CN108299535A - 苦西瓜中葫芦素e及糖苷的制备方法 - Google Patents

苦西瓜中葫芦素e及糖苷的制备方法 Download PDF

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CN108299535A CN201810091353.5A CN201810091353A CN108299535A CN 108299535 A CN108299535 A CN 108299535A CN 201810091353 A CN201810091353 A CN 201810091353A CN 108299535 A CN108299535 A CN 108299535A
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water
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黄三文
周渊
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Abstract

本发明提供一种苦西瓜中葫芦素E及糖苷的制备方法，用乙醇提取苦西瓜，然后除去乙醇，收集醇提物，再经过大孔树脂柱层析分离，半制备HPLC纯化，分别得到式(I)和式(II)所示的葫芦素E及单葡萄糖苷。本发明首次公开了从苦西瓜中提取纯化获得葫芦素E及其糖苷的方法，所得终产物的产率和纯度高，流程简单，易于工业化放大生产。

Description

苦西瓜中葫芦素E及糖苷的制备方法
技术领域
本发明属于天然药物化学领域，具体地说，涉及一种从苦西瓜中制备葫芦素E及糖苷的方法。
背景技术
苦西瓜是指葫芦科西瓜属带有苦味的西瓜品种，如药西瓜(拉丁名Citrulluscolocynthis)、未经驯化的西瓜(拉丁名Citrullus lanatus(Thunb.)Matsum.et Nakai，英文名Water Melon)野生品种及人工培育的带苦味的西瓜等。其中，药西瓜又称“苦西瓜”、“苦苹果”或“苦黄瓜”，原产于地中海地区，在我国主要分布在新疆等地，是维吾尔族习用药材，收载于我国一九九八年卫生部颁药材标准(维吾尔分册)中。主要适用于由寒气所引起的各种疾病，缓解疼痛，通气，消肿止痛。主治便秘，瘫痪，开窍，牙疼，胸闷，风湿等。
苦西瓜果实和根中含有多种葫芦素成分，其中以葫芦素E及其单葡萄糖苷含量最高。现代药理研究表明，葫芦素类化合物具有很强的抗癌活性。据报道，葫芦素B、E、I，对乳腺癌、肺癌、肝癌等癌细胞的增殖具有很强的抑制作用。甜瓜中的葫芦素B、E已被开发成五类中药“葫芦素片”，主要应用于湿热毒盛所致迁延性肝炎、慢性肝炎及原发性肝癌的辅助治疗。
葫芦素E(Cucurbitacin E)，异名α-西洋苦瓜素。分子式C32H44O8，分子量：556.695，CAS号：18444-66-1。葫芦素E最早分别于1909年和1910在喷瓜和药西瓜中被发现，此后，在甜瓜、西瓜、雪胆、栝楼、天花粉等葫芦科植物中发现有葫芦素E的存在，其中，以甜瓜蒂中的含量最高，但仍不足0.4％(干重)。目前市售的葫芦素E均从甜瓜蒂中提取纯化而来，但甜瓜蒂中主要为葫芦素B，而葫芦素E含量相对极低，且二者极性大小接近，这给葫芦素E的提纯带来很大的干扰，使得工艺流程复杂，成本难以得到有效的降低，售价高达四万元每克。
前期研究发现，药西瓜和西瓜野生品种中葫芦素E及其单葡萄糖苷的含量很高，其中，药西瓜中葫芦素E及其单葡萄糖苷合计达到6％(湿重)(图1)，但目前尚未有苦西瓜中葫芦素E及其糖苷制备工艺的文献报道，本发明采用葫芦素E及其糖苷含量极高的苦西瓜为提取原材料，可极大地降低葫芦素E及其糖苷的生产成本。
发明内容
本发明的目的是提供一种从苦西瓜中提取葫芦素E及其糖苷的方法。
为了实现本发明目的，本发明提供的苦西瓜中葫芦素E及糖苷的制备方法，用乙醇提取苦西瓜，然后除去乙醇，收集醇提物，再经过大孔树脂柱层析分离，半制备HPLC纯化，分别得到式(I)和式(II)所示的葫芦素E及单葡萄糖苷。
