CN104892713A

CN104892713A - 葫芦素c及其类似物的制备方法与应用

Info

Publication number: CN104892713A
Application number: CN201510181868.0A
Authority: CN
Inventors: 黄三文; 周渊; 曾建国; 尚轶; 马永硕
Original assignee: Institute of Vegetables and Flowers Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Vegetables and Flowers Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2015-04-16
Filing date: 2015-04-16
Publication date: 2015-09-09
Anticipated expiration: 2035-04-16
Also published as: CN104892713B

Abstract

本发明涉及天然药物化学领域，具体提供一种黄瓜中葫芦素C及其类似物的制备方法与应用，所述葫芦素C类似物为去乙酰葫芦素C、二氢葫芦素C和二氢去乙酰葫芦素C。本发明通过实验证明，所述葫芦素C及其类似物具有抗癌细胞的细胞毒活性，可以用于癌症的治疗。

Description

葫芦素C及其类似物的制备方法与应用

技术领域

本发明涉及天然药物化学领域，具体地说，涉及一种黄瓜中葫芦素C及其类似物的制备方法与应用。

背景技术

很多植物中均含有具有抗癌活性的化合物，如从太平洋紫杉(短叶红豆杉，Taxus brevifolia)树皮中提取出来的紫杉醇，从喜树(Camptotheca acuminata)皮和果实中提取得到的羟基喜树碱即是应用广泛的抗癌药物。因此，从植物中寻找天然来源的抗癌药物是目前癌症治疗的研究热点。

黄瓜(拉丁名Cucumis sativus Linn，英文名Cucumber)，葫芦科黄瓜属植物，也称胡瓜、青瓜，是我国一种常见的蔬菜。同时，黄瓜还是一种传统的中草药，其果实和叶均能入药。《本草纲目》记载黄瓜：主清热解渴，利水道；小儿热痢；水病肚胀，四肢浮肿；咽喉肿痛；狐刺毒肿等。《本草拾遗》记载黄瓜叶：主小儿闪癣，一岁服一叶，生挼绞汁服，得吐下良。

黄瓜果实和叶中含有多种葫芦素成分，其中以葫芦素C含量最高。这既是黄瓜苦味的成因，也是黄瓜具有药用价值的物质基础。现代药理研究表明，葫芦素类化合物具有很强的抗癌活性。据报道，葫芦素B、E、I，对乳腺癌、肺癌、肝癌等癌细胞的增殖具有很强的抑制作用。甜瓜中的葫芦素B、E已被开发成五类中药“葫芦素片”，主要应用于湿热毒盛所致迁延性肝炎、慢性肝炎及原发性肝癌的辅助治疗。

葫芦素C于1954年在黄瓜叶中首次被发现，此后对葫芦素C的研究鲜有报道。仅于1968年，印度研究者介绍了从甜瓜中提取分离葫芦素C，但没有介绍其制备方法。而从黄瓜果实和黄瓜叶中提取制备葫芦素C及其类似物的方法与其医药用途一直未见报道。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种黄瓜中葫芦素C及其类似物的制备方法与应用。

本发明首先提供一种葫芦素C及其类似物的制备方法，葫芦素C如式(II)所示，葫芦素C类似物为去乙酰葫芦素C如式(III)所示、二氢葫芦素C如式(IV)所示和二氢去乙酰葫芦素C如式(V)所示；

所述提取方法包括如下步骤：

1)用乙醇提取黄瓜叶和/或黄瓜果实，然后除去乙醇，收集提取物；

2)将所述提取物悬浮溶解于热水中，用石油醚进行萃取脱脂、脱色，移除石油醚萃取液，保留水层；

3)将水层部分用大孔树脂进行分离，利用不同浓度的乙醇-水溶液梯度洗脱，收集80％乙醇洗脱组分；

4)将步骤3)所得组分进行正相硅胶柱层析，用二氯甲烷和甲醇混合溶剂体系梯度洗脱，收集体积比为10:1的二氯甲烷和甲醇混合液洗脱组分；

5)将步骤4)所得组分进行正相硅胶柱层析，用石油醚和乙酸乙酯混合溶剂体系梯度洗脱，收集体积比为1:1和1:2的石油醚和乙酸乙酯混合液洗脱组分；

6)将步骤5)所得组分用半制备HPLC进行纯化，仪器型号为waters600半制备型高效液相，W2487双波长检测器检测，所用半制备柱型号为Agilent SB C189.4×250mm，进行HPLC纯化；

