：
(1)称取益母草药材，粉碎，加95％v/v乙醇提取，提取液减压回收溶剂后，得到乙醇浸膏；
(2)将乙醇浸膏用水分散，用乙酸乙酯萃取，合并乙酸乙酯部分，减压回收溶剂，得乙酸乙酯浸膏；
(3)采用硅胶柱色谱对乙酸乙酯浸膏进行分离，石油醚：丙酮＝(100:1)～(0:1)梯度洗脱，取石油醚-丙酮＝5:1洗脱部分上反相聚苯乙烯型树脂柱，50-100％v/v甲醇水溶液梯度洗脱，收集70％甲醇洗脱部分，再通过中压液相色谱，十八烷基键合硅胶色谱柱，50-95％v/v甲醇水溶液梯度洗脱，薄层追踪，收集65～70％洗脱液，回收溶剂，剩余物再经制备薄层色谱分离，石油醚﹕丙酮＝5﹕1展开，收集洗脱液，回收溶剂，剩余物上反相液相制备色谱，78％v/v甲醇水溶液洗脱，分别收集不同出峰时间的洗脱液，即得式Ⅴ或Ⅸ化合物。
本发明还提供了上述化合物或其药学上可接受的盐在制备抗血小板聚集类药物中的用途。
本发明还提供了一种药物组合物，它含有上述化合物或其药学上可接受的盐。
本发明中，所述药学上可接受的盐为化合物的盐酸盐、硫酸盐、枸橼酸盐、苯磺酸盐、氢溴酸盐、氢氟酸盐、磷酸盐、乙酸盐、丙酸盐、丁二酸盐、草酸盐、苹果酸盐、琥珀酸盐、富马酸盐、马来酸盐、酒石酸盐或三氟乙酸盐。
本发明的一种实施方式中，还包括了同位素标记的上述化合物或其药学上可接受的盐，所述同位素标记化合物是指与本文中所列化合物相同，但是其中的一个或多个原子被另一个原子取代，该原子的原子质量或质量数不同于自然界中常见的原子质量或质量数。可以引入化合物中的同位素包括氢、碳、氮、氧、硫，即2H,3H、13C、14C、15N、17O、18O、35S。含有上述同位素和/或其它原子同位素的化合物及其立体异构体，以及该化合物、立体异构体的可药用的盐均应包含在本发明范围之内。
本发明可以采用本领域常规的制剂技术手段或制药方法，将本发明化合物制备成适当的药剂形式，包含：片剂，注射剂，酊剂，栓剂，胶囊剂，膏剂(软膏剂、乳膏剂)，眼用制剂，丸剂，植入剂，糖浆剂，雾剂(气雾剂、粉雾剂、喷雾剂)，膜剂，颗粒剂，口服溶液剂(口服混悬剂、口服乳剂)，散剂，耳用制剂，鼻用制剂，洗剂(冲洗剂、灌肠剂)，搽剂(涂剂、涂膜剂)，凝胶剂，贴剂等；优选为片剂，胶囊剂，眼用制剂。其中，所述片剂选自含片、舌下片、口腔贴片、咀嚼片、分散片、可溶片、泡腾片、缓释片、控释片、肠溶片等；所述注射剂选自针剂、输液、冻干粉针、乳液、植入体、微球制剂、微丸制剂等；所述胶囊剂选自硬胶囊、软胶囊、缓释胶囊、控释胶囊和肠溶胶囊等；所述眼用制剂选自滴眼剂、洗眼剂、眼内注射溶液、眼膏剂、眼用乳膏剂、眼用凝胶剂、眼膜剂、眼丸剂、眼内插入剂等；所述丸剂选自滴丸、糖丸等；所述颗粒剂选自混悬颗粒、泡腾颗粒、肠溶颗粒、缓释颗粒、控释颗粒等；所述耳用制剂选自滴耳剂、洗耳剂、耳用喷雾剂、耳用软膏剂、耳用乳膏剂、耳用凝胶剂、耳塞、耳用散剂、耳用丸剂等；所述鼻用制剂选自滴鼻剂、洗鼻剂、鼻用喷雾剂、鼻用软膏剂、鼻用凝胶剂、鼻用散剂、鼻用粉雾剂、鼻用棒剂等。
本发明研究发现，从益母草中分离获得的双螺环半日花烷型二萜对血小板聚集有一定的抑制作用。
其中，具有13S构型的双螺环半日花烷型二萜效果较弱；而具有13R构型的双螺环半日花烷型二萜，效果明显，在同浓度下(0.1mM)，与抗血小板聚集药物“硫酸氢氯吡格雷”相当，为新颖的天然抗血小板聚集药物的开发提供了新的选择。
以下通过具体实施方式对本发明作进一步的详细描述，但并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变和变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。
附图说明
图1式Ⅱ化合物的单晶衍射结构图
具体实施方式
实施例1(-)-(3R,5S,7R,8R,9R,10S,13R,15R)-3-乙酰氧基-7-羟基-15-乙氧基-9,13；15,16-双环氧半日花烷-6-酮(式Ⅱ化合物)的提取、分离纯化和结构鉴定
(1)实验材料：
①药材
益母草采自四川成都温江区，经成都中医药大学中药鉴定教研室李敏教授鉴定为唇形科植物益母草Leonurus japonicus Houtt.的全草。
②试剂和填料
柱层析硅胶，200～300目(试剂级)，购于青岛海洋硅胶干燥剂厂；
薄层层析硅胶G、GF254和H(化学纯)，购于青岛海洋硅胶干燥剂厂；
MCI gel CHP20P，75～150μm，为反相聚苯乙烯型树脂，购于日本三菱化学公司；
Sephadex LH-20葡聚糖凝胶，购于瑞典Amersham公司；
GF254硅胶制备薄层，购于烟台江友硅胶开发有限公司；
色谱甲醇，4L/瓶，购于美国Fisher公司；
石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、丙酮、甲醇等分析纯试剂，购于成都科龙化工试剂厂。
③实验仪器
Cometro6000高效液相色谱仪(美国Cometro)；