本发明中醇提对象为苦西瓜鲜药材，或干药材粗粉。具体地，鲜药材用匀浆机打碎后，用乙醇提取；或者，将成熟的苦西瓜晒干、粉碎，过24目筛，得到干药材粗粉，然后用乙醇提取。
前述的方法，包括以下步骤：
1)用乙醇提取苦西瓜，然后除去乙醇，收集醇提物；
2)将所述醇提物溶解于乙醇中，使乙醇含量达20％，离心或抽滤收集上清液或滤液；
3)所述上清液或滤液进行大孔树脂柱层析分离，依次用水、30％乙醇、浓度不低于35％的乙醇、浓度不低于60％的乙醇梯度洗脱，分别收集浓度不低于35％和不低于60％的乙醇洗脱组分；
4)将收集得到的浓度不低于35％的乙醇洗脱组分用半制备HPLC进行分离纯化，得到式(II)所示化合物；
5)将收集得到的浓度不低于60％乙醇水洗脱组分用半制备HPLC进行分离纯化，得到式(I)化合物。
优选地，步骤1)中所述苦西瓜选自药西瓜或西瓜野生品种。
优选地，步骤1)中所述乙醇的浓度为40％～95％。
优选地，步骤1)提取方法选自渗漉提取、加热回流提取或浸渍提取中的任一种。
优选地，步骤3)中所用大孔树脂的型号选自D101、AB-8、HP-20、H-103、DA-201、DM-130、XAD-16或DS-401。
优选地，步骤3)中所述浓度不低于35％的乙醇，其浓度范围为35％～60％；所述浓度不低于60％的乙醇，其浓度范围为60％～95％。
优选地，步骤4)进行HPLC分离纯化时，所用反相色谱柱的填料为C8或C18，柱规格为20mm×250mm。
优选地，步骤4)进行HPLC分离纯化时，所用流动相为甲醇-水或乙腈-水，体积比10:90～70:30。
优选地，步骤5)进行HPLC分离纯化时，所用流动相为甲醇-水或乙腈-水，体积比30:70～80:20。
在本发明的一个具体实施方式中，苦西瓜中葫芦素E及糖苷的制备方法为：取1kg苦西瓜干药材粗粉，加入1倍重量的75％乙醇润湿浸泡6小时，然后将润湿好的药西瓜样品加入到渗漉筒中，用75％乙醇渗漉提取，收集8倍量的渗滤液，减压真空浓缩至无醇味(体积约剩0.5L)；浓缩液中加入130mL 95％乙醇，使得浓缩液乙醇含量达到20％，离心过滤，得上清液；将上清液加样至D101大孔树脂进行分离，依次用水、30％乙醇、50％乙醇、80％乙醇梯度洗脱，分别收集50％和80％乙醇洗脱液，减压浓缩得浸膏。
50％乙醇洗脱所得浸膏用Agilent 1260半制备HPLC进行分离纯化，DAD检测器，采集波长为230nm，制备柱规格为反相C18色谱柱20mm×250mm，流动相为甲醇：水体积比45:55的混合液，流速为8ml/min，收集保留时间为16.5min的流出峰，得到9.3g式(II)所示化合物，纯度为98.5％。
80％乙醇洗脱所得浸膏用Agilent 1260半制备HPLC进行分离纯化，DAD检测器，采集波长为230nm，制备柱规格为反相C18色谱柱20mm×250mm，流动相为甲醇：水体积比65:35的混合液，流速为8ml/min，收集保留时间为19min的流出峰，得到3.1g式(I)所示化合物，纯度为97.6％。
在本发明的另一个具体实施方式中，苦西瓜中葫芦素E及糖苷的制备方法为：
取1kg苦西瓜鲜药材，用匀浆机打碎，用75％乙醇回流提取3次，每次1h，提取溶剂量分别为6倍量、5倍量和5倍量；合并提取液，减压真空浓缩至无醇味(体积约剩0.8L)；向浓缩液中加入200mL 95％乙醇，使得浓缩液乙醇含量达到20％，离心过滤，得上清液；将上清液加样至D101大孔树脂进行分离，依次用水、30％乙醇、50％乙醇、80％乙醇梯度洗脱，分别收集50％和80％乙醇洗脱液，减压浓缩回收溶剂得浸膏。
50％乙醇洗脱所得浸膏用Agilent 1260半制备HPLC进行分离纯化，DAD检测器，采集波长为230nm，制备柱规格为反相C18色谱柱20mm×250mm，流动相为甲醇：水体积比45:55混合液，流速为8ml/min，收集保留时间为16.5min的流出峰，得到5.8g式(II)所示化合物，纯度为98.3％。