其中，将收集得到的体积比为1:1的石油醚和乙酸乙酯混合液洗脱组分分离纯化，使用流动相为体积比为60:40的甲醇-水混合液，收集保留时间为15.5min和16.5min的洗脱峰，分别得到式(II)和式(IV)化合物；

将收集得到的体积比为1:2的石油醚和乙酸乙酯混合液洗脱组分分离纯化，使用流动相为体积比为45:55的甲醇-水混合液，收集保留时间为25.5min和28.2min的洗脱峰，分别得到式(III)和式(V)化合物。

进一步地，步骤1)中所述提取可以采用回流提取。

进一步地，步骤6)中所述流动相的流速均为2mL/min。

本发明还提供了如式(III)、式(IV)或式(V)所示的葫芦素C类似物，或者其药学上可接受的盐：

本发明还提供了葫芦素C及上述葫芦素C类似物或其药学上可接受的盐在制备预防和/或治疗肿瘤药物中的应用。

作为优选，所述葫芦素C及其类似物或其药学上可接受的盐在制备预防和/或治疗人肝癌、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、膀胱癌、前列腺癌和结肠癌药物中的应用。

所述药物为口服制剂、外用剂或注射剂；其中口服制剂包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、合剂、酒剂或滴丸剂；外用剂包括栓剂、搽剂、洗剂、膏剂或透皮贴剂；注射剂包括注射液、混悬液或冻干粉针。

上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。

所述药物以葫芦素C及其类似物或其药学上可接受的盐为活性成分，需要的时候，还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。

所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸收载体、润滑剂等。

所述药物可通过注射、喷射、滴鼻、滴眼、渗透、吸收、物理或化学介导的方法导入机体如肌肉、皮内、皮下、静脉、粘膜组织；或是被其他物质混合或包裹后导入机体。

本发明的有益效果在于：

本发明提供了一种从黄瓜中提取分离葫芦素C及其类似物的方法，并首次从自然界中获得去乙酰葫芦素C(如式III所示)、二氢葫芦素C(如式IV所示)和二氢去乙酰葫芦素C(如式V所示)。本发明通过实验证明，利用本发明制备方法得到的葫芦素C及其类似物具有抗癌细胞的细胞毒活性，可以用于癌症的治疗。

附图说明

图1为本发明实施例2中所述葫芦素C及其类似物对肺癌细胞的抑制率曲线。

图2为本发明实施例2中所述葫芦素C及其类似物对前列腺癌细胞的抑制率曲线。

图3为本发明实施例2中所述葫芦素C及其类似物对结肠癌细胞的抑制率曲线。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1 葫芦素C、去乙酰葫芦素C、二氢葫芦素C、二氢去乙酰葫芦素C的提取