Waters Synapt G2HDMS高分辨飞行时间质谱(美国Waters)；
Bruker-AV-400核磁共振仪(瑞士Bruker)；
Vector22FT-IR红外光谱仪(瑞士Bruker)；
Shimadzu UV-260紫外-可见分光光度仪(日本Shimadzu)；
Perkin-Elmer341旋光测定仪(美国PerkinElmer)；
BP211D十万分之一电子天平(瑞士Sartorius)；
R-210旋转蒸发器(瑞士BUCHI)；
DZG-6050型真空干燥箱(上海森信)。
(2)药材的提取：称取益母草药材20Kg，粉碎，加95％乙醇(3×160L)提取72小时，提取3次，提取液合并后，减压回收溶剂后，得到乙醇浸膏1.2Kg；
(3)成分的分离纯化：
①称取益母草药材20kg，粉碎，加95％v/v乙醇160L提取3次，提取液减压回收溶剂后，得到乙醇浸膏1.2kg；
②将乙醇浸膏用水分散，依次用乙酸乙酯、正丁醇萃取，合并乙酸乙酯部分，减压回收溶剂，得乙酸乙酯浸膏400g；
③采用硅胶柱色谱对乙酸乙酯浸膏进行分离，石油醚：丙酮＝(100:1)～(0:1)梯度洗脱，取石油醚-丙酮＝5:1洗脱部分(H)8.2g，上反相聚苯乙烯型树脂柱MCI gel CHP20P，50-100％v/v甲醇水溶液梯度洗脱，收集70％甲醇洗脱部分(H-3)2.1g，再通过反相RP-C18中压液相色谱，50-95％v/v甲醇水溶液梯度洗脱，薄层追踪，收集含有目标化合物的70～75％洗脱液(H-3-4)，回收溶剂，剩余物再经Sephadex LH-20葡聚糖凝胶柱色谱分离，石油醚﹕三氯甲烷﹕甲醇＝5﹕5﹕1洗脱，薄层色谱追踪，收集含有目标化合物馏分，回收溶剂，剩余物经反相液相制备色谱分离，82％v/v甲醇水溶液洗脱，收集保留时间为tR＝48min的目标产物，纯化即得13mg。
(4)成分的结构鉴定：无色晶体；无暗斑，碘显黄色，喷10％硫酸乙醇溶液在105℃下显橙黄色；由HRESIMS m/z461.2520[M+Na]+可确定分子式为C24H38O7。化合物1H-NMR显示4个甲基单峰信号(δ:0.90,0.95,1.35,2.04)，一个与次甲基相连的甲基信号δH1.12(d,J＝6.6Hz,H3-17)，一个与亚甲基相连的甲基δH1.15(t,J＝7.2Hz,H3-22)，三个低场连氧次甲基信号δH5.10(dd,J＝6.0,3.6Hz,H-15),4.46(dd,J＝3.0,1.8Hz,H-3),3.78(d,J＝10.8Hz,H-7)；化合物13C-NMR和DEPT谱显示24个碳信号，DEPT谱显示这些碳信号分别为6个甲基、7个亚甲基(包括1个连氧碳)、5个次甲基和6个季碳信号，其中有1个羰基(δC212.5)和两个连氧碳(δC92.7,91.4)。结合以上信息与参考文献(Planta Med.2008,74:1288–1290.)，确定化合物的平面结构为3-乙酰氧基-7-羟基-15-乙氧基-9,13；15,16-双环氧半日花烷-6-酮。随后采用2D NMR实验进行了确证。化合物的相对构型通过NOESY谱进行推断，H-5与H-7和H3-18相关，H-7又与H3-17相关，表明H-5,H-7,H3-18,H3-17在环的同侧(α方向)，同理，H3-20与H-8,H2-11,H3-19相关，表明它们位于另一侧(β方向)。进一步采用X-射线单晶衍射实验确定绝对构型，如附图1所示。因此，该化合物的结构确定为(-)-(3R,5S,7R,8R,9R,10S,13R,15R)-3-乙酰氧基-7-羟基-15-乙氧基-9,13；15,16-双环氧半日花烷-6-酮，具体波谱数据见表1。
(5)核磁共振氢谱(1H-NMR)：Bruker-AV-600spectrometer测定，数据见表1。
(6)核磁共振碳谱(13C-NMR)：Bruker-AV-600spectrometer测定，数据见表2。
表1.1H-NMR(600MHz)核磁数据(溶剂：Me2CO-d6；δ：ppm；J：Hz)
表2.13C-NMR(150MHz)核磁数据(测定溶剂：Me2CO-d6；δ：ppm)
实施例2(-)-(5S,7R,8R,9R,10S,13R,15R)-7-羟基-15-乙氧基-9,13；15,16-双环氧半日花烷-6-酮(式Ⅲ化合物)的提取、分离纯化和结构鉴定
(1)实验材料：同实施例1
(2)药材的提取：称取益母草药材20Kg，粉碎，加95％乙醇(3×160L)提取72小时，提取3次，提取液合并后，减压回收溶剂后，得到乙醇浸膏1.2Kg；
(3)成分的分离纯化：
①称取益母草药材20kg，粉碎，加95％v/v乙醇160L提取3次，提取液减压回收溶剂后，得到乙醇浸膏1.2kg；
②将乙醇浸膏用水分散，依次用乙酸乙酯、正丁醇萃取，合并乙酸乙酯部分，减压回收溶剂，得乙酸乙酯浸膏400g；