80％乙醇洗脱所得浸膏用Agilent 1260半制备HPLC进行分离纯化，DAD检测器，采集波长为230nm，制备柱规格为反相C18色谱柱20mm×250mm，流动相为甲醇：水体积比65:35的混合液，流速为8ml/min，收集保留时间为19min的流出峰，得到2.2g式(I)所示化合物，纯度为98.0％。
葫芦素E，结构式如式(I)所示，为白色粉末。
结构确认：
HRESIMS m/z:579.2955[M+Na]+(calcd for C32H44O8Na:579.2928)；
UV(MeOH)λmax：236nm；
1H-NMR(CDCl3，400MHz):δ7.06(1H，d，J＝15.6Hz，H-24)，6.47(1H，d，J＝15.6Hz，H-23)，5.95(1H，d，H-1)，5.77(1H，m，H-6)，4.36(1H，m，H-16)，3.50(1H，brs，H-10)，3.21(1H，d，J＝14.6Hz，H-12a)，2.71(1H，d，J＝14.6Hz，H-12b)，2.47(1H，d，J＝8.0Hz，H-17)，2.37(1H，m，H-7a)，2.04(1H，m，H-8),1.88(1H，m，H-15a)，2.00(3H，s，CH3CO)，1.89(1H，m，H-7b)，1.56(3H，s，H-27)，1.54(3H，s，H-26)，1.47(1H，m，H-15b)，1.42(3H，s，H-21)，1.38(3H，s，H-30)，1.35(3H，s，H-28)，1.25(3H，s，H-29)，1.03(3H，s，H-19)，0.99(3H，s，H-18)。
13C NMR(CDCl3，100MHz)：δ212.3(C-11)，202.6(C-22)，199.0(C-3)，170.3(CH3CO)，151.8(C-24)，144.5(C-2)，136.7(C-5)，120.8(C-6)，120.5(C-23)，114.8(C-1)，79.3(C-25)，78.3(C-20)，71.5(C-16)，58.5(C-17)，50.7(C-13)，48.9(C-9)，48.7(C-12)，48.3(C-14)，47.5(C-4)，45.5(C-15)，41.6(C-8)，35.1(C-10)，25.9(C-27)，26.3(C-26)，27.9(C-28)，24.1(C-21)，23.8(C-7)，22.0(CH3CO)，20.4(C-29)，20.1(C-19)，18.4(C-30)，19.7(C-18)。
葫芦素E单葡萄糖苷，结构式如式(II)所示，为白色粉末。
结构确认：
HRESIMS m/z:741.3481[M+Na]+(calcd for C38H54O13Na:741.3457)；
UV(MeOH)λmax：236nm；
1H-NMR(DMSO-d6，400MHz):δ6.79(1H，d，J＝15.6Hz，H-24)，6.84(1H，d，J＝15.6Hz，H-23)，5.80(1H，d，H-1)，5.71(1H，brs，H-6)，4.49(1H，m，H-16)，3.61(1H，brs，H-10)，3.35(1H，d，J＝14.7Hz，H-12a)，2.45(1H，d，J＝14.7Hz，H-12b)，2.35(1H，d，J＝8.0Hz，H-17)，2.26(1H，m，H-7a)，1.97(3H，s，CH3CO)，1.93(1H，m，H-7b)，1.91(1H，m，H-8),1.73(1H，m，H-15a)，1.50(3H，s，H-27)，1.50(3H，s，H-26)，1.30(3H，s，H-30)，1.28(1H，m，H-15b)，1.27(3H，s，H-21)，1.18(3H，s，H-28)，1.18(3H，s，H-29)，0.86(3H，s，H-19)，0.76(3H，s，H-18)；4.57(1H，d，J＝7.7Hz，H-1')，3.72(1H，m，H-6'a)，3.61(1H，m，H-6'b)，3.27(1H，m，H-5')，3.20(1H，m，H-3')，3.13(1H，s，H-4')，3.09(1H，s，H-2')。
