CN101570563B

CN101570563B - 阿尔廷烷型三萜化合物及其药物组合物和其制备方法与应用

Info

Publication number: CN101570563B
Application number: CN2009100945503A
Authority: CN
Inventors: 邱明华; 年寅; 张雁丽; 卿晨; 周琳; 陈剑超; 李忠荣
Original assignee: Kunming Institute of Botany of CAS
Current assignee: Kunming Institute of Botany of CAS
Priority date: 2009-06-05
Filing date: 2009-06-05
Publication date: 2011-11-23
Anticipated expiration: 2029-06-05
Also published as: CN101570563A

Abstract

一组新颖的环阿尔廷烷型三萜苷类化合物，它们的制备方法，含有治疗有效量的该类化合物和药学上可接受的载体的药物组合物，本发明的环阿尔廷烷型三萜苷类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用，特别是在制备抗肝癌药物中的应用。

Description

阿尔廷烷型三萜化合物及其药物组合物和其制备方法与应用

技术领域：

本发明属于药物化合物和药物学领域，具体地，涉及具有抗肿瘤活性的环阿尔廷烷型三贴苷类化合物KYY31、KYY41、KYY43，其制备方法和其在制备治疗和预防癌症疾病的药物中的应用。

背景技术：

升麻是我国著名的常用中药，地下根茎入药，其药用功效为清热解毒、升举阳气和发表透疹。民间主治头痛、牙痛、咽喉痛、麻疹及子宫脱垂等妇科疾病。在我国，升麻的药用价值早在《神农本草经》中就有记载，并被列为“上品”药材。在国内升麻属植物：绿升麻(Cimicifuga foetida L.)、兴安升麻(Cimicifuga dahurica Maxim)、大三叶升麻(Cimicifuga heracleifolia Kom)的根茎均作为中药升麻载入《中华人民共和国药典》2005版。同属植物黑升麻(Cimicifugaracemosa L.)，又称蛇根草，在欧美国家也有很长的使用历史。印地安人饮用煎煮的黑升麻药汁解除疲劳，治疗喉痛、关节炎与毒蛇咬伤等症，同时也用于治疗一些妇科疾病，并在1820-1926年被收入到美国药典。英国也将黑升麻载入英国草药典，1749年Linnaeus将黑升麻收入《Materia Medica》，20世纪初成为顺势疗法的主要药物之一。

迄今，现有技术中未见从绿升麻(Cimicifuga foetida L.)地上部分分离得到的具有选择性抑制人肝癌细胞株HepG2活性的环阿尔廷烷型三萜苷类化合物的报道。

发明内容：

本发明的目的在于提供一组新颖的环阿尔廷烷型三萜苷类化合物，并提供它们的制备方法，以及以它们为活性成分组成的药物组合物，和它们在制备抗肿瘤药物中的应用。

为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案：

下述结构式所示的环阿尔廷烷型三贴苷类化合物KYY31、KYY41、KYY43，

KYY31即25-O-乙酰基升麻醇-3-O-β-D-(4′-O-2-E-丁烯酰)木糖苷(4′-O-E-2-butenoyl-25-O-acetylcimigenol-3-O-β-D-xylopyanoside)

KYY 41即23-表-26-脱氧阿克特醇-3-O-β-D-(3′-O-乙酰)木糖苷(3′-O-acetyl-23-epi-26-deoxyactein)

KYY43即25-O-乙酰基升麻醇-3-O-β-D-(3′-O-乙酰)木糖苷(3′，25-O-diacetylcimigenol-3-O-β-D-xylopyranosid)。

