CN110922440B - 吲哚氮苷类化合物及提取方法及在制备防治神经系统疾病药物中的应用 - Google Patents

吲哚氮苷类化合物及提取方法及在制备防治神经系统疾病药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了吲哚氮苷类化合物及提取方法及在制备防治神经系统疾病药物中的应用，吲哚氮苷类化合物，具有式(I)所示结构：
Figure DDA0002256981600000011
本发明的吲哚氮苷类化合物能有效地保护CoCl2所致的PC12细胞损伤，提示本发明化合物可作为神经保护的药物。

Description

吲哚氮苷类化合物及提取方法及在制备防治神经系统疾病药 物中的应用
技术领域
本发明涉及中药提取领域，涉及一种吲哚氮苷类化合物、提取方法及应用。
背景技术
吲哚类结构是自然界中最广泛存在的杂化结构，吲哚类生物碱也是迄今发现最多的一类生物碱。许多含有吲哚结构的化合物已被证实具有显著的生物活性，如抗癌、抗炎、抗菌、抗病毒、抗氧化和胆碱酯酶抑制等[1-5]。并且吲哚环结构在很多药物中也广泛存在，代表药物有：消炎药吲哚美辛[6]，小分子酪氨酸激酶抑制剂SU5614[7]，由勃林格殷格翰公司开发的一种胰腺癌化疗的小分子血管激酶抑制剂Nintedanib[8]，用于实体瘤的Vinblastine以及治疗非小细胞肺癌、乳腺癌的Vinorel bine[9],治疗风湿性关节炎的Tenidap[10]等。但迄今为止，对吲哚氮苷类化合物及其生物活性研究较少，对该类成分的神经保护活性更是未见报道。
中药娑罗子是七叶树科植物七叶树Aesculus chinensis Bge.、浙江七叶树Aesculus chinensis Bge.var.chekiangensis(Hu et Fang)Fang或天师栗AesculuswilsoniiRehd的干燥成熟种子，为药典收载品种[11]。性温味甘，归肝、胃经。有疏肝、理气、和胃、止痛的功效，用于治疗肝胃气滞、胸腹胀闷、胃脘疼痛等症状。
近年来，国内外学者对娑罗子的化学成分，药理作用以及临床应用进行了广泛的研究。娑罗子的化学成分主要为三萜皂苷类成分[12-15]，另外还有黄酮类[16-17]、甾醇类[18]等其他成分。其中七叶皂苷是从娑罗子中分离出来的一种重要组分，具有良好的结构多样性以及显著的药理活性。现代药理学研究表明，娑罗子具有抗炎[19-20]，抗肿瘤[21-22]，胃肠道保护作用[23]，缺血损伤保护等作用[24]，并在临床上广泛应用，主要用于治疗脑出血、脑水肿，慢性静脉功能不全，改善血液循环，促进脑功能修复[25-27]。
大量关于娑罗子化学成分的研究中，未见本发明所涉及的吲哚氮苷类化合物。同时，也未见本发明中所涉及的吲哚氮苷类化合物对CoCl2所致的PC12细胞损伤保护作用的相关报道。
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发明内容
本发明的目的是提供吲哚氮苷类化合物。
本发明的第二个目的是提供吲哚氮苷类化合物的提取方法。
本发明的第三个目的是提供吲哚氮苷类化合物在制备防治神经系统疾病药物中的应用。
本发明的第四个目的是提供含吲哚氮苷类化合物的药物组合物。
本发明的第五个目的是提供上述药物组合物在制备防治神经系统疾病药物中的应用。
本发明的技术方案概述如下：
吲哚氮苷类化合物，具有式(I)所示结构：
Figure BDA0002256981580000041
其中：
R1为H或葡萄糖基；R2为H或葡萄糖基；R3为H或葡萄糖基；R4为H或羟甲基；R5为乙酸基、乙酸甲酯基或甲醛基。
上述化合物，优选的化合物结构式为：
Figure BDA0002256981580000042
Figure BDA0002256981580000051
上述吲哚氮苷类化合物的提取方法，包括如下步骤：