③采用硅胶柱色谱对乙酸乙酯浸膏进行分离，石油醚：丙酮＝(100:1)～(0:1)梯度洗脱，取石油醚-丙酮＝5:1洗脱部分(H)8.2g，上反相聚苯乙烯型树脂柱MCI gel CHP20P，50-100％v/v甲醇水溶液梯度洗脱，收集70％甲醇洗脱部分(H-3)2.1g，再通过反相RP-C18中压液相色谱，50-95％v/v甲醇水溶液梯度洗脱，薄层追踪，收集含有目标化合物的70～75％洗脱液(H-3-4)，回收溶剂，剩余物再经Sephadex LH-20葡聚糖凝胶柱色谱分离，石油醚﹕三氯甲烷﹕甲醇＝5﹕5﹕1洗脱，薄层色谱追踪，收集含有目标化合物馏分，回收溶剂，剩余物经反相液相制备色谱分离，82％v/v甲醇水溶液洗脱，收集保留时间为tR＝28min的目标产物，纯化即得16.5mg。
(4)成分的结构鉴定：无色油状物；[α]20 D-92.2(c0.15,MeOH)；分子式：C22H36O5。其NMR数据与式Ⅱ化合物的较相似。比较化合物Ⅲ和Ⅱ的NMR数据，Ⅱ中的乙酰基和连氧次甲基被Ⅲ中的亚甲基单元(δH1.30和1.13,δC43.2ppm)替代。此外，相对于Ⅱ而言，Ⅲ中的C-1,C-5分别被去屏蔽(ΔδC+6.5,+5.0ppm)，C-2,C-4被屏蔽(ΔδC-3.8,-3.4ppm)，揭示化合物Ⅲ为Ⅱ的3位脱乙酰氧基类似物，并通过2D NMR实验得到了进一步证实。化合物B的构型是通过比较B和A的NOESY谱和旋光值进行确定的。推断结构为(-)-(5S,7R,8R,9R,10S,13R,15R)-7-羟基-15-乙氧基-9,13；15,16-双环氧半日花烷-6-酮。
(5)核磁共振氢谱(1H-NMR)：Bruker-AV-600spectrometer测定，数据见表1。
(6)核磁共振碳谱(13C-NMR)：Bruker-AV-600spectrometer测定，数据见表2。
实施例3(+)-(5S,7R,8R,9R,10S,13S,15R)-7-羟基-15-乙氧基-9,13；15,16-双环氧半日花烷-6-酮(式Ⅳ化合物)的提取、分离纯化和结构鉴定
(1)实验材料：同实施例1
(2)药材的提取：称取益母草药材20Kg，粉碎，加95％乙醇(3×160L)提取72小时，提取3次，提取液合并后，减压回收溶剂后，得到乙醇浸膏1.2Kg；
(3)成分的分离纯化：
①称取益母草药材20kg，粉碎，加95％v/v乙醇160L提取3次，提取液减压回收溶剂后，得到乙醇浸膏1.2kg；
②将乙醇浸膏用水分散，依次用乙酸乙酯、正丁醇萃取，合并乙酸乙酯部分，减压回收溶剂，得乙酸乙酯浸膏400g；
③采用硅胶柱色谱对乙酸乙酯浸膏进行分离，石油醚：丙酮＝(100:1)～(0:1)梯度洗脱，取石油醚-丙酮＝5:1洗脱部分(H)8.2g，上反相聚苯乙烯型树脂柱MCI gel CHP20P，50-100％v/v甲醇水溶液梯度洗脱，收集70％甲醇洗脱部分(H-3)2.1g，再通过反相RP-C18中压液相色谱，50-95％v/v甲醇水溶液梯度洗脱，薄层追踪，收集含有目标化合物的70～75％洗脱液(H-3-4)，回收溶剂，剩余物再经Sephadex LH-20葡聚糖凝胶柱色谱分离，石油醚﹕三氯甲烷﹕甲醇＝5﹕5﹕1洗脱，薄层色谱追踪，收集含有目标化合物馏分，回收溶剂，剩余物经反相液相制备色谱分离，82％v/v甲醇水溶液洗脱，收集保留时间为tR＝32min的目标产物，纯化即得9mg。
(4)成分的结构鉴定：无色油状物，其波谱特征与化合物Ⅲ非常相似,但具有相反的比旋度{[α]20 D+114.9(c0.20,MeOH)}.综合比较Ⅲ和Ⅳ的HR-ESI-MS和2D-NMR数据，表明两者具有相同的平面结构。进一步详细比较两者在相同氘代溶剂的1H和13C-NMR数据，发现两者的微小差异为：相对于Ⅲ而言，化合物Ⅳ中H-11b,H-16a,H-16b,C-15和C-16信号分别向高场移动Δδ-0.13,-0.08,-0.06,-0.4和-0.5ppm。相反，H-11a,H-12b,H-14a,H-14b,C-11和C-12信号分别向低场移动Δδ+0.08,+0.07,+0.03,+0.06,+0.6和+0.3ppm。以上表明化合物Ⅳ是化合物Ⅲ的13S-差向异构体，并采用NOESY进行了确证。在NOESY谱中，H2-14与H3-17相关，H2-12与H2-16相关确证C-13为S构型。因此，化合物Ⅳ确定为(+)-(5S,7R,8R,9R,10S,13S,15R)-7-羟基-15-乙氧基-9,13；15,16-双环氧半日花烷-6-酮。
(5)核磁共振氢谱(1H-NMR)：Bruker-AV-600spectrometer测定，数据见表1。
(6)核磁共振碳谱(13C-NMR)：Bruker-AV-600spectrometer测定，数据见表2。
实施例4(-)-(5S,7R,8R,9R,10S,13S,15S)-7-羟基-15-甲氧基-9,13；15,16-双环氧半日花烷-6-酮(式Ⅴ化合物)的提取、分离纯化和结构鉴定
(1)实验材料：同实施例1