药物组合物，其中含有治疗有效量的化合物KYY31或KYY41或KYY43和药学上可接受的载体。

化合物KYY31、KYY41、KYY43的制备方法，取绿升麻(Cimicifuga foetida L.)地上部分，粉碎后用95％甲醇70℃提取3-4次，每次1-2天，合并提取液，减压浓缩至无甲醇蒸出，得到浸膏；浸膏用蒸馏水稀释后，用石油醚萃取3-4次，减压回收石油醚后，得到石油醚萃取部分；剩下的水层用乙酸乙酯萃取4-5次，减压回收后得到富集三萜类化合物的乙酸乙酯萃取部分；乙酸乙酯部分经常压硅胶柱上柱层析，用氯仿-甲醇梯度洗脱进行粗分，用TLC检测，得到4-6个部分.氯仿-甲醇(50∶1)部分再用氯仿-丙酮梯度洗脱，得到3-4个部分，氯仿-丙酮(5∶1)部分再经过减压反相(RP-18)柱层析，用甲醇-水梯度洗脱得到3-4各部分；甲醇-水(70∶30)部分在常压硅胶上柱层析，用氯仿-丙酮(10∶1)反复洗脱得到KYY 31、KYY 41、KYY 43的粗品；化合物粗品在Sephadex LH-20柱上反复洗脱，得到化合物纯品。

以化合物KYY31、KYY41、KYY43为活性成分的药物组合物的制备方法，取绿升麻(Cimicifuga foetida L.)地上部分，粉碎后用95％甲醇70℃提取3-4次，每次1-2天，合并提取液，减压浓缩至无甲醇蒸出，得到浸膏；浸膏用蒸馏水稀释后，用石油醚萃取3-4次，减压回收石油醚后，得到石油醚萃取部分；剩下的水层用乙酸乙酯萃取4-5次，减压回收后得到富集三萜类化合物的乙酸乙酯萃取部分；乙酸乙酯部分经常压硅胶柱上柱层析，用氯仿-甲醇梯度洗脱进行粗分，用TLC检测，得到4-6个部分.氯仿-甲醇(50∶1)部分再用氯仿-丙酮梯度洗脱，得到3-4个部分，氯仿-丙酮(5∶1)部分再经过减压反相(RP-18)柱层析，用甲醇-水梯度洗脱得到3-4各部分；甲醇-水(70∶30)部分在常压硅胶上柱层析，用氯仿-丙酮(10∶1)反复洗脱得到KYY 31、KYY41、KYY43的粗品；化合物粗品在SephadexLH-20柱上反复洗脱，得到化合物纯品，再加入常用药用载体或赋形剂制成各种药用剂型。

化合物KYY31、KYY41、KYY43在制备抗肿瘤药物中的应用。

化合物KYY31、KYY41、KYY43在制备抗肝癌药物中的应用。

以化合物KYY31、KYY41、KYY43为活性成分的药物组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

以化合物KYY31、KYY41、KYY43为活性成分的药物组合物在制备抗肝癌药物中的应用。

上文所述的的药学上可接受的载体是指药学领域常规的药物载体，例如：稀释剂、赋形剂如水等，填充剂如淀粉、蔗糖等；黏合剂如纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮；湿润剂如甘油；崩解剂如琼脂、碳酸钙和碳酸氢钠；吸收促进剂如季铵化合物；表面活性剂如十六烷醇；吸附载体如高岭土和皂黏土；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙和镁、以及和聚乙二醇等。另外还可以在组合物中加入其它辅剂如香味剂、甜味剂等。

本发明化合物可以组合物的形式通过口服、鼻吸入、直肠或肠胃外给药的方式施用于需要这种治疗的患者。用于口服时，可将其制成常规的固体制剂如片剂、粉剂、粒剂、胶囊等，制成液体制剂如水或油悬浮剂或其他液体制剂如糖浆、酏剂等；用于肠胃外给药时，可将其制成注射用的溶液、水或油性悬浮剂等。优选的形式是片剂、胶囊和注射剂。

本发明药物组合物的各种剂型可以按照药学领域的常规生产方法制备。例如使活性成分与一种或多种载体混合，然后将其制成所需的剂型。

本发明的药物组合物优选含有重量比为0.1％～99.5％的活性成分，最优选含有重量比为0.5％～95％的活性成分。

本发明化合物的施用量可根据用药途径、患者的年龄、体重、所治疗的疾病的类型和严重程度等变化，其日剂量可以是0.01～10mg/kg体重，优选0.1～5mg/kg体重。可以一次或多次施用。