(1)将娑罗子干燥成熟种子粗碎，加入娑罗子干燥成熟种子质量8-10倍的体积浓度为60-70％的乙醇水溶液，加热回流提取，提取2-4次，合并提取液，浓缩至65℃，相对密度为1.15-1.25的浸膏；
(2)将步骤(1)得到的浸膏分散到5-10质量倍的蒸馏水中，经D101或HP 20或AB-8型大孔吸附树脂柱色谱，以水、体积浓度为20％、60％和95％的乙醇水溶液梯度洗脱，收集20％乙醇水溶液洗脱的馏分，减压浓缩至65℃，相对密度为1.15-1.25的浸膏；
(3)将步骤(2)得到的浸膏分散到3-5质量倍的蒸馏水中，经KSP型大孔吸附树脂柱色谱分离，以水、体积浓度为30％和95％的乙醇水溶液梯度洗脱，收集30％乙醇水溶液洗脱的馏分，减压浓缩至65℃，相对密度为1.15-1.25的浸膏；
(4)将步骤(3)得到的浸膏经硅胶柱色谱分离，以体积比为9:1:0.1、8:2:0.2、7:3:0.5和6:4:0.8的二氯甲烷－甲醇-水梯度洗脱，得到馏分Fr.1、Fr.2、Fr.3和Fr.4；
(5)馏分Fr.2经制备HPLC色谱，以体积比为12:88的乙腈-水为流动相，进行纯化，得到化合物7和化合物8；
(6)馏分Fr.3经Sephadex LH-20柱色谱分离，以体积比为1:1的甲醇-水为洗脱剂等度洗脱，得到馏分Fr.3-1和Fr.3-2；
(7)馏分Fr.3-1经制备HPLC色谱，以体积比为1:9的乙腈-水为流动相，进行纯化，得到化合物5；
(8)馏分Fr.3-2经制备HPLC色谱，以体积比为1:9的乙腈-水为流动相，进行纯化，得到化合物3和化合物6；
(9)馏分Fr.4经Sephadex LH-20柱色谱分离，以体积比为3:7的甲醇-水为洗脱剂等度洗脱，得到馏分Fr.4-1和Fr.4-2；
(10)馏分Fr.4-1经制备HPLC色谱，以体积比为8:92的乙腈-水为流动相，进行纯化，得到化合物4；
(11)馏分Fr.4-2经制备HPLC色谱，以体积比为1:9的乙腈-水为流动相，进行纯化，得到化合物1和化合物2。
上述吲哚氮苷类化合物在制备防治神经系统疾病药物中的应用。
一种药物组合物，包含上述吲哚氮苷类化合物或其药学上可接受的盐，和药学上可接受的载体和/或赋形剂；
上述药物组合物在制备防治神经系统疾病药物中的应用。
本发明的优点：
本发明的吲哚氮苷类化合物能有效地保护CoCl2所致的PC12细胞损伤，提示本发明化合物可作为神经系统保护的药物。
附图说明
图1为化合物1-10对PC12细胞存活率的影响。
图2为化合物1-10对CoCl2诱导的PC12细胞存活率的影响。
具体实施方式
下面将结合具体实施例对本发明的技术方案进行描述，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
吲哚氮苷类化合物的提取方法，包括如下步骤：
(1)取娑罗子干燥成熟种子8.8kg，粗碎后，以10质量倍的体积浓度70％的乙醇水溶液加热回流提取3次，每次3小时，合并提取液，减压浓缩至65℃，得到相对密度为1.20的浸膏2.1kg；
(2)将步骤(1)得到的浸膏分散到5质量倍的蒸馏水中，离心取上清液，进行D101型大孔树脂开放柱色谱分离(20×90cm)，依次用4倍柱床体积的水、20％、60％、95％的乙醇水溶液进行梯度洗脱，收集20％乙醇水溶液洗脱的馏分，减压浓缩至65℃，得到相对密度为1.15的浸膏225g；
(3)将步骤(2)得到的浸膏分散到3质量倍的蒸馏水中，离心取上清液，经KSP型大孔吸附树脂柱色谱分离(15×40cm)，依次用3倍柱床体积的水、30％、95％的乙醇水溶液进行梯度洗脱，收集30％乙醇水溶液洗脱的馏分，减压浓缩至65℃，相对密度为1.15的浸膏26g；
(4)将步骤(2)得到的浸膏经硅胶柱色谱分离，以体积比分别为9:1:0.1、8:2:0.2、7:3:0.5和6:4:0.8的二氯甲烷－甲醇-水为洗脱剂梯度洗脱，得到馏分Fr.1(5.3g)、Fr.2(2.2g)、Fr.3(6.7g)和Fr.4(7.3g)；
