CN101284860B - 抗肿瘤药物组合物,其制备方法和其应用 - Google Patents

Abstract

抗肿瘤药物组合物，其中含有治疗有效量的结构式所示的化合物环苏黄杨宁M和药学上可接受的载体，其制备方法和其在制备抗肿瘤药物中的应用。

Description

抗肿瘤药物组合物,其制备方法和其应用

技术领域：

本发明涉及一种以三萜生物碱化合物环苏黄杨宁M为活性成分的药物组合物，以及它的制备方法及其在治疗肿瘤疾病中的应用。

背景技术：

据中药大辞典记载：中药黄杨性平，味苦，无毒。功用主治：祛风湿，理气，止痛，治风湿疼痛，胸腹胀气，牙痛，疼痛，跌打损伤。《本草纲目》记载黄杨木具有祛风除湿、行气活血的作用。黄杨木粉是民间流传治疗心病的有效药物。环维黄杨星D(Cyclovirobuxinum D)系从黄杨科植物小叶黄杨(Busus microphyllaSieb.et Zucc.)及其同属植物中提取的一种生物碱，亦称黄杨宁、环常绿黄杨碱D、黄杨碱等，化学结构属三萜生物碱。环维黄杨星D主要用于治疗气滞血瘀所致的胸痹心痛、脉结代、冠心病、心律失常者。现代药理研究显示：环维黄杨星D有保护神经元、抗心律失常及心肌缺血等作用。临床上，对缺血性心脏病、心律失常等均具有较好的作用，是我国成功研制的一种治疗心血管疾病的新药。多年的临床应用显示，环维黄杨星D对多种心律失常、心绞痛、冠心病、心功能不全等具有良好的疗效，并被收录于《中国药典)2000年版一部。

环维黄杨星D作为一种非苷类强心药服用药时安全性较大，且长期应用毒副作用低，这些都预示着这种从天然植物中提取的新药有着良好的应用前景。目前有关环维黄杨星D心血管药理作用的系统研究，如钙增敏作用、消除心肌肥大作用、对抗心肌缺血的治疗机理、对肾素一血管紧张素系统的影响等等，有待进一步深入研究。

黄杨木中生物碱一般对心绞痛、心律失常、心功能不全有较好的作用。现有技术中未见有黄杨三萜生物碱抗肿瘤活性的报道。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种以三萜生物碱化合物环苏黄杨宁M为活性成分的药物组合物，以及它的制备方法及其在治疗肿瘤疾病中的应用。

为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案：

抗肿瘤药物组合物，其中含有治疗有效量的结构式所示的化合物环苏黄杨宁M和药学上可接受的载体，

上述药物组合物的制备方法，采集小叶黄杨Buxus.microphylla的地上部分，粉碎后用70％丙酮常温渗漉提取3-4次，每次1-2天，合并提取液，减压浓缩至无丙酮蒸出，得到浸膏；所得浸膏加一定量的酸水稀释并调pH值为2-3，用乙酸乙酯萃取2-3次，得到非生物碱部分；酸水液碱化至pH为9-10，用氯仿萃取2-3次得到总生物碱部分；氯仿部分在常压硅胶柱上柱层析，用氯仿-甲醇梯度洗脱进行粗分，用TLC检测，得到4-6个部分.氯仿-甲醇(50∶1)部分再用石油醚-丙酮(石油醚-乙酸乙酯)梯度洗脱，洗脱得到化合物环苏黄杨宁M，再加入药学上可接受的载体即可。

更具体地制备方法为：取小叶黄杨地上部分，粉碎后用70％丙酮常温渗漉提取3次，每次2天；合并提取液，减压浓缩至无丙酮蒸出，得到浸膏，加酸水稀释调pH＝2，分别用3000ml乙酸乙酯萃取3次，得到非生物碱部分；酸水液碱化至pH＝10，用氯仿萃取3次得到生物碱部分；氯仿萃取拌硅胶在常压硅胶柱上柱层析，氯仿-甲醇(100∶0，50∶1，20∶1，10∶1，2∶1)梯度洗脱，用TLC检测，得到5个部分Fr.1-Fr.5；取Fr.2部分经硅胶柱层次石油醚-丙酮(20∶1，5∶1)得到Fr.2.1，Fr.2.2两个组分；Fr.2.1经继续上硅胶柱用石油醚-丙酮(40∶1，20∶1，10∶1)梯度洗脱，得到石油醚-丙酮(20∶1)洗脱液洗脱得到部分浓缩后分离纯化，并用Sephadex LH-20进一步纯化得到环苏黄杨宁M，再加入药学上可接受的载体即可。

本发明的药物组合物含有治疗有效量的化合物环苏黄杨宁M为活性成分，以及含有一种或多种药学上可接受的载体。

本发明的化合物和组合物可用于制备治疗肿瘤疾病的药物。尤其是用于制备治疗肝癌和白血病的药物。

上文所述的的药学上可接受的载体是指药学领域常规的药物载体，例如：稀释剂、赋形剂如水等，填充剂如淀粉、蔗糖等；黏合剂如纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮；湿润剂如甘油；崩解剂如琼脂、碳酸钙和碳酸氢钠；吸收促进剂如季铵化合物；表面活性剂如十六烷醇；吸附载体如高岭土和皂黏土；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙和镁、以及和聚乙二醇等。另外还可以在组合物中加入其它辅剂如香味剂、甜味剂等。