具体实施方式：

下面的实施例可以使本领域技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

实施例1：

化合物KYY31、KYY41、KYY43的制备方法及其结构鉴定：

1、化合物KYY 31、KYY 43和KYY 41的制备工艺：

从采集自云南、及各地的绿升麻(Cimicifuga foetida L.)的地上部分，粉碎后用95％甲醇70℃提取3-4次，每次1-2天，合并提取液，减压浓缩至无甲醇蒸出，得到浸膏。浸膏用一定量的蒸馏水稀释后，用石油醚萃取3-4次，减压回收石油醚后，得到石油醚萃取部分；剩下的水层用乙酸乙酯萃取4-5次，减压回收后得到富集三萜类化合物的乙酸乙酯萃取部分。乙酸乙酯部分经常压硅胶柱上柱层析，用氯仿-甲醇梯度洗脱进行粗分，用TLC检测，得到4-6个部分.氯仿-甲醇(50∶1)部分再用氯仿-丙酮梯度洗脱，得到3-4个部分.氯仿-丙酮(5∶1)部分再经过减压反相(RP-18)柱层析，用甲醇-水梯度洗脱得到3-4各部分。甲醇-水(70∶30)部分在常压硅胶上柱层析，用氯仿-丙酮(10∶1)反复洗脱得到KYY 31、KYY 41、KYY 43的粗品。化合物粗品在Sephadex LH-20柱上反复洗脱，得到化合物纯品。

具体地，云南省香格里拉县小中甸乡采集的绿升麻(Cimicifugafoetida L.)地上部分10Kg，粉碎后用95％甲醇70℃回流提取3次，每次1天；合并提取液，减压浓缩至无甲醇蒸出，得到浸膏750g，加蒸馏水2000ml稀释后，用2000ml石油醚萃取3次，减压回收石油醚后，得到石油醚萃取部分90g；剩下的水层用1800ml乙酸乙酯萃取4-5次，减压回收后得到富集三萜类化合物的乙酸乙酯萃取部分280g。乙酸乙酯萃取部分(280g)用硅胶600g拌样，在常压硅胶柱(硅胶2000g)经柱层析氯仿-甲醇(100∶0，50∶1，20∶1，10∶1，0∶1)梯度洗脱，用TLC检测，得到5个部分(Fr.1-Fr.5)。Fr.2(32g)用硅胶60g拌样，经常压正相柱层析氯仿-丙酮(10∶1，5∶1，2∶1)梯度洗脱得到Fr.2.1-Fr.2.3三个部分。Fr.2.2(6g)经减压反相硅胶柱(RP-18)用甲醇-水(60∶40，70∶30，100∶0)梯度洗脱，得到Fr.2.2.1-Fr.2.2.3三个部分。Fr.2.2.2(0.2g)经反复硅胶柱层析氯仿-丙酮(10∶1)洗脱得到KYY 31、KYY 43和KYY 41的粗品。三个粗品经SephadexLH-20进一步纯化得到KYY 31(19mg)，KYY 43(17mg)，KYY 41(18mg)。

2、化合物KYY 31、KYY 41、KYY 43的结构鉴定：

化合物KYY 31，C₄₁H₆₂O₁₁，白色粉末，mp325℃，[α]²⁵ _D 28.71(c0.24，MeOH)，高分辨质谱(HRTOF-ESIMS)(m/z：)753.4193[M+Na]⁺计算值(C₄₁H₆₂O₁₁Na，753.4189)。