(5)馏分Fr.1经制备HPLC色谱，以体积比为15:85的乙腈-水为流动相，进行纯化，得到化合物9(25.2mg，tR 18.3min)和化合物10(55.1mg，tR20.7 min)；
(6)馏分Fr.2经制备HPLC色谱，以体积比为12:88的乙腈-水为流动相，进行纯化，得到化合物7(18.3mg，tR 14.2min)和化合物8(9.7mg，tR 17.3min)；
(7)馏分Fr.3经Sephadex LH-20柱色谱分离，以体积比为1:1的甲醇-水为洗脱剂等度洗脱，得到馏分Fr.3-1(200mg)和Fr.3-2(1.2g)；
(8)馏分Fr.3-1经制备HPLC色谱，以体积比为1:9的乙腈-水为流动相，进行纯化，得到化合物5(16.1mg，tR 10.1min)；
(9)馏分Fr.3-2经制备HPLC色谱，以体积比为1:9的乙腈-水为流动相，进行纯化，得到化合物3(19.0mg，tR9.3 min)和化合物6(18.4mg，tR 11.5min)；
(10)馏分Fr.4经Sephadex LH-20柱色谱分离，以体积比为3:7的甲醇-水为洗脱剂等度洗脱，得到馏分Fr.4-1(150mg)和Fr.4-2(2.1g)；
(11)馏分Fr.4-1经制备HPLC色谱，以体积比为8:92的乙腈-水为流动相，进行纯化，得到化合物4(23.2mg，tR8.9 min)；
(12)馏分Fr.4-2经制备HPLC色谱，以体积比为1:9的乙腈-水为流动相，进行纯化，得到化合物1(36.7mg，tR 11.3min)和化合物2(25.8mg，tR 16.2min)。
通过理化常数和现代波谱学手段(MS、NMR)，结合文献相关数据，鉴定了它们的结构(化合物1-10)，化合物1-10结构式如下：
Figure BDA0002256981580000081
Figure BDA0002256981580000091
各化合物的物理化学和常数如下：
化合物1：黄褐色胶状；
Figure BDA0002256981580000092
–3.2(c 0.10,MeOH)；1H NMR见表1-1,13C NMR见表2-1；HR-ESI-MS:m/z 470.1655[M+H]+(calcd.for C21H28NO11,470.1662)。
化合物2：黄褐色胶状；
Figure BDA0002256981580000093
–2.0(c 0.10,MeOH)；1H NMR见表1-1,13C NMR见表2-1；HR-ESI-MS:m/z 484.1811[M+H]+(calcd.for C22H30NO11,484.1819)。
化合物3：黄褐色胶状；
Figure BDA0002256981580000094
–2.2(c 0.08,MeOH)；1H NMR见表1-1,13C NMR见表2-1；HR-ESI-MS:m/z 440.1549[M+H]+(calcd.for C20H26NO10,440.1557)。
化合物4：黄褐色胶状；
Figure BDA0002256981580000095
–6.3(c 0.11,MeOH)；1H NMR见表1-1,13C NMR见表2-1；HR-ESI-MS:m/z 632.2150[M+H]+(calcd.for C27H38NO16,632.2191)。
化合物5：黄褐色胶状；
Figure BDA0002256981580000096
–2.0(c 0.09,MeOH)；1H NMR见表1-1,13C NMR见表2-1；HR-ESI-MS:m/z 308.1136[M+H]+(calcd.for C15H18NO6,308.1134)。
化合物6：黄褐色胶状；
Figure BDA0002256981580000101