一、提取分离

将70kg的黄瓜叶切碎，用95％乙醇回流提取1h，共提取3次。90℃减压浓缩回收溶剂，得到固体浸膏780g。将所述固体浸膏700g悬浮于水中，用石油醚萃取8次，移除石油醚层，收集水层。水层离心过滤，收集滤液，用D101大孔树脂柱进行层析分离，柱床长度150cm，柱内径为20cm，按照40ml/min的流速用水及不同浓度的乙醇依次进行洗脱：水洗脱为部位1、30％乙醇洗脱为部位2、80％乙醇洗脱为部位3、95％乙醇洗脱为部位4，每个部位洗脱六个保留体积。收集80％乙醇洗脱部位3，60℃减压浓缩至干得浸膏。将上述浸膏用正相硅胶柱进行层析分离，用200～300目硅胶装柱，柱床长度100cm，柱内径15cm，按照20ml/min的流速用如下四个梯度的二氯甲烷和甲醇混合液依次梯度洗脱：二氯甲烷和甲醇的体积比20:1的混合液1、二氯甲醇和甲醇的体积比10:1的混合液2、二氯甲烷和甲醇的体积比5:1的混合液3、二氯甲醇和甲醇的体积比1:1的混合液4，每个梯度洗脱量为五个柱保留体积。收集二氯甲烷-甲醇体积比为10:1时的洗脱组分，并将此组分在50℃真空减压浓缩。将上述二氯甲烷-甲醇(10:1)洗脱组分再用硅胶柱进行分离纯化，用200～300目硅胶装柱，柱床长度40cm，柱内径5cm，按照10ml/min的流速用如下四个梯度的石油醚和乙酸乙酯混合液依次梯度洗脱：石油醚和乙酸乙酯的体积比2:1的混合液1、石油醚和乙酸乙酯的体积比1:1的混合液2、石油醚和乙酸乙酯的体积比1:2的混合液3、纯乙酸乙酯溶剂4，每个梯度洗脱六个保留体积。分别收集混合液2和混合液3洗脱组分，并在50℃真空减压浓缩。所述石油醚和乙酸乙酯混合液2洗脱组分用制备HPLC系统进行分离纯化，仪器型号为Waters 600半制备型高效液相色谱仪，W2487双波长检测器检测，检测波长设定为210nm和230nm，所用半制备柱型号为Agilent SBC₁₈(9.4×250mm。以甲醇和水:体积比为60:40)作为流动相进行分离，流速为2ml/min。收集保留时间为15.5min、16.5min的洗脱峰，得到式(II)、式(IV)所示化合物，60℃进行真空减压浓缩，得到10g葫芦素C(式(II))、500mg二氢葫芦素C(式(IV))。所述石油醚和乙酸乙酯混合液3洗脱组分用制备HPLC系统进行分离纯化，仪器型号为Waters 600半制备型高效液相色谱仪，W2487双波长检测器检测，检测波长设定为210nm和230nm，所用半制备柱型号为Agilent SB C₁₈(9.4×250mm。以甲醇：水体积比为45:55)作为流动相进行分离，流速为2ml/min。收集保留时间为25.5min、28.2min的洗脱峰，得到式(III)、式(V)所示化合物，60℃进行真空减压浓缩，得到400mg去乙酰葫芦素C(式(III))、200mg二氢去乙酰葫芦素C(式(V))。

二、结构确认

1、葫芦素C，结构式如式II所示，为白色针晶，熔点为206℃～207℃，所用仪器为X4型显微熔点测定仪(温度计未校正)。

结构确证：

HRESIMS m/z:561.3435[M+H]⁺(calcd for C₃₂H₄₈O₈:561.3422)；

UV(MeOH)λ_max：231nm；

IR(KBr)ν_max:3410,1728,1250,1692,1630cm^-1；

¹H-NMR(CDCl₃，500MHz):δ7.06(1H，d，J＝15.6Hz，H-24)，6.47(1H，d，J＝15.6Hz，H-23)，5.74(1H，br s，H-6)，4.35(1H，m，H-16)，4.32(1H，d，J＝10.8Hz，H-19)，3.21(2H，m，H-3)，3.16(1H，m，H-15)，3.16(1H，d，J＝10.8Hz，H-19)，2.65(1H，m，H-8),2.57(1H，m，H-15)，2.47(1H，d，J＝8.0Hz，H-17)，2.36(1H，m，H-7)，2.31(1H，m，H-10)，2.00(3H，s，CH₃CO)，1.89(1H，m，H-7)，1.89(1H，d，J＝7.6Hz，H-12)，1.77(1H，m，H-2)，1.65(1H，m，H-1)，1.56(3H，s，H-27)，1.54(3H，s，H-26)，1.44(1H，m，H-1)，1.42(3H，s，H-21)，1.40(1H，d，J＝7.6Hz，H-12)，1.40(1H，m，H-2)，1.32(3H，s，H-30)，1.16(3H，s，H-28)，1.03(3H，s，H-21)，0.94(3H，s，H-29)；