氢谱数据¹H NMR δ(ppm，C₅D₅N，500MHz)：4.27(1H，s，15-H)，3.51(1H，dd，J＝11.6，4.0Hz，3-H)，2.30(1H，m)1.94(1H，m)(2-H)；2.11(1H，m)1.08(1H，m)(11-H)；2.08(1H，m)1.11(1H，m)(7-H)；1.68(1H，m，8-H)，1.67(1H，m)1.56(1H，m)(12-H)；1.65(1H，m，20-H)，1.58(1H，m)1.22(1H，m)(1-H)；1.52(1H，m)0.70(1H，m)(6-H)；1.44(1H，d，J＝10.8Hz，17-H)，1.30(1H，m，5-H)；0.50(1H，m)0.27(1H，d，J＝4.0Hz)(19-H)；1.14(3H，s，18-H)，0.84(3H，d，J＝6.8Hz，21-H)，1.69(3H，s，26-H)，1.66(3H，s，27-H)，1.19(3H，s，28-H)，1.31(3H，s，29-H)，1.04(3H，s，30-H)。4’-COCH＝CHCH₃部分：1.58(1H，d，J＝7.2Hz，1”-H)，6.97(1H，m，2”-H)，5.86(1H，d，J＝15.2Hz，3”-H)。木糖部分：4.90(1H，d，J＝7.6Hz，1’-H)，4.10(1H，t，J＝8.4Hz，2’-H)，4.33(1H，t，J＝8.8Hz，3’-H)，5.47(1H，m，4’-H)，4.37(1H，dd，J＝11.2，5.6Hz)，3.64(1H，t，J＝10.4Hz)(5’-H)。

碳谱数据¹³C NMRδ(ppm，C₅D₅N，500MHz)：112.4(s，16-C)，88.8(d，3-C)，86.8(d，24-C)，83.2(d，25-C)，80.2(d，15-C)，71.7(d，23-C)，59.4(d，17-C)，48.7(d，8-C)，47.5(d，5-C)，47.2(d，14-C)，41.8(s，13-C)，41.1(s，4-C)，37.9(t，22-C)，34.1(t，12-C)，32.2(t，1-C)，30.9(t，19-C)，30.0(t，2-C)，26.7(s，10-C)，26.5(t，11-C)，26.4(t，7-C)，25.5(q，29-C)，23.9(d，20-C)，23.4(q，26-C)，21.5(q，27-C)，21.1(t，6-C)，20.1(s，9-C)，19.5(q，18-C)，19.5(q，21-C)，15.3(q，30-C)，11.8(q，28-C)。4’-COCH＝CHCH₃部分：166.2(s，4”-C)，122.9(d，3”-C)，145.4(s，2”-C)，17.7(q，1”-C)。COCH₃部分：170.2(s，25-CO)，22.3(q，25-COCH₃)。木糖部分：107.4(d，1’-C)，75.8(d，2’-C)，75.1(d，3’-C)，73.0(d，4’-C)，63.7(t，5’-C)。

红外光谱数据IR(KBr)ν_max：3456，2950，2853，1740，1638，1464，1086，1043cm^-1。

KYY31的化学结构：

KYY31的名称为：25-O-乙酰基升麻醇-3-O-β-D-(4′-O-2-E-丁烯酰)木糖苷(4′-O-E-2-butenoyl-25-O-acetylcimigenol-3-O-β-D-xylopyanoside)。

化合物KYY 41，C₃₉H₅₈O₁₁，白色粉末，mp308℃，[α]²⁵ _D0(c 0.12，MeOH)，高分辨质谱(HRTOF-ESIMS)(m/z：)725.3863[M+Na]⁺计算值(C₃₉H₅₈O₁₁Na，725.3876)。