–4.8(c 0.10,MeOH)；1H NMR见表1-2,13C NMR见表2-2；HR-ESI-MS:m/z 500.1762[M+H]+(calcd.for C22H30NO12,500.1768)。
化合物7：黄褐色胶状；
Figure BDA0002256981580000102
–5.3(c 0.11,MeOH)；1H NMR见表1-2,13C NMR见表2-2；HR-ESI-MS:m/z 338.1238[M+H]+(Calcd.for C16H20NO7,338.1240)。
化合物8：黄褐色胶状；
Figure BDA0002256981580000103
–4.1(c 0.08,MeOH)；1H NMR见表1-2,13C NMR见表2-2；HR-ESI-MS:m/z 368.1350[M+H]+(Calcd.for C17H21NO7,368.1345)。
化合物9：黄褐色胶状；
Figure BDA0002256981580000104
–2.7(c 0.10,MeOH)；1H NMR见表1-2,13C NMR见表2-2；HR-ESI-MS:m/z 190.0865[M+H]+(Calcd.for C11H12NO2,190.0868)。
化合物10：黄褐色胶状；
Figure BDA0002256981580000105
–3.8(c 0.10,MeOH)；1H NMR见表1-2,13C NMR见表2-2；HR-ESI-MS:m/z 176.1609[M+H]+(Calcd.for C10H10NO2,176.1713)。
表1-1化合物1-5的1H NMR数据
Figure BDA0002256981580000106
Figure BDA0002256981580000111
注：溶剂为CD3OD，氢谱测试600MHz
表1-2化合物6-10的1H NMR数据
Figure BDA0002256981580000112
Figure BDA0002256981580000121
注：溶剂为CD3OD，氢谱测试600MHz
表2-1化合物1-5的13C NMR数据
Figure BDA0002256981580000122
Figure BDA0002256981580000131
注：溶剂为CD3OD，碳谱测试150MHz
表2-2化合物6-10的13C NMR数据
Figure BDA0002256981580000132
Figure BDA0002256981580000141
注：溶剂为CD3OD，碳谱测试150MHz
实施例2
吲哚氮苷类化合物的提取方法，包括如下步骤：
(1)取娑罗子干燥成熟种子8.8kg，粗碎后，以8质量倍的体积浓度60％的乙醇水溶液加热回流提取4次，每次3小时，合并提取液，减压浓缩至65℃，得到相对密度为1.15的浸膏；
(2)将步骤(1)得到的浸膏分散到7质量倍的蒸馏水中，经HP 20型大孔吸附树脂柱色谱(20×90cm)，依次用4倍柱床体积的水、体积浓度为20％、60％和95％的乙醇水溶液梯度洗脱，收集20％乙醇水溶液洗脱的馏分，减压浓缩至65℃，相对密度为1.25的浸膏；
(3)将步骤(2)得到的浸膏分散到4质量倍的蒸馏水中，经KSP型大孔吸附树脂柱色谱分离，以水、体积浓度为30％和95％的乙醇水溶液梯度洗脱，收集30％乙醇水溶液洗脱的馏分，减压浓缩至65℃，相对密度为1.25的浸膏；
(4)-(12)同实施例1，制备得到化合物1-10。
实施例3
吲哚氮苷类化合物的提取方法，包括如下步骤：
(1)取娑罗子干燥成熟种子8.8kg，粗碎后，以9质量倍的体积浓度65％的乙醇水溶液加热回流提取2次，每次3小时，合并提取液，减压浓缩至65℃，得到相对密度为1.25的浸膏；
(2)将步骤(1)得到的浸膏分散到10质量倍的蒸馏水中，经AB-8型大孔吸附树脂柱色谱(20×90cm)，依次用4倍柱床体积的水、体积浓度为20％、60％和95％的乙醇水溶液梯度洗脱，收集20％乙醇水溶液洗脱的馏分，减压浓缩至65℃，相对密度为1.20的浸膏；