¹³C NMR(CDCl₃，125MHz)：δ213.3(C-11)，202.6(C-22)，170.1(CH₃CO)，151.8(C-24)，141.6(C-5)，120.5(C-23)，119.8(C-6)，79.3(C-25)，78.3(C-20)，76.3(C-3)，71.5(C-16)，61.2(C-19)，58.5(C-17)，54.4(C-9)，51.1(C-14)，48.9(C-15)，47.9(C-13)，45.6(C-12)，42.4(C-4)，35.1(C-10)，33.7(C-8)，30.6(C-2)，26.5(C-27)，26.3(C-26)，24.6(C-1)，24.5(C-28)，241.1(C-21)，23.8(C-7)，22.0(CH₃CO)，20.4(C-29)，19.7(C-30)，18.7(C-18)。

2、去乙酰葫芦素C，结构式如式IV所示，为白色针晶，熔点为226℃～227℃，所用仪器为X4型显微熔点测定仪(温度计未校正)。

结构确证：

HRESIMS m/z:519.3337[M+H]⁺(calcd for C₃₀H₄₆O₇:519.3316)；

UV(MeOH)λ_max：231nm；

IR(KBr)ν_max：3413,1728,1695,1633cm^-1；

¹H-NMR(Pyridine-d₅，500MHz):δ7.60(1H，d，J＝15.5Hz，H-24)，7.50(1H，d，J＝15.5Hz，H-23)，5.82(1H，d，J＝6.0Hz，H-6)，5.05(1H，t，J＝7.5Hz，H-16)，4.86(1H，d，J＝10.5Hz，H-19)，3.56(1H，d，J＝10.5Hz，H-19)，3.49(1H，m，H-3)，3.28(1H，d，J＝10.5Hz，H-8)，3.21(1H，d，J＝15.0Hz，H-15)，3.06(1H，d，J＝7.0Hz，H-17)，2.90(1H，d，J＝15.0Hz，H-15)，2.65(1H，m，H-10)，2.61(1H，m，H-7)，2.10(1H，m，H-1)，2.10(1H，m，H-12)，2.08(1H，m，H-7)，2.02(1H，m，H-2)，1.84(1H，m，H-2)，1.82(1H，m，H-12)，1.65(3H，s，H-21)，1.63(3H，s，H-30)，1.60(3H，s，H-18)，1.48(3H，s，H-27)，1.47(1H，s，H-28)，1.45(3H，s，H-26)，1.29(3H，s，H-29)，1.14(1H，m，H-1)；

¹³C NMR(Pyridine-d₅，125MHz)：δ212.3(C-11)，204.8(C-22)，155.8(C-24)，143.4(C-5)，121.3(C-23)，119.7(C-6)，79.8(C-20)，76.4(C-3)，71.0(C-25)，70.6(C-16)，60.8(C-19)，59.9(C-17)，54.5(C-9)，51.5(C-14)，49.8(C-15)，48.8(C-13)，47.2(C-12)，43.4(C-4)，36.1(C-10)，34.0(C-8)，32.2(C-2)，30.3(C-27)，30.1(C-26)，25.9(C-1)，25.6(C-28)，25.2(C-21)，24.5(C-7)，21.4(C-29)，20.1(C-18)，19.9(C-30)。