氢谱数据¹H NMRδ(ppm，C₅D₅N，500MHz)：5.07(1H，m，12-H)，4.22(1H，m，16-H)，；4.04(1H，d，J＝10.4Hz)3.60(1H，J＝10.4Hz)(26-H)；3.39(1H，dd，J＝11.6，4.4Hz，3-H)，2.69(1H，dd，J＝16.0，8，4Hz)1.17(1H，m)(11-H)；2.21(1H，m)1.82(1H，m)(2-H)；2.21(1H，m，20-H)，1.85(1H，m)1.73(1H，m)(15-H)；1.77(1H，m，17-H)，1.58(1H，m，8-H)，1.49(1H，m)1.10(1H，m)(1-H)；1.36(1H，m)0.55(1H，m)(6-H)；1.22(1H，m)0.89(1H，m)(7-H)；1.18(1H，m，5-H)；0.48(1H，d，J＝4.0Hz)0.16(1H，d，J＝4.0Hz)(19-H)；1.39(3H，s，18-H)，0.99(3H，d，J＝6.4Hz，21-H)，1.45(3H，s，27-H)，0.82(3H，s，28-H)，1.23(3H，s，29-H)，0.91(3H，s，30-H)。木糖部分：4.81(1H，d，J＝7.6Hz，1’-H)，4.04(1H，t，J＝8.4Hz，2’-H)，5.74(1H，t，J＝9.2Hz，3’-H)，4.21(1H，m，4’-H)，4.33(1H，dd，J＝11.2，5.6Hz)，3.71(1H，t，J＝10.8Hz)(5’-H)。

碳谱数据¹³C NMRδ(ppm，C₅D₅N，500MHz)：105.9(s，23-C)，88.84(d，3-C)，77.1(d，12-C)，74.5(d，16-C)，68.1(t，26-C)，62.5(s，25-C)，62.3(d，24-C)，56.2(d，17-C)，45.6(d，8-C)，48.8(s，13-C)，47.9(d，14-C)，47.0(d，5-C)，41.1(s，4-C)，37.6(t，22-C)，36.6(t，11-C)，31.9(t，1-C)，29.9(t，2-C)，29.4(t，19-C)，26.7(s，10-C)，25.6(t，7-C)，25.6(q，29-C)，23.3(d，20-C)，21.2(q，21-C)，20.3(t，6-C)，20.2(s，9-C)，19.6(q，28-C)，15.2(q，30-C)，14.3(q，27-C)，13.5(q，18-C)。COCH₃部分：170.8(s，3’-CO)，21.3(q，3’-COCH₃)，170.6(s，12-CO)，21.6(q，12-COCH₃)。木糖部分：107.2(d，1’-C)，73.1(d，2’-C)，79.3(d，3’-C)，69.2(d，4’-C)，66.8(t，5’-C)。

红外光谱数据IR(KBr)ν_max：3455，2930，2849，1737，1457，1376，1244，1033cm^-1。

KYY41的化学结构：

KYY41的名称为：23-表-26-脱氧阿克特醇-3-O-β-D-(3′-O-乙酰)木糖苷(3′-O-acetyl-23-epi-26-deoxyactein)。

化合物KYY43，C₃₉H₆₀O₁₁，白色粉末，mp318℃，[α]²⁵ _D 41.67(c0.16，MeOH)，高分辨质谱(HRTOF-ESIMS)(m/z：)727.4027[M+Na]⁺计算值(C₃₉H₆₀O₁₁Na，727.4033)。

氢谱数据¹H NMRδ(ppm，C₅D₅N，500MHz)：4.26(1H，s，15-H)，3.47(1H，dd，J＝12.0，4.0Hz，3-H)，2.30(1H，m)1.92(1H，m)(2-H)；2.10(1H，m)1.07(1H，m)(7-H)；2.10(1H，m)1.16(1H，m)(11-H)；1.67(1H，m)1.55(1H，m)(12-H)；1.67(1H，m，20-H)，1.66(1H，m，8-H)，1.59(1H，m)1.21(1H，m)(1-H)；1.52(1H，m)0.67(1H，m)(6-H)；1.46(1H，M，17-H)，1.29(1H，m，5-H)，0.49(1H，J＝3.6Hz)0.26(1H，d，J＝3.6Hz)(19-H)；1.13(3H，s，18-H)，0.82(3H，d，J＝6.4Hz，21-H)，1.68(3H，s，26-H)，1.65(3H，s，27-H)，1.17(3H，s，28-H)，1.25(3H，s，29-H)，0.99(3H，s，30-H0。木糖部分：4.84(1H，d，J＝7.6Hz，1’-H)，4.05(1H，t，J＝8.6Hz，2’-H)，5.73(1H，t，J＝9.2Hz，3’-H)，4.22(1H，m，4’-H)，4.33(1H，dd，J＝11.4，4.2Hz)，3.71(1H，t，J＝10.8Hz)(5’-H)。