13C NMR(DMSO-d6，100MHz)：δ214.3(C-11)，204.6(C-22)，196.0(C-3)，169.3(CH3CO)，148.8(C-24)，145.3(C-2)，136.4(C-5)，121.8(C-23)，120.7(C-6)，120.6(C-1)，79.5(C-25)，78.8(C-20)，69.4(C-16)，59.3(C-17)，50.2(C-13)，49.0(C-12)，48.8(C-4)，48.3(C-9)，47.5(C-14)，45.8(C-15)，41.2(C-8)，34.4(C-10)，27.2(C-29)，26.3(C-27)，26.3(C-26)，25.6(C-21)，20.5(C-28)，21.9(CH3CO)，20.1(C-18)，19.8(C-19)，17.7(C-30)；98.8(C-1')，77.5(C-5')，76.9(C-3')，72.8(C-2')，69.0(C-4')，60.0(C-6')。
本发明的有益效果如下：
本发明首次公开了一种从苦西瓜中提取纯化获得葫芦素E及其糖苷的方法，该方法对苦西瓜中的目标成分提取率较高，可达20％，纯度高达98％以上。所用的苦西瓜葫芦素E及糖苷含量远高于目前常用的甜瓜蒂，既解决了甜瓜蒂药材来源困难的问题，又大大降低了成本，使得原来“万元”级别的葫芦素E原料有望降低到“千元”水平。生产工艺简单，所用溶剂仅为乙醇、甲醇、水等，对环境污染性较小。对设备要求不高，易于工业化放大生产。
附图说明
图1为药西瓜葫芦素E及其糖苷含量分析。其中，A：药西瓜横切面图，B：不同取样位置含量分析，C：分别为药西瓜中葫芦素E及其单糖苷的含量(湿重)。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
实施例1药西瓜中葫芦素E及糖苷的制备方法
取1kg药西瓜粗粉，加入1倍重量的75％乙醇润湿浸泡6小时，然后将润湿好的药西瓜样品加入到渗漉筒中，用75％乙醇渗漉提取，收集8倍量的渗滤液，减压真空浓缩至无醇味(体积约剩0.5L)。浓缩液中加入130mL 95％乙醇，使得浓缩液醇含量达到20％，离心过滤，得上清液和残渣。上清液上D101大孔树脂进行分离，依次用水、30％乙醇、50％乙醇、80％乙醇梯度洗脱，分别收集50％和80％乙醇洗脱液，减压浓缩回收溶剂得浸膏。50％乙醇洗脱所得浸膏用Agilent 1260半制备HPLC进行分离纯化，DAD检测器，采集波长为230nm，制备柱规格为反相C18色谱柱(20×250mm)，流动相为甲醇：水(体积比45:55)，流速为8ml/min，收集保留时间为16.5min左右的流出峰，得9.3g式(II)化合物，纯度为98.5％。80％乙醇洗脱所得浸膏用Agilent 1260半制备HPLC进行分离纯化，DAD检测器，采集波长为230nm，制备柱规格为反相C18色谱柱(20×250mm)，流动相为甲醇：水(体积比65:35)，流速为8ml/min，收集保留时间为19min左右的流出峰，得3.1g式(I)化合物，纯度为97.6％，提取率为20.6％。
实施例2药西瓜中葫芦素E及糖苷的制备方法
取1kg的药西瓜粗粉，加入1倍重量的75％乙醇润湿浸泡6小时，然后将润湿好的药西瓜样品加入到渗漉筒中，用75％乙醇渗漉提取，收集8倍量的渗滤液，减压真空浓缩至无醇味(体积约剩0.5L)。浓缩液中加入130mL95％乙醇，使得浓缩液醇含量达到20％，离心过滤，得上清液和残渣。上清液上AB-8大孔树脂进行分离，依次用水、30％乙醇、50％乙醇、80％乙醇梯度洗脱，分别收集50％和80％乙醇洗脱液，减压浓缩回收溶剂得浸膏。50％乙醇洗脱所得浸膏用Agilent 1260半制备HPLC进行分离纯化，DAD检测器，采集波长为230nm，制备柱规格为反相C18色谱柱(20×250mm)，流动相为甲醇：水(体积比45:55)，流速为8ml/min，收集保留时间为16.5min左右的流出峰，得10.1g式(II)化合物，纯度为98.1％。80％乙醇洗脱所得浸膏用Agilent 1260半制备HPLC进行分离纯化，DAD检测器，采集波长为230nm，制备柱规格为反相C18色谱柱(20×250mm)，流动相为甲醇：水(体积比65:35)，流速为8ml/min，收集保留时间为19min左右的流出峰，得3.6g式(I)化合物，纯度为97.7％，提取率为22.8％。