3、二氢葫芦素C，结构式如式IV所示，为白色针晶，熔点为214℃～215℃，所用仪器为X4型显微熔点测定仪(温度计未校正)。

结构确证：

HRESIMS m/z:563.3567[M+H]⁺(calcd for C₃₂H₅₀O₈:563.3578)；

UV(MeOH)λ_max：202nm；

IR(KBr)ν_max：3422，2985，1731，1701，1650cm^-1；

¹H-NMR(CDCl₃，500MHz):δ5.74(1H，br s，H-6)，4.33(1H，m，H-16)，4.30(1H，d，J＝11.0Hz，H-19)，3.20(1H，m，H-3)，3.17(1H，m，H-15)，3.16(1H，d，J＝11.0Hz，H-19)，2.85(2H，m，H-23)，2.60(1H，d，J＝7.5Hz，H-8)，2.58(1H，m，H-15)，2.50(1H，d，J＝7.0Hz，H-17)，2.34(1H，m，H-10)，2.34(1H，m，H-7)，2.06(2H，m，H-24)，1.96(3H，s，CH₃CO)，1.90(1H，m，H-7)，1.89(1H，m，H-7)，1.80(1H，m，H-2)，1.65(1H，m，H-1)，1.45(3H，s，H-27)，1.43(1H，m，H-2，overlapped)，1.43(3H，s，H-21)，1.40(3H，s，H-26)，1.40(1H，m，H-1，overlapped)，1.40(1H，m，H-12)，1.32(3H，s，H-30)，1.16(3H，s，H-28)，1.02(3H，s，H-18)，0.94(3H，s，H-29)；

¹³C NMR(CDCl₃，125MHz)：δ214.2(C-22)，213.5(C-11)，170.5(CH₃CO)，141.6(C-5)，119.7(C-6)，81.4(C-20)，79.1(C-25)，76.5(C-3)，71.4(C-16)，61.2(C-19)，58.0(C-17)，54.4(C-9)，51.1(C-14)，48.9(C-15)，48.1(C-13)，45.7(C-12)，42.4(C-4)，35.1(C-10)，35.0(C-24)，33.6(C-8)，30.8(C-2)，30.8(C-23)，26.3(C-27)，26.0(C-26)，24.6(C-1)，24.5(C-28)，24.5(C-21)，23.8(C-7)，20.4(C-29)，22.6(CH₃CO)，19.6(C-30)，18.7(C-18)。

4、二氢去乙酰葫芦素C，结构式如式IV所示，为白色针晶，熔点为235℃～236℃，所用仪器为X4型显微熔点测定仪(温度计未校正)。

结构确证：

HRESIMS m/z:521.3495[M+H]⁺(calcd for C₃₀H₄₈O₇:521.3473)；

UV(MeOH)λ_max：202nm；

IR(KBr)ν_max：3375,1728,1693,1652cm^-1；

¹H-NMR(Pyridine-d₅，500MHz):δ5.83(1H，d，J＝5.5Hz，H-6)，4.96(1H，t，J＝7.5Hz，H-16)，4.86(1H，d，J＝10.5Hz，H-19)，3.56(1H，d，J＝10.5Hz，H-19)，3.54(1H，m，H-23)，3.52(1H，m，H-3)，3.31(1H，m，H-23)，3.28(1H，m，H-8)，3.04(1H，d，J＝7.0Hz，H-17)，3.03(1H，m，H-15)，2.90(1H，m，H-15)，2.65(1H，m，H-10)，2.62(1H，m，H-7)，2.26(1H，m，H-24)，2.10(1H，m，H-1)，2.09(1H，m，H-7)，2.03(1H，m，H-2)，2.02(1H，m，H-12)，1.80(1H，m，H-2)，1.80(1H，m，H-12)，1.65(3H，s，H-30)，1.64(3H，s，H-21)，1.60(3H，s，H-18)，1.48(3H，s，H-28)，1.40(3H，s，H-26)，1.40(1H，s，H-27)，1.32(3H，s，H-29)，1.16(1H，m，H-1)；

¹³C NMR(Pyridine-d₅，125MHz)：δ216.6(C-22)，212.6(C-11)，143.4(C-5)，119.8(C-6)，80.6(C-20)，76.4(C-3)，70.9(C-16)，69.4(C-25)，60.8(C-19)，59.5(C-17)，54.6(C-9)，51.4(C-14)，49.9(C-15)，48.8(C-13)，47.2(C-12)，43.4(C-4),38.9(C-24)，36.2(C-10)，33.9(C-8)，33.1(C-23)，32.3(C-2)，30.4(C-27)，30.4(C-26)，25.8(C-1)，25.6(C-28)，25.3(C-21)，24.5(C-7)，21.4(C-29)，20.2(C-18)，19.8(C-30)。