碳谱数据¹³C NMRδ(ppm，C₅D₅N，500MHz)：112.5(s，16-C)，88.9(d，3-C)，86.8(d，24-C)，83.2(d，25-C)，80.2(d，15-C)，71.8(d，23-C)，59.4(d，17-C)，48.7(d，8-C)，47.6(d，5-C)，47.3(d，14-C)，41.9(s，13-C)，41.4(s，4-C)，37.9(t，22-C)，34.1(t，12-C)，32.5(t，1-C)，30.9(t，19-C)，30.1(t，2-C)，26.7(s，10-C)，26.4(t，7-C)，26.5(t，11-C)，25.7(q，29-C)，24.0(d，20-C)，23.4(q，26-C)，21.6(q，27-C)，21.1(t，6-C)，20.1(s，9-C)，19.6(q，18-C)，19.5(q，21-C)，15.4(q，30-C)，11.9(q，28-C)。COCH₃部分：170.9(s，3’-CO)，21.6(q，3’-COCH₃)，170.2(s，25-CO)，22.3(q，25-COCH₃)。木糖部分：107.2(d，1’-C)，73.2(d，2’-C)，79.4(d，3’-C)，69.3(d，4’-C)，66.8(t，5’-C)。

红外光谱数据IR(KBr)ν_max：3460，2929，2872，1721，1461，1250，1042cm^-1。

KYY43的化学结构：

KYY43的名称为：25-O-乙酰基升麻醇-3-O-β-D-(3′-O-乙酰)木糖苷(3′，25-O-diacetylcimigenol-3-O-β-D-xylopyranosid)。

实施例2：

环阿尔廷烷型三萜苷类化合物KYY 31、KYY 41和KYY 43的药效学试验：

从云南省香格里拉县小中甸乡采集的绿升麻(Cimicifuga foetidaL.)的地上部分分离得到一组具有选择性抑制人肝癌细胞株HepG2活性的新环阿尔廷烷型三萜苷类化合物：KYY 31、KYY 41和KYY43，即25-O-乙酰基升麻醇-3-O-β-D-(4′-O-2-E-丁烯酰)木糖苷(4′-O-E-2-butenoyl-25-O-acetylcimigenol-3-O-β-D-xylopyanoside)，23-表-26-脱氧阿克特醇-3-O-β-D-(3′-O-乙酰)木糖苷(3′-O-acetyl-23-epi-26-deoxyactein)及25-O-乙酰基升麻醇-3-O-β-D-(3′-O-乙酰)木糖苷(3′，25-O-diacetylcimigenol-3-O-β-D-xylopyranosid)。

化合物KYY 31、KYY 41和KYY 43都是新颖的环阿尔廷烷型三贴苷类化合物，对其抗肿瘤活性研究未见报道，特别是这组新升麻三萜化合物显示出了对人肝癌细胞株HepG2的高选择性抑制活性。

1、化合物KYY31、KYY41和KYY43的抗肿瘤活性：

表-1化合物KYY 31、KYY 41和KYY 43的

细胞毒生物生物活性(IC₅₀ in μM)

Compounds	HepG2	MCF7	HT29	MKN28
					KYY 31	1.29	＞100	＞100	＞100
KYY 41	1.41	＞100	35.68	＞100
					KYY 43	0.71	＞100	28.89	＞100
Cisplatin	1.73	＜0.3	4.66	4.26