实施例3药西瓜中葫芦素E及糖苷的制备方法
取1kg的药西瓜粗粉，用75％的乙醇回流提取3次，每次1h，提取溶剂量分别为6倍量，5倍量，5倍量。合并提取液，减压真空浓缩至无醇味(体积约剩0.8L)。浓缩液中加入200mL 95％乙醇，使得浓缩液醇含量达到20％，离心过滤，得上清液和残渣。上清液上D101大孔树脂进行分离，依次用水、30％乙醇、50％乙醇、80％乙醇梯度洗脱，分别收集50％和80％乙醇洗脱液，减压浓缩回收溶剂得浸膏。50％乙醇洗脱所得浸膏用Agilent 1260半制备HPLC进行分离纯化，DAD检测器，采集波长为230nm，制备柱规格为反相C18色谱柱(20×250mm)，流动相为甲醇：水(体积比45:55)，流速为8ml/min，收集保留时间为16.5min左右的流出峰，得8.7g式(II)化合物，纯度为98.3％。80％乙醇洗脱所得浸膏用Agilent 1260半制备HPLC进行分离纯化，DAD检测器，采集波长为230nm，制备柱规格为反相C18色谱柱(20×250mm)，流动相为甲醇：水(体积比65:35)，流速为8ml/min，收集保留时间为19min左右的流出峰，得3.2g式(I)化合物，纯度为98.0％，提取率为19.7％。
实施例4野生西瓜中葫芦素E及糖苷的制备方法
取1kg的野生西瓜粗粉，加入1倍重量的75％乙醇润湿浸泡6小时，然后将润湿好的野生西瓜样品加入到渗漉筒中，用75％乙醇渗漉提取，收集8倍量的渗滤液，减压真空浓缩至无醇味(体积约剩0.5L)。浓缩液中加入200mL 95％乙醇，使得浓缩液醇含量达到20％，离心过滤，得上清液和残渣。上清液加至D101大孔树脂进行分离，依次用水、30％乙醇、50％乙醇、80％乙醇梯度洗脱，分别收集50％和80％乙醇洗脱液，减压浓缩回收溶剂得浸膏。50％乙醇洗脱所得浸膏用Agilent 1260半制备HPLC进行分离纯化，DAD检测器，采集波长为230nm，制备柱规格为反相C18色谱柱(20×250mm)，流动相为甲醇：水(体积比45:55)，流速为8ml/min，收集保留时间为16.5min左右的流出峰，得6.4g式(II)化合物，纯度为98.3％。80％乙醇洗脱所得浸膏用Agilent 1260半制备HPLC进行分离纯化，DAD检测器，采集波长为230nm，制备柱规格为反相C18色谱柱(20×250mm)，流动相为甲醇：水(体积比65:35)，流速为8ml/min，收集保留时间为19min左右的流出峰，得2.1g式(I)化合物，纯度为98.0％，提取率为20.5％。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.苦西瓜中葫芦素E及糖苷的制备方法，其特征在于，用乙醇提取苦西瓜，然后除去乙醇，收集醇提物，再经过大孔树脂柱层析分离，半制备HPLC纯化，分别得到式(I)和式(II)所示的葫芦素E及单葡萄糖苷；
其中，所述苦西瓜是指鲜药材，或干药材粗粉。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)用乙醇提取苦西瓜，然后除去乙醇，收集醇提物；
2)将所述醇提物溶解于乙醇中，使乙醇含量达20％，离心或抽滤收集上清液或滤液；
3)所述上清液或滤液进行大孔树脂柱层析分离，依次用水、30％乙醇、浓度不低于35％的乙醇、浓度不低于60％的乙醇梯度洗脱，分别收集浓度不低于35％和不低于60％的乙醇洗脱组分；
4)将收集得到的浓度不低于35％的乙醇洗脱组分用半制备HPLC进行分离纯化，得到式(II)所示化合物；