(2)药材的提取：称取益母草药材20Kg，粉碎，加95％乙醇(3×160L)提取72小时，提取3次，提取液合并后，减压回收溶剂后，得到乙醇浸膏1.2Kg；
(3)成分的分离纯化：
①称取益母草药材20kg，粉碎，加95％v/v乙醇160L提取3次，提取液减压回收溶剂后，得到乙醇浸膏1.2kg；
②将乙醇浸膏用水分散，依次用乙酸乙酯、正丁醇萃取，合并乙酸乙酯部分，减压回收溶剂，得乙酸乙酯浸膏400g；
③采用硅胶柱色谱对乙酸乙酯浸膏进行分离，石油醚：丙酮＝(100:1)～(0:1)梯度洗脱，取石油醚-丙酮＝5:1洗脱部分(H)8.2g，上反相聚苯乙烯型树脂柱MCI gel CHP20P，50-100％v/v甲醇水溶液梯度洗脱，收集70％甲醇洗脱部分(H-3)2.1g，再通过反相RP-C18中压液相色谱，50-95％v/v甲醇水溶液梯度洗脱，薄层追踪，收集含有目标化合物的65～70％洗脱液(H-3-3)，回收溶剂，剩余物再经制备薄层色谱分离，石油醚﹕丙酮＝5﹕1展开，刮取目标产物色谱带，以丙酮30ml洗脱，收集洗脱液，回收溶剂，剩余物经反相液相制备色谱分离，78％v/v甲醇水溶液洗脱，收集保留时间为tR＝37min的目标产物，纯化即得1.5mg。
(4)成分的结构鉴定：无色油状物，分子式：C21H34O5。它的谱图特征表明它与Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ结构类似，是另一个双螺环半日花烷二萜。比较化合物Ⅴ与Ⅳ的NMR数据，表明Ⅳ中的乙氧基被Ⅴ中的甲氧基取代(δH3.26ppm,δC54.7ppm)。同时，H2-14和H-15之间的偶合常数由Ⅳ中的6.0和4.2Hz变小为Ⅴ中的5.6和1.2Hz，而且化合物Ⅴ中C-15和C-16分别向低场移动了ΔδC+1.9和+2.9ppm.这表明化合物Ⅴ为化合物Ⅳ的15β-甲氧基衍生物。随后采用2D-NMR实验进行了确证。采用Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ构型确定的方法，确定了化合物Ⅴ的绝对构型。因此，化合物Ⅴ的结构确定为(-)-(5S,7R,8R,9R,10S,13S,15S)-7-羟基-15-甲氧基-9,13；15,16-双环氧半日花烷-6-酮。
(5)核磁共振氢谱(1H-NMR)：Bruker-AV-600spectrometer测定，数据见表1。
(6)核磁共振碳谱(13C-NMR)：Bruker-AV-600spectrometer测定，数据见表2。
实施例5(-)-(3R,5S,7R,8R,9R,10S,13S,15S)-3-乙酰氧基-7-羟基-15-甲氧基-9,13；15,16-双环氧半日花烷-6-酮(式Ⅵ化合物)的提取、分离纯化和结构鉴定
(1)实验材料：同实施例1
(2)药材的提取：称取益母草药材20Kg，粉碎，加95％乙醇(3×160L)提取72小时，提取3次，提取液合并后，减压回收溶剂后，得到乙醇浸膏1.2Kg；
(3)成分的分离纯化：
①称取益母草药材20kg，粉碎，加95％v/v乙醇160L提取3次，提取液减压回收溶剂后，得到乙醇浸膏1.2kg；
②将乙醇浸膏用水分散，依次用乙酸乙酯、正丁醇萃取，合并乙酸乙酯部分，减压回收溶剂，得乙酸乙酯浸膏400g；
③采用硅胶柱色谱对乙酸乙酯浸膏进行分离，石油醚：丙酮＝(100:1)～(0:1)梯度洗脱，取石油醚-丙酮＝5:1洗脱部分(H)8.2g，上反相聚苯乙烯型树脂柱MCI gel CHP20P，50-100％v/v甲醇水溶液梯度洗脱，收集70％甲醇洗脱部分(H-3)2.1g，再通过反相RP-C18中压液相色谱，50-95％v/v甲醇水溶液梯度洗脱，薄层追踪，收集含有目标化合物的70～75％洗脱液(H-3-4)，回收溶剂，剩余物再经Sephadex LH-20葡聚糖凝胶柱色谱分离，石油醚﹕三氯甲烷﹕甲醇＝5﹕5﹕1洗脱，薄层色谱追踪，收集含有目标化合物馏分，回收溶剂，剩余物经反相液相制备色谱分离，82％v/v甲醇水溶液洗脱，收集保留时间为tR＝54min的目标产物，纯化即得1.6mg。
(4)成分的结构鉴定：无色油状物，HREI-MS m/z447.2366[M+Na]+提示分子组成为C23H36O7(calcd for C23H36O7Na,447.2359)。比较化合物Ⅵ和Ⅴ的NMR数据，表明该化合物Ⅵ为Ⅴ的3-乙酰氧基取代类似物。在1D-NMR谱中，化合物Ⅵ中的一个连氧次甲基(δH4.47ppm,δC78.4ppm)和一个乙酰氧基(δH2.06ppm,δC170.2,21.2ppm)取代了化合物Ⅴ中的亚甲基。同时，化合物Ⅵ中C-1和C-5分别向高场移动Δδ-6.3和-5.1ppm,而C-2和C-4分别向低场移动ΔδC+3.9和+3.4ppm,提示C-3为乙酰氧基取代。化合物构型的判断方法与Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ相同。因此，化合物Ⅵ的结构确定为(-)-(3R,5S,7R,8R,9R,10S,13S,15S)-3-乙酰氧基-7-羟基-15-甲氧基-9,13；15,16-双环氧半日花烷-6-酮。