从表1中数据可以看出：在人肝癌(HepG2)、乳腺癌(MCF7)、结肠癌(HT29)、胃癌(MKN28)细胞株上进行抗肿瘤活性筛选时，化合物KYY 31、KYY 41、KYY 43对HepG2(肝癌细胞株)的细胞毒生物活性(IC₅₀ in μM)十分明显且具有很高的选择性：IC₅₀值分别为1.29，1.41，0.71μM，比阳性对照顺铂(Cisplatin)1.73μM的活性都要好，特别是化合物KYY43其活性已经比阳性对照品顺铂高了一个数量级。这组化合物具有很好的抗肝癌肿瘤的生物活性，今后在治疗肿瘤药物开发及其利用的将有着广阔的前景。

2、体外抗肿瘤细胞毒性的生物活性测定方法：

抗肿瘤药物筛选的细胞系培养于含5％胎牛血清，2m M L-谷氨酸的RPMI 1640培养基中。一个典型的筛选过程如下：于96孔板中每孔加入100μl密度为5×10⁴-4×10⁵/ml的细胞。细胞密度的选择依赖于细胞传代的时间即由一个细胞变为两个细胞所需要的时间。然后置于37℃，5％CO₂，95％空气，100％相对湿度环境下培养24小时。24小时后，每个细胞系取两块板，用含TCA的situ固定，以测定药物加入前的细胞数(Tz)。待测药物用DMSO溶解，终浓度为所需浓度的400倍，冷冻保存。按所需取出药物，融化，用含50μg/ml庆大霉素的完全培养基稀释至浓度为所需最大浓度的2倍。除4倍梯度稀释外，也采用10倍或者1/2log梯度稀释药物。每个药物5个梯度，设对照。然后向含细胞的孔中每孔加入稀释好的药物100μl，那么药物浓度为所需浓度。

加药后，37℃，5％CO₂，95％空气，100％相对湿度环境下培养48小时。对于贴壁细胞，通过加入冰冷的TCA杀死细胞。具体操作如下：逐滴加入50μl含50％(w/v)TCA(重浓度10％TCA)，4℃，放置60分钟，固定细胞，去上清，逐滴加入水，洗涤5次，空气中干燥。每孔加入100μl 0.4％(w/v且用1％乙酸稀释)，室温孵育10分钟。染色结束后用1％乙酸洗涤5次，除去未结合的染料，空气中干燥。结合的染料用10Mm trizma base溶解。自动读板仪测定光吸收(515nm)。对于悬浮细胞，杀死细胞时逐滴加入50μl 80％TCA(终浓度16％)，将细胞固定于板底，其余步骤与贴壁细胞相同。用7个光吸收值(加入药物前的：T_Z；对照：C；五个药物浓度：Ti；)，可以计算各个药物浓度下细胞的生长水平。

药物对肿瘤细胞生长抑制的计算如下：

当Ti≥Tz时，在药物浓度i的生长抑制率为：[(Ti-Tz)/(C-Tz)]×100；

当Ti≤Tz时，在药物浓度i的生长抑制率为：[(Ti-Tz)/Tz]×100；反映量效的三个参数的计算如下：

GI50(生长抑制50％)可由[(Ti-Tz)/(C-Tz)]×100＝50计算得出。其反映药物导致试验组蛋白增加比对照组增加减少50％时的药物浓度。

TGI(生长完全抑制)可由Ti＝Tz计算得出。

LC50(导致药物处理后蛋白的含量比处理前减少50％的药物浓度)，显示处理后细胞的净损失，其可以由[(Ti-Tz)/Tz]×100＝50计算得出。如果活性达到一定水平的话，可以计算出这三个参数值。如果活性太低或者太高，参数的值可以用大于或者小于最大或者最小的试验浓度来表示。