本发明化合物可以组合物的形式通过口服、鼻吸入、直肠或肠胃外给药的方式施用于需要这种治疗的患者。用于口服时，可将其制成常规的固体制剂如片剂、粉剂、粒剂、胶囊等，制成液体制剂如水或油悬浮剂或其他液体制剂如糖浆、酏剂等；用于肠胃外给药时，可将其制成注射用的溶液、水或油性悬浮剂等。优选的形式是片剂、胶囊和注射剂。本发明药物组合物的各种剂型可以按照药学领域的常规生产方法制备。例如使活性成分与一种或多种载体混合，然后将其制成所需的剂型。

本发明的药物组合物优选含有重量比为0.1％～99.5％的活性成分，最优选含有重量比为0.5％～95％的活性成分。

本发明化合物的施用量可根据用药途径、患者的年龄、体重、所治疗的疾病的类型和严重程度等变化，其日剂量可以是0.01～10mg/kg体重，优选0.1～5mg/kg体重。可以一次或多次施用。

具体实施方式：

下面结合本发明的实施例进一步来说明本发明的实质性内容，但不以此来限定本发明。

实施例1：

化合物环苏黄杨宁M的制备及其特征：

取小叶黄杨Buxus.microphylla地上部分14Kg，粉碎后用70％丙酮常温渗漉提取3次，每次2天；合并提取液，减压浓缩至无丙酮蒸出，得到浸膏800g，加酸水3000ml稀释调pH＝2，分别用3000ml乙酸乙酯萃取3次，得到非生物碱部分。酸水液碱化至pH＝10，用3000ml氯仿萃取3次得到生物碱部分135g。氯仿萃取(135g)拌硅胶180g在常压硅胶柱(硅胶400g)上柱层析，氯仿-甲醇(100∶0，50∶1，20∶1，10∶1，2∶1)梯度洗脱，用TLC检测，得到5个部分(Fr.1-Fr.5)。Fr.2(18g)硅胶柱层次石油醚-丙酮(20∶1，5∶1)得到Fr.2.1，Fr.2.2两个组分。Fr.2.1(4g)经继续上硅胶柱用石油醚-丙酮(40∶1，20∶1，10∶1)梯度洗脱，得到石油醚-丙酮(20∶1)洗脱液洗脱得到部分浓缩后分离纯化，并用Sephadex LH-20进一步纯化得到化合物环苏黄杨宁M(BM-8)纯品，重约13mg。

BM-8化合物的结构表征：

BM-8化合物：C24H35NO，无色针晶(丙酮)，UV(MeOH)λmax(logε)243(3.2)nm。

质谱EI-MS m/z：353(M+)，71，58。

氢核磁共振谱数据δ(ppm，CDCl3，500MHz)：2.86(dd，J＝4，11.6，H-3)，0.10，0.35(dd，J＝4.4，H-19)，0.94(s，18-CH3)，1.29(s，32-CH3)，2.46(s，N-CH3)，1.80(d，J＝7.6，21-CH3)，6.53(q，J＝7.6，H-20)，4.57(s，Ha-30)，4.80(s，Hb-30)。

碳核磁共振谱数据δ(ppm，CDCl3，500MHz)：31.7(t，C-1)，23.4(t，C-2)，63.5(d，C-3)，153.6(s，C-4)，44.1(d，C-5)，23.4(t，C-6)，26.4(t，C-7)，45.4(d，C-8)，22.7(s，C-9)，32.4(s，C-10)，25.5(t，C-11)，34.4(t，C-12)，42.3(s，C-13)，46.7(s，C-14)，49.3(t，C-15)，206.5(d，C-16)，146.5(d，C-17)，13.2(q，18-CH3)，29.3(t，C-19)，130.2(d，C-20)，20.8(q，21-CH3)，101.0(t，C-30)，24.1(q，32-CH3)，34.5(q，N-CH3)。

红外光谱数据IR(KBr)vmax：3610，2982，1705，1640cm-1。

BM-8化合物名称为：化合物环苏黄杨宁M(CyclosuffrobuxinineM)