(5)核磁共振氢谱(1H-NMR)：Bruker-AV-600spectrometer测定，数据见表1。
(6)核磁共振碳谱(13C-NMR)：Bruker-AV-600spectrometer测定，数据见表2。
实施例6(+)-(3R,5S,7R,8R,9R,10S,13S,15R)-3-乙酰氧基-7-羟基-15-乙氧基-9,13；15,16-双环氧半日花烷-6-酮(式Ⅶ化合物)的提取、分离纯化和结构鉴定
(1)实验材料：同实施例1
(2)药材的提取：称取益母草药材20Kg，粉碎，加95％乙醇(3×160L)提取72小时，提取3次，提取液合并后，减压回收溶剂后，得到乙醇浸膏1.2Kg；
(3)成分的分离纯化：
①称取益母草药材20kg，粉碎，加95％v/v乙醇160L提取3次，提取液减压回收溶剂后，得到乙醇浸膏1.2kg；
②将乙醇浸膏用水分散，依次用乙酸乙酯、正丁醇萃取，合并乙酸乙酯部分，减压回收溶剂，得乙酸乙酯浸膏400g；
③采用硅胶柱色谱对乙酸乙酯浸膏进行分离，石油醚：丙酮＝(100:1)～(0:1)梯度洗脱，取石油醚-丙酮＝5:1洗脱部分(H)8.2g，上反相聚苯乙烯型树脂柱MCI gel CHP20P，50-100％v/v甲醇水溶液梯度洗脱，收集70％甲醇洗脱部分(H-3)2.1g，再通过反相RP-C18中压液相色谱，50-95％v/v甲醇水溶液梯度洗脱，薄层追踪，收集含有目标化合物的70～75％洗脱液(H-3-4)，回收溶剂，剩余物再经Sephadex LH-20葡聚糖凝胶柱色谱分离，石油醚﹕三氯甲烷﹕甲醇＝5﹕5﹕1洗脱，薄层色谱追踪，收集含有目标化合物馏分，回收溶剂，剩余物经反相液相制备色谱分离，82％v/v甲醇水溶液洗脱，收集保留时间为tR＝51min的目标产物，纯化即得15mg。
(4)成分的结构鉴定：无色油状；分子式：C24H38O7,M＝438,HRESIMS m/z461.2508[M+Na]+；1H NMR(600MHz,CD3COCD3)δ:0.89(3H,s,H3-20),0.94(3H,s,H3-18),1.34(3H,s,H3-19),1.17(3H,d,J＝6.6Hz,H3-17),5.10(1H,dd,J＝5.4,3.6Hz,H-15),4.46(1H,br s,H-3),3.28(1H,s,H-5),3.89(1H,d,J＝7.8Hz,H-16a),3.67(1H,d,J＝7.8Hz,H-16b),3.71,3.82(2H,2m,MeCH2O),1.15(3H,t,J＝7.2Hz,MeCH2O)；13C NMR(150MHz,CD3COCD3)δ:26.2(C-1),22.9(C-2),78.5(C-3),36.6(C-4),52.9(C-5),212.7(C-6),78.4(C-7),48.2(C-8),92.7(C-9),48.5(C-10),30.4(C-11),40.6(C-12),91.5(C-13),47.8(C-14),104.0(C-15),75.6(C-16),20.1(C-17),27.1(C-18),22.5(C-19),13.6(C-20),170.2(MeCO),21.2(MeCO),63.4(MeCH2O),15.7(MeCH2O)。根据以上数据，确定化合物Ⅶ为(+)-(3R,5S,7R,8R,9R,10S,13S,15R)-3-乙酰氧基-7-羟基-15-乙氧基-9,13；15,16-双环氧半日花烷-6-酮。
实施例7(-)-(3R,5S,7R,8R,9R,10S,13S,15S)-3-乙酰氧基-7-羟基-15-乙氧基-9,13；15,16-双环氧半日花烷-6-酮(式Ⅷ化合物)的提取、分离纯化和结构鉴定
(1)实验材料：同实施例1
(2)药材的提取：称取益母草药材20Kg，粉碎，加95％乙醇(3×160L)提取72小时，提取3次，提取液合并后，减压回收溶剂后，得到乙醇浸膏1.2Kg；
(3)成分的分离纯化：
①称取益母草药材20kg，粉碎，加95％v/v乙醇160L提取3次，提取液减压回收溶剂后，得到乙醇浸膏1.2kg；
②将乙醇浸膏用水分散，依次用乙酸乙酯、正丁醇萃取，合并乙酸乙酯部分，减压回收溶剂，得乙酸乙酯浸膏400g；
③采用硅胶柱色谱对乙酸乙酯浸膏进行分离，石油醚：丙酮＝(100:1)～(0:1)梯度洗脱，取石油醚-丙酮＝5:1洗脱部分(H)8.2g，上反相聚苯乙烯型树脂柱MCI gel CHP20P，50-100％v/v甲醇水溶液梯度洗脱，收集70％甲醇洗脱部分(H-3)2.1g，再通过反相RP-C18中压液相色谱，50-95％v/v甲醇水溶液梯度洗脱，薄层追踪，收集含有目标化合物的70～75％洗脱液(H-3-4)，回收溶剂，剩余物再经Sephadex LH-20葡聚糖凝胶柱色谱分离，石油醚﹕三氯甲烷﹕甲醇＝5﹕5﹕1洗脱，薄层色谱追踪，收集含有目标化合物馏分，回收溶剂，剩余物经反相液相制备色谱分离，82％v/v甲醇水溶液洗脱，收集保留时间为tR＝58min的目标产物，纯化即得22mg。
