CN108299535A - 苦西瓜中葫芦素e及糖苷的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种苦西瓜中葫芦素E及糖苷的制备方法,用乙醇提取苦西瓜,然后除去乙醇,收集醇提物,再经过大孔树脂柱层析分离,半制备HPLC纯化,分别得到式(I)和式(II)所示的葫芦素E及单