(3)将步骤(2)得到的浸膏分散到5质量倍的蒸馏水中，经KSP型大孔吸附树脂柱色谱分离，以水、体积浓度为30％和95％的乙醇水溶液梯度洗脱，收集30％乙醇水溶液洗脱的馏分，减压浓缩至65℃，相对密度为1.20的浸膏；
(4)-(12)同实施例1，制备得到化合物1-10。
实施例4
化合物1-10对CoCl2损伤的PC12细胞的保护作用
(1)供试细胞系
高分化大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞株PC12，购于中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。
(2)实验材料
RPMI 1640，Gibco公司，Hyclone胎牛血清，Hyclone公司；胰蛋白酶，Biosharp公司；青霉素，东北制药集团公司沈阳第一制药厂；链霉素，山东鲁抗医药股份有限公司；EDTA，Sigma公司；3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazoliumbromide(MTT)，Sigma-Aldrich公司；Dimetylsulfoxide(DMSO)，索莱宝公司；CoCl2，Sigma公司；trolox(水溶性维生素E)，Sigma公司。
(3)仪器设备
二氧化碳恒温培养箱(上海力申有限公司)，生物安全柜(中国海尔有限公司)，倒置显微镜(日本Nikon公司)，Milli-Q超纯水一体机(美国默克密理博公司)，多功能酶标仪(上海基因有限公司)，微量振荡器(金坛市富华仪器有限公司)。
(4)细胞培养
高分化大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞株PC12细胞用含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基，在37℃和5％CO2培养箱中常规培养。每2天传代一次。
(5)化合物对PC12细胞毒性评价
取处于对数生长期的上述细胞100μL，以2×104cell/well的密度接种于96孔板中，置于CO2培养(37℃，5％CO2，饱和湿度)中培养24小时后弃去培养基，加入100μL含有10μM药物浓度的培养基，每组设置3个复孔。置于5％CO2恒温培养箱，37℃条件下继续培养24h后，弃去上清液，之后每孔加入100μL 5mg/mLMTT，孵育2.5小时。后小心弃去培养液，每孔加入DMSO 150μL，用微量振荡器振荡10min使甲臜溶解，在490nm波长下利用酶标仪测定吸光度值(A)值，并按以下公式计算细胞死亡率:
死亡率(％)＝[(A490,Control-A490,Sample)/(A490,Control-A490,Blank)]×100％
(6)化合物对CoCl2损伤PC12细胞的影响
取处于对数生长期的上述细胞100μL，以2×104cell/well的密度接种于96孔板中，置于CO2培养箱(37℃，5％CO2，饱和湿度)中培养24小时后弃去培养基，加入50μL 20μM的受试样品和阳性对照药trolox，每组设置3个复孔。温孵2h后加入50μL 2mM的CoCl2，设置阴性对照组。置于5％CO2恒温培养箱，37℃条件下继续培养24h后，弃去上清液，之后每孔加入100μL 5mg/mL MTT，孵育2.5小时。后小心弃去培养液，每孔加入DMSO 150μL，用微量振荡器振荡10min使甲臜溶解，在490nm波长测定吸光度值(A)值。
(7)统计学分析
实验独立重复操作至少3次，实验结果表示为平均值±SD。实验结果采用SPSS统计学软件进行单因素方差分析(ANOVA)。P＜0.05被认为具有统计学意义，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，与CoCl2诱导组比较。