(4)成分的结构鉴定：无色油状；分子式：C24H38O7,M＝438,HRESIMSm/z461.2508[M+Na]+；1H NMR(600MHz,CD3COCD3)δ:0.90(3H,s,H3-17),0.94(3H,s,H3-18),1.34(3H,s,H3-19),1.19(3H,d,J＝6.4Hz,H3-20),5.19(1H,br d,J＝5.2Hz,H-15),4.47(1H,br s,H-3),3.27(1H,s,H-5),4.08(1H,d,J＝8.8Hz,H-16a),3.90(1H,d,J＝8.8Hz,H-16b),3.40,3.46(2H,2m,MeCH2O),1.13(3H,t,J＝6.8Hz,MeCH2O)；13C NMR(CD3COCD3,100MHz)δ:26.2(C-1),22.9(C-2),78.9(C-3),36.5(C-4),52.5(C-5),212.6(C-6),78.4(C-7),47.4(C-8),93.1(C-9),48.7(C-10),29.6(C-11),39.3(C-12),92.0(C-13),48.7(C-14),104.7(C-15),78.2(C-16),20.3(C-17),27.1(C-18),22.5(C-19),13.8(C-20),170.2(MeCO),63.1(MeCH2O)15.7(MeCH2O),21.2(MeCO)。根据以上数据，确定化合物Ⅷ为(-)-(3R,5S,7R,8R,9R,10S,13S,15S)-3-乙酰氧基-7-羟基-15-乙氧基-9,13；15,16-双环氧半日花烷-6-酮。
实施例8(+)-(5S,7R,8R,9R,10S,13S,15R)-7-羟基-15-甲氧基-9,13；15,16-双环氧半日花烷-6,16-二酮(式Ⅸ化合物)的提取、分离纯化和结构鉴定
(1)实验材料：同实施例1
(2)药材的提取：称取益母草药材20Kg，粉碎，加95％乙醇(3×160L)提取72小时，提取3次，提取液合并后，减压回收溶剂后，得到乙醇浸膏1.2Kg；
(3)成分的分离纯化：
①称取益母草药材20kg，粉碎，加95％v/v乙醇160L提取3次，提取液减压回收溶剂后，得到乙醇浸膏1.2kg；
②将乙醇浸膏用水分散，依次用乙酸乙酯、正丁醇萃取，合并乙酸乙酯部分，减压回收溶剂，得乙酸乙酯浸膏400g；
③采用硅胶柱色谱对乙酸乙酯浸膏进行分离，石油醚：丙酮＝(100:1)～(0:1)梯度洗脱，取石油醚-丙酮＝5:1洗脱部分(H)8.2g，上反相聚苯乙烯型树脂柱MCI gel CHP20P，50-100％v/v甲醇水溶液梯度洗脱，收集70％甲醇洗脱部分(H-3)2.1g，再通过反相RP-C18中压液相色谱，50-95％v/v甲醇水溶液梯度洗脱，薄层追踪，收集含有目标化合物的65～70％洗脱液(H-3-3)，回收溶剂，剩余物再经制备薄层色谱分离，石油醚﹕丙酮＝5﹕1展开，刮取目标产物色谱带，以丙酮30ml洗脱，收集洗脱液，回收溶剂，剩余物经反相液相制备色谱分离，78％v/v甲醇水溶液洗脱，收集保留时间为tR＝40min的目标产物，纯化即得2.4mg。
(4)成分的结构鉴定：无色油状物，HRESIMS m/z403.2094[M+Na]+提示分子式为C21H32O6。比较化合物Ⅸ与Ⅳ的NMR数据，发现它们的差异主要在于：化合物Ⅸ中含有内酯羰基，而且化合物Ⅸ中15位的甲氧基(δH3.54ppm,δC57.6ppm)替代了Ⅳ中的乙氧基。该推论通过2D NMR进一步证实。在HMBC谱中，H2-12与C-9,C-11,C-14和C-16相关，H2-14与C-12,C-13,C-15和C-16相关，H-15与C-14,C-16和C-21相关，说明酯羰基位于C-16位。通过NOESY谱，偶合常数以及比旋度等特征可以判定化合物F中C-5,C-7,C-8,C-9,C-10,C-13的绝对构型与C相同。此外，化合物Ⅸ中J14,15为6.0和4.8Hz，与具有15α-构型的化合物Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅶ相近(J＝6.0,4.2Hz)，而大于15β-构型的化合物Ⅴ、Ⅵ、Ⅷ(J＝5.4,1.2Hz)。因此，化合物Ⅸ中C-15的构型与化合物Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅶ相同。化合物Ⅸ的结构确定为(+)-(5S,7R,8R,9R,10S,13S,15R)-7-羟基-15-甲氧基-9,13；15,16-双环氧半日花烷-6,16-二酮。
(5)核磁共振氢谱(1H-NMR)：Bruker-AV-600spectrometer测定，数据见表1。