实施例3：

片剂：实施例1所得化合物KYY 31或KYY 41或KYY 4310mg，乳糖180mg，淀粉55mg，硬脂酸镁5mg；

制备方法：将化合物、乳糖和淀粉混合，用水均匀湿润，把湿润后的混合物过筛并干燥，再过筛，加入硬脂酸镁，然后将混合物压片，每片重250mg，化合物含量为10mg。

实施例4：

安瓿剂：实施例1所得化合物KYY 31或KYY 41或KYY 432mg，氯化钠10mg；

制备方法：将化合物和氯化钠溶解于适量的注射用水中，过滤所得溶液，在无菌条件下装入安瓿瓶中。

实施例5：

胶囊剂：实施例1所得化合物KYY 31或KYY 41或KYY 4310mg，乳糖187mg，硬脂酸镁3mg；

制备方法：将化合物与助剂混合，过筛，均匀混合，把得到的混合物装入硬明胶胶囊，每个胶囊重200mg，活性成分含量为10mg。

Claims

1.下述结构式所示的环阿尔廷烷型三贴苷类化合物KYY31、KYY41、KYY43，

KYY31即25-O-乙酰基升麻醇-3-O-β-D-(4′-O-2″-E-丁烯酰)木糖苷，

KYY41即23-表-26-脱氧阿克特醇-3-O-β-D-(3′-O-乙酰)木糖苷，

KYY43即25-O-乙酰基升麻醇-3-O-β-D-(2′-O-乙酰)木糖苷。

2.一种抗癌的药物组合物，其中含有治疗有效量的权利要求1所述的化合物KYY31或KYY41或KYY43和药学上可接受的载体。

3.权利要求1所述化合物KYY31、KYY41、KYY43的制备方法，取绿升麻地上部分，粉碎后用95％甲醇70℃提取3-4次，每次1-2天，合并提取液，减压浓缩至无甲醇蒸出，得到浸膏；浸膏用蒸馏水稀释后，用石油醚萃取3-4次，减压回收石油醚后，得到石油醚萃取部分；剩下的水层用乙酸乙酯萃取4-5次，减压回收后得到富集三萜类化合物的乙酸乙酯萃取部分；乙酸乙酯部分经常压硅胶柱上柱层析，用氯仿-甲醇梯度洗脱进行粗分，用TLC检测，得到4-6个部分，氯仿-甲醇50∶1部分再用氯仿-丙酮梯度洗脱，得到3-4个部分，氯仿-丙酮5∶1部分再经过减压反相RP-18柱层析，用甲醇-水梯度洗脱得到3-4各部分；甲醇-水70∶30部分在常压硅胶上柱层析，用氯仿-丙酮10∶1反复洗脱得到KYY 31、KYY 41、KYY 43的粗品；化合物粗品在Sephadex LH-20柱上反复洗脱，得到化合物纯品。

4.权利要求2所述的药物组合物的制备方法，取绿升麻地上部分，粉碎后用95％甲醇70℃提取3-4次，每次1-2天，合并提取液，减压浓缩至无甲醇蒸出，得到浸膏；浸膏用蒸馏水稀释后，用石油醚萃取3-4次，减压回收石油醚后，得到石油醚萃取部分；剩下的水层用乙酸乙酯萃取4-5次，减压回收后得到富集三萜类化合物的乙酸乙酯萃取部分；乙酸乙酯部分经常压硅胶柱上柱层析，用氯仿-甲醇梯度洗脱进行粗分，用TLC检测，得到4-6个部分，氯仿-甲醇50∶1部分再用氯仿-丙酮梯度洗脱，得到3-4个部分，氯仿-丙酮5∶1部分再经过减压反相RP-18柱层析，用甲醇-水梯度洗脱得到3-4各部分；甲醇-水70∶30部分在常压硅胶上柱层析，用氯仿-丙酮10∶1反复洗脱得到KYY 31、KYY 41、KYY 43的粗品；化合物粗品在SephadexLH-20柱上反复洗脱，得到化合物纯品，再加入常用药用载体制成各种药用剂型。

5.权利要求1所述的化合物KYY31、KYY41、KYY43在制备抗肝癌药物中的应用。

6.权利要求2所述的药物组合物在制备抗肝癌药物中的应用。