(8)实验结果
如图1所示，10μM的化合物1-10对于PC12细胞并没有毒性。
从图2中可以看出，在10μM剂量下，化合物1-5表现出一定的神经保护活性(*P＜0.05)；其中化合物2,4的细胞存活率与阳性对照组相当(**P＜0.01)；化合物1,5表现出显著的细胞保护活性(***P＜0.001)，强于阳性对照药。化合物6-8表现出一定的神经细胞保护的趋势。
含有本发明所述化合物的组合物的神经保护药物可以为适用于口服或注射等应用形式，例如，按常规技术，加入药物可接受的载体和/或赋形剂制成片剂、胶囊剂、粉剂、糖浆剂、针剂等。
化合物具有药理活性，因此，含有该化合物的组合物也具有药理活性。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其中心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护。
本发明的吲哚氮苷类化合物、含吲哚氮苷类化合物的组合物能制备防治神经系统疾病药物。
其相关联的疾病包括但不仅限于：阿尔茨海默氏病，帕金森氏病，出血性脑损伤，缺血性脑损伤，脑外伤，肌萎缩性侧索硬化症或癫痫病等。

Claims (5)

1.吲哚氮苷类化合物，其特征是所述化合物结构式为：
Figure FDA0003904575080000011
2.权利要求1所述化合物的提取方法，其特征是包括如下步骤：
(1)将娑罗子干燥成熟种子粗碎，加入娑罗子干燥成熟种子质量8-10倍的体积浓度为60-70％的乙醇水溶液，加热回流提取，提取2-4次，合并提取液，浓缩至65℃，相对密度为1.15-1.25的浸膏；
(2)将步骤(1)得到的浸膏分散到5-10质量倍的蒸馏水中，经D101或HP 20或AB-8型大孔吸附树脂柱色谱，以水、体积浓度为20％、60％和95％的乙醇水溶液梯度洗脱，收集20％乙醇水溶液洗脱的馏分，减压浓缩至65℃，相对密度为1.15-1.25的浸膏；
(3)将步骤(2)得到的浸膏分散到3-5质量倍的蒸馏水中，经KSP型大孔吸附树脂柱色谱分离，以水、体积浓度为30％和95％的乙醇水溶液梯度洗脱，收集30％乙醇水溶液洗脱的馏分，减压浓缩至65℃，相对密度为1.15-1.25的浸膏；
(4)将步骤(3)得到的浸膏经硅胶柱色谱分离，以体积比为9:1:0.1、8:2:0.2、7:3:0.5和6:4:0.8的二氯甲烷－甲醇-水梯度洗脱，得到馏分Fr.1、Fr.2、Fr.3和Fr.4；
(5)馏分Fr.2经制备HPLC色谱，以体积比为12:88的乙腈-水为流动相，进行纯化，得到化合物7和化合物8；
(6)馏分Fr.3经Sephadex LH-20柱色谱分离，以体积比为1:1的甲醇-水为洗脱剂等度洗脱，得到馏分Fr.3-1和Fr.3-2；
(7)馏分Fr.3-1经制备HPLC色谱，以体积比为1:9的乙腈-水为流动相，进行纯化，得到化合物5；
(8)馏分Fr.3-2经制备HPLC色谱，以体积比为1:9的乙腈-水为流动相，进行纯化，得到化合物3和化合物6；
(9)馏分Fr.4经Sephadex LH-20柱色谱分离，以体积比为3:7的甲醇-水为洗脱剂等度洗脱，得到馏分Fr.4-1和Fr.4-2；
(10)馏分Fr.4-1经制备HPLC色谱，以体积比为8:92的乙腈-水为流动相，进行纯化，得到化合物4；
(11)馏分Fr.4-2经制备HPLC色谱，以体积比为1:9的乙腈-水为流动相，进行纯化，得到化合物1和化合物2。
3.权利要求1的吲哚氮苷类化合物在制备防治神经系统疾病药物中的应用。
4.一种药物组合物，其特征是包含权利要求1的吲哚氮苷类化合物或其药学上可接受的盐，和药学上可接受的载体和/或赋形剂。
5.权利要求4的药物组合物在制备防治神经系统疾病药物中的应用。
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