(6)核磁共振碳谱(13C-NMR)：Bruker-AV-600spectrometer测定，数据见表2。
以下通过试验例具体说明本发明的有益效果。
试验例1具有13R构型的双螺环半日花烷型二萜(式Ⅱ和Ⅲ所示化合物)的抗血小板聚集试验
(1)实验材料：
①药物
受试化合物(-)-(3R,5S,7R,8R,9R,10S,13R,15R)-3-乙酰氧基-7-羟基-15-乙氧基-9,13；15,16-双环氧半日花烷-6-酮(Ⅱ)和(-)-(5S,7R,8R,9R,10S,13R,15R)-7-羟基-15-乙氧基-9,13；15,16-双环氧半日花烷-6-酮(Ⅲ)用DMSO配置成10mM的贮备液，-10℃保存，临用前用生理盐水稀释成0.1mM。阳性药物(硫酸氢氯吡格雷片)，配置方法同上。
②动物
SD大鼠，清洁级，雌雄不拘，体重200～240g，由成都中医药大学实验动物研究中心提供。生产质量合格证号：SCXK(川)2008-11。
③试剂
二磷酸腺苷二钠(adenosine-5′-diphosphate,ADP)，美国sigma公司生产，国内分装，1g/瓶。
二甲基亚砜(DMSO)，分析纯，500ml/瓶，购于成都科龙化工试剂厂。
④实验仪器
多通道血小板聚集仪(APACT/2型，德国兰波)
电子天平(ESJ120-4型，沈阳龙腾电子称量仪器有限公司)；
水浴锅，低温冰箱等。
(2)实验方法：
选用成年、健康SD大鼠，雌雄不拘，适应环境后，股动脉采血，以3.8％枸椽酸钠与血液1：9的比例抗凝，然后以800r/min离心10min，制备富血小板血浆(platelet-rich plasma,PRP)，剩余部分以3000r/min离心10min制备贫血小板血浆(platelet-poor plasma,PPP)。以PPP调零，取200μl PRP加入比浊管中37℃温育5min，加入20μl受试药物溶液，使得终浓度均为0.1mM，空白组加入1％DMSO溶液。混匀后继续温育5min，然后加入ADP20μl(终浓度为0.05mg/ml)诱导聚集。用血小板聚集仪检测血小板最大聚集率，按下列公式计算血小板聚集抑制率(AIR)：
AIR＝[(空白对照组最大聚集率-给药组最大聚集率)/空白对照组最大聚集率]×100％
③实验结果和评价：
结果见表2。
表2化合物Ⅱ和Ⅲ对体外血小板聚集的影响()
注：与生理盐水组比较，*P<0.05。
通过研究发现：在终浓度为0.1mM时，受试化合物(-)-(3R,5S,7R,8R,9R,10S,13R,15R)-3-乙酰氧基-7-羟基-15-乙氧基-9,13；15,16-双环氧半日花烷-6-酮(Ⅱ)和(-)-(5S,7R,8R,9R,10S,13R,15R)-7-羟基-15-乙氧基-9,13；15,16-双环氧半日花烷-6-酮(Ⅲ)对体外ADP诱导的血小板聚集有明显的抑制作用(P<0.05)，抑制率分别为19.59％和15.27％，与阳性对照组抑制率16.91％相当。
试验例2具有13S构型的双螺环半日花烷型二萜(式Ⅴ、Ⅵ、Ⅸ所示化合物)的抗血小板聚集试验
(1)实验材料：
①药物
受试化合物(-)-(5S,7R,8R,9R,10S,13S,15S)-7-羟基-15-甲氧基-9,13；15,16-双环氧半日花烷-6-酮(Ⅴ)、(-)-(3R,5S,7R,8R,9R,10S,13S,15S)-3-乙酰氧基-7-羟基-15-甲氧基-9,13；15,16-双环氧半日花烷-6-酮(Ⅵ)、(+)-(5S,7R,8R,9R,10S,13S,15R)-7-羟基-15-甲氧基-9,13；15,16-双环氧半日花烷-6,16-二酮(Ⅸ)，用DMSO配置成10mM的贮备液，-10℃保存，临用前用生理盐水稀释成0.1mM。阳性药物(硫酸氢氯吡格雷片)，配置方法同上。
②动物
SD大鼠，清洁级，雌雄不拘，体重200～240g，由成都中医药大学实验动物研究中心提供。生产质量合格证号：SCXK(川)2008-11。
③试剂
二磷酸腺苷二钠(adenosine-5′-diphosphate,ADP)，美国sigma公司生产，国内分装，1g/瓶。
二甲基亚砜(DMSO)，分析纯，500ml/瓶，购于成都科龙化工试剂厂。
④实验仪器
多通道血小板聚集仪(APACT/2型，德国兰波)
电子天平(ESJ120-4型，沈阳龙腾电子称量仪器有限公司)；
水浴锅，低温冰箱等。
(2)实验方法：
选用成年、健康SD大鼠，雌雄不拘，适应环境后，股动脉采血，以3.8％枸椽酸钠与血液1：9的比例抗凝，然后以800r/min离心10min，制备富血小板血浆(platelet-rich plasma,PRP)，剩余部分以3000r/min离心10min制备贫血小板血浆(platelet-poor plasma,PPP)。以PPP调零，取200μl PRP加入比浊管中37℃温育5min，加入20μl受试药物溶液，使得终浓度均为0.1mM，空白组加入1％DMSO溶液。混匀后继续温育5min，然后加入ADP20μl(终浓度为0.05mg/ml)诱导聚集。用血小板聚集仪检测血小板最大聚集率，按下列公式计算血小板聚集抑制率(AIR)：