5)将收集得到的浓度不低于60％乙醇水洗脱组分用半制备HPLC进行分离纯化，得到式(I)化合物。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述乙醇的浓度为40％～95％，提取方法选自渗漉提取、加热回流提取或浸渍提取中的任一种。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤3)中所用大孔树脂的型号选自D101、AB-8、HP-20、H-103、DA-201、DM-130、XAD-16或DS-401。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤3)中所述浓度不低于35％的乙醇，其浓度范围为35％～60％；所述浓度不低于60％的乙醇，其浓度范围为60％～95％。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤4)进行HPLC分离纯化时，所用反相色谱柱的填料为C8或C18。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤4)进行HPLC分离纯化时，所用流动相为甲醇-水或乙腈-水，体积比10:90～70:30。
8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤5)进行HPLC分离纯化时，所用流动相为甲醇-水或乙腈-水，体积比30:70～80:20。
9.根据权利要求1-8任一项所述的方法，其特征在于，所述方法具体为：取1kg苦西瓜干药材粗粉，加入1倍重量的75％乙醇润湿浸泡6小时，然后将润湿好的苦西瓜样品加入到渗漉筒中，用75％乙醇渗漉提取，收集8倍量的渗滤液，减压真空浓缩至无醇味；浓缩液中加入130mL 95％乙醇，使得浓缩液乙醇含量达到20％，离心过滤，得上清液；将上清液加样至D101大孔树脂进行分离，依次用水、30％乙醇、50％乙醇、80％乙醇梯度洗脱，分别收集50％和80％乙醇洗脱液，减压浓缩得浸膏；
50％乙醇洗脱所得浸膏用Agilent 1260半制备HPLC进行分离纯化，DAD检测器，采集波长为230nm，制备柱规格为反相C18色谱柱20mm×250mm，流动相为甲醇：水体积比45:55的混合液，流速为8ml/min，收集保留时间为16.5min的流出峰，得到式(II)所示化合物；
80％乙醇洗脱所得浸膏用Agilent 1260半制备HPLC进行分离纯化，DAD检测器，采集波长为230nm，制备柱规格为反相C18色谱柱20mm×250mm，流动相为甲醇：水体积比65:35的混合液，流速为8ml/min，收集保留时间为19min的流出峰，得到式(I)所示化合物。
10.根据权利要求1-8任一项所述的方法，其特征在于，所述方法具体为：
取1kg苦西瓜鲜药材，用匀浆机打碎，用75％乙醇回流提取3次，每次1h，提取溶剂量分别为6倍量、5倍量和5倍量；合并提取液，减压真空浓缩至无醇味；向浓缩液中加入200mL95％乙醇，使得浓缩液乙醇含量达到20％，离心过滤，得上清液；将上清液加样至D101大孔树脂进行分离，依次用水、30％乙醇、50％乙醇、80％乙醇梯度洗脱，分别收集50％和80％乙醇洗脱液，减压浓缩回收溶剂得浸膏；
50％乙醇洗脱所得浸膏用Agilent 1260半制备HPLC进行分离纯化，DAD检测器，采集波长为230nm，制备柱规格为反相C18色谱柱20mm×250mm，流动相为甲醇：水体积比45:55混合液，流速为8ml/min，收集保留时间为16.5min的流出峰，得到式(II)所示化合物；
80％乙醇洗脱所得浸膏用Agilent 1260半制备HPLC进行分离纯化，DAD检测器，采集波长为230nm，制备柱规格为反相C18色谱柱20mm×250mm，流动相为甲醇：水体积比65:35的混合液，流速为8ml/min，收集保留时间为19min的流出峰，得到式(I)所示化合物。
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