以上图谱结果表明所得化合物结构正确。

实施例2 葫芦素C及其类似物的抗癌活性细胞实验

1、实验细胞

人肺癌细胞株A549，人前列腺癌细胞株Du145，人结肠癌细胞株HCT116。

将上述细胞株分别培养于添加10％灭活新生小牛血清的RPMI1640完全培养液中。培养液中添加100IU/mL青霉素和100μg/mL链霉素及10mM HEPES，并置于37℃，5％CO₂培养箱中培养。实验用细胞均处于对数生长期。

2、实验药物

实施例1中制备的4种葫芦素：葫芦素C、去乙酰葫芦素C、二氢葫芦素C、二氢去乙酰葫芦素C；并以紫杉醇(中国食品药品检定研究院，批号：100382-201102)作为阳性对照药。以培养基配制浓度为0.1μM-80μM的药物浓度。

3、抗癌细胞活性测定

采用MTT法进行测定：

取对数生长期细胞，用胰蛋白酶-EDTA消化液消化后，配制成单细胞悬液，将细胞悬液接种于96孔板，每孔加100μL，A549、Du145和HCT116细胞分别为6×10⁴/mL、1×10⁵/mL和7×10⁴/mL，培养24小时后，按组距1:10用培养液(即含10％胎牛血清的1640培养基)稀释4种葫芦素和阳性对照药物紫杉醇溶液，使每种药物的浓度分别为80μM、40μM、20μM、10μM、1μM、0.5μM、0.1μM，继续培养72小时。然后，每孔加50μL MTT，37℃孵育4小时后，弃去培养基和MTT，每孔立即加200μL DMSO溶解MTT甲臢颗粒，微型振荡器振荡混匀后，用酶标仪测定光密度(OD)值，参考波长为450nm，检测波长为570nm，最后，根据下述公式计算药物对肿瘤细胞的抑制率，并按照中效方程计算IC₅₀值：

抑制率(％)＝(对照组平均OD值-给药组平均OD值)/对照组平均OD值×100％

(其中OD_对照、OD_实验为已经扣除OD_空白的实验值)。

4、实验结果

实验测得的各种药物对3种癌细胞的IC50值及抑制率曲线分别见表1和图1-3。

表1葫芦素C及其类似物的细胞毒活性试验结果

表1中数据表明，本发明提取四种葫芦素C及其类似物对三种肿瘤细胞均有不同程度的抑制增殖作用，其中对结肠癌细胞增殖的抑制作用较显著；葫芦素C对前列腺癌增殖抑制活性最强，且优于阳性对照药物紫杉醇；去乙酰葫芦素C对前列腺癌细胞的增殖抑制活性略弱于紫杉醇；由此可以得出结论，即本发明四种葫芦素C及其类似物具有抗癌细胞的细胞毒活性，可以用于癌症的治疗。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.葫芦素C及其类似物的制备方法，其特征在于，葫芦素C如式(II)所示，葫芦素C类似物为去乙酰葫芦素C如式(III)所示、二氢葫芦素C如式(IV)所示和二氢去乙酰葫芦素C如式(V)所示；

所述提取方法包括如下步骤：

6)将步骤5)所得组分用半制备HPLC进行纯化，仪器型号为waters600半制备型高效液相，W2487双波长检测器检测，所用半制备柱型号为Agilent SB C18 9.4×250mm，进行HPLC纯化；

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述提取可以采用回流提取。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤6)中所述流动相的流速均为2mL/min。

4.如式(III)、式(IV)或式(V)所示的葫芦素C类似物，或者其药学上可接受的盐：

5.葫芦素C与权利要求4所述葫芦素C类似物或其药学上可接受的盐在制备预防和/或治疗肿瘤药物中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述葫芦素C及其类似物或其药学上可接受的盐在制备预防和/或治疗人肝癌、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、膀胱癌、前列腺癌和结肠癌药物中的应用。

7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于，所述药物为口服制剂、外用剂或注射剂；其中口服制剂包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、合剂、酒剂或滴丸剂；外用剂包括栓剂、搽剂、洗剂、膏剂或透皮贴剂；注射剂包括注射液、混悬液或冻干粉针。