AIR＝[(空白对照组最大聚集率-给药组最大聚集率)/空白对照组最大聚集率]×100％
③实验结果和评价：
结果见表3。
表3化合物Ⅴ、Ⅵ和Ⅸ对体外血小板聚集的影响()
通过研究发现：在终浓度为0.1mM时，受试化合物化合物(-)-(5S,7R,8R,9R,10S,13S,15S)-7-羟基-15-甲氧基-9,13；15,16-双环氧半日花烷-6-酮(Ⅴ)、(-)-(3R,5S,7R,8R,9R,10S,13S,15S)-3-乙酰氧基-7-羟基-15-甲氧基-9,13；15,16-双环氧半日花烷-6-酮(Ⅵ)、(+)-(5S,7R,8R,9R,10S,13S,15R)-7-羟基-15-甲氧基-9,13；15,16-双环氧半日花烷-6,16-二酮(Ⅸ)对体外ADP诱导的血小板聚集有一定的抑制作用，其中Ⅵ的作用趋势明显。
由以上试验例可知，益母草中分离获得的双螺环半日花烷型二萜对血小板聚集有一定的抑制作用。其中，具有13S构型的双螺环半日花烷型二萜效果较弱；而具有13R构型的双螺环半日花烷型二萜，效果明显，在同浓度下(0.1mM)，与抗血小板聚集药物“硫酸氢氯吡格雷”相当，为新颖的天然抗血小板聚集药物的开发提供了新的选择。

Claims (9)

1.式A所示化合物或其药学上可接受的盐：
其中，R1选自H、-OH、-OAc、-OMe或-OEt；
R2选自H、-Ac、-Me或-Et；
R3选自H、-OMe、-OEt、-OH或无；
R4选自H、-OMe、-OEt、-OH或无；
R5选自H或＝O；
X、Y分别独立选自O或C，X、Y为不同元素。
2.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于：所述化合物为：
或
R3选自-OMe、-OEt或-OH。
3.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于：所述化合物为：
或
R4选自-OMe、-OEt或-OH，R5选自H。
4.根据权利要求1～3任意一项所述的化合物，其特征在于：R1选自H或-OAc；R2选自H；R3或R4选自-OMe或-OEt。
5.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于：所述化合物为如下之一：
6.权利要求5所述式Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ化合物的制备方法，它包括如下操作步骤：
(1)称取益母草药材，粉碎，加95％v/v乙醇提取，提取液减压回收溶剂后，得到乙醇浸膏；
(2)将乙醇浸膏用水分散，依次用乙酸乙酯萃取，合并乙酸乙酯部分，减压回收溶剂，得乙酸乙酯浸膏；
(3)采用硅胶柱色谱对乙酸乙酯浸膏进行分离，石油醚：丙酮＝(100:1)～(0:1)梯度洗脱，取石油醚-丙酮＝5:1洗脱部分上反相聚苯乙烯型树脂柱，50-100％v/v甲醇水溶液梯度洗脱，收集70％甲醇洗脱部分，再通过中压液相色谱，十八烷基键合硅胶色谱柱，50-95％v/v甲醇水溶液梯度洗脱，收集70～75％甲醇水溶液洗脱部分，回收溶剂，剩余物再经Sephadex LH-20葡聚糖凝胶柱色谱分离，石油醚﹕三氯甲烷﹕甲醇＝5﹕5﹕1洗脱，收集洗脱液，回收溶剂，剩余物上反相液相制备色谱，82％v/v甲醇水溶液洗脱，分别收集不同出峰时间的洗脱液，即可得到式Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ化合物。
7.权利要求5所述式Ⅴ或Ⅸ化合物的制备方法，它包括如下操作步骤：
(1)称取益母草药材，粉碎，加95％v/v乙醇提取，提取液减压回收溶剂后，得到乙醇浸膏；
(2)将乙醇浸膏用水分散，用乙酸乙酯萃取，合并乙酸乙酯部分，减压回收溶剂，得乙酸乙酯浸膏；
(3)采用硅胶柱色谱对乙酸乙酯浸膏进行分离，石油醚：丙酮＝(100:1)～(0:1)梯度洗脱，取石油醚-丙酮＝5:1洗脱部分上反相聚苯乙烯型树脂柱，50-100％v/v甲醇水溶液梯度洗脱，收集70％甲醇洗脱部分，再通过中压液相色谱，十八烷基键合硅胶色谱柱，50-95％v/v甲醇水溶液梯度洗脱，薄层追踪，收集65～70％洗脱液，回收溶剂，剩余物再经制备薄层色谱分离，石油醚﹕丙酮＝5﹕1展开，收集洗脱液，回收溶剂，剩余物上反相液相制备色谱，78％v/v甲醇水溶液洗脱，分别收集不同出峰时间的洗脱液，即得式Ⅴ或Ⅸ化合物。
8.权利要求1～5任意一项所述化合物或其药学上可接受的盐在制备抗血小板聚集类药物中的用途。
9.一种药物组合物，其特征在于：它含有权利要求1～5任意一项所述化合物或其药学上可接受的盐。
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