BM-8化合物的化学结构：

实施例2：

化合物BM-8的抗肿瘤生物活性试验：

采用体外抗肿瘤细胞毒性的生物活性测定方法：

抗肿瘤药物筛选的细胞系培养于含5％胎牛血清，2m M L-谷氨酸的RPMI 1640培养基中。一个典型的筛选过程如下：于96孔板中每孔加入100μl密度为5×104--4×105/ml的细胞。细胞密度的选择依赖于细胞传代的时间即由一个细胞变为两个细胞所需要的时间。然后置于37℃，5％CO2，95％空气，100％相对湿度环境下培养24小时。24小时后，每个细胞系取两块板，用含TCA的situ固定，以测定药物加入前的细胞数(Tz)。待测药物用DMSO溶解，终浓度为所需浓度的400倍，冷冻保存。按所需取出药物，融化，用含50μg/ml庆大霉素的完全培养基稀释至浓度为所需最大浓度的2倍。除4倍梯度稀释外，也采用10倍或者1/2log梯度稀释药物。每个药物5个梯度，设对照。然后向含细胞的孔中每孔加入稀释好的药物100μl，那么药物浓度为所需浓度。

加药后，37℃，5％CO2，95％空气，100％相对湿度环境下培养48小时。对于贴壁细胞，通过加入冰冷的TCA杀死细胞。具体操作如下：逐滴加入50μl含50％(w/v)TCA(重浓度10％TCA)，4℃，放置60分钟，固定细胞，去上清，逐滴加入水，洗涤5次，空气中干燥。每孔加入100μl 0.4％(w/v且用1％乙酸稀释)，室温孵育10分钟。染色结束后用1％乙酸洗涤5次，除去未结合的染料，空气中干燥。结合的染料用10Mm trizma base溶解。自动读板仪测定光吸收(515nm)。对于悬浮细胞，杀死细胞时逐滴加入50μl 80％TCA(终浓度16％)，将细胞固定于板底，其余步骤与贴壁细胞相同。用7个光吸收值(加入药物前的：Tz；对照：C；五个药物浓度：Ti；)，可以计算各个药物浓度下细胞的生长水平。

药物对肿瘤细胞生长抑制的计算如下：

当Ti≥Tz时，在药物浓度i的生长抑制率为：[(Ti-Tz)/(C-Tz)]×100；

当Ti≤Tz时，在药物浓度i的生长抑制率为：[(Ti-Tz)/Tz]×100；

反映量效的三个参数的计算如下：

GI50(生长抑制50％)可由[(Ti-Tz)/(C-Tz)]×100＝50计算得出。其反映药物导致试验组蛋白增加比对照组增加减少50％时的药物浓度。

TGI(生长完全抑制)可由Ti＝Tz计算得出。

LC50(导致药物处理后蛋白的含量比处理前减少50％的药物浓度)，显示处理后细胞的净损失，其可以由[(Ti-Tz)/Tz]×100＝50计算得出。如果活性达到一定水平的话，可以计算出这三个参数值。如果活性太低或者太高，参数的值可以用大于或者小于 最大或者最小的试验浓度来表示。

     表1化合物BM-8的细胞毒生物生物活性(IC50 in μM)

Compound	Cell lineHepG2(肝癌细胞株)       K562(白血病细胞株)
		BM-8	0.78                    0.37
ControlCisplatin	1.45                    8.54

从表1中数据可以看出：化合物BM-8对肿瘤细胞系HepG2(肝癌细胞株)、K562(白血病细胞株)的细胞毒生物活性(IC50 in μM)十分明显：化合物BM-8对两种肿瘤细胞系的抑制活性IC50，均在μM数量级上；对两个个肿瘤细胞系HepG2(肝癌细胞株)、K562(白血病细胞株)的生物活性更是十分明显，IC50分别达0.78，0.37μM，足见BM-8抑制肿瘤细胞的显著活性。表明化合物BM-8对肿瘤细胞系的抑制活性十分强，比阳性对照顺铂(Cisplatin)的活性要好。阳性对照顺铂(Cisplatin)是目前仍然广泛应用的临床抗肿瘤化疗药物，表明化合物BM-8对肿瘤细胞系HepG2(肝癌细胞株)、K562(白血病细胞株)的细胞毒生物活性(IC50 in μM)十分明显，具有很好的潜在抗白血病、肝癌肿瘤的治疗药物的开发及其利用前景。

实施例3：

片剂：实施例1所得化合物BM-8 10mg，乳糖180mg，淀粉55mg，硬脂酸镁5mg；

制备方法：将化合物、乳糖和淀粉混合，用水均匀湿润，把湿润后的混合物过筛并干燥，再过筛，加入硬脂酸镁，然后将混合物压片，每片重250mg，化合物含量为10mg。

实施例4：

安瓿剂：实施例1所得化合物BM-8 2mg，氯化钠10mg；

制备方法：将化合物和氯化钠溶解于适量的注射用水中，过滤所得溶液，在无菌条件下装入安瓿瓶中。

实施例5：

胶囊剂：实施例1所得化合物BM-8 10mg，乳糖187mg，硬脂酸镁3mg；

制备方法：将化合物与助剂混合，过筛，均匀混合，把得到的混合物装入硬明胶胶囊，每个胶囊重200mg，活性成分含量为10mg。

Claims (3)

1.结构式所示的化合物环苏黄杨宁M在制备抗肿瘤药物中的应用

2.结构式所示的化合物环苏黄杨宁M在制备抗肝癌药物中的应用

3.结构式所示的化合物环苏黄杨宁M在制备抗白血病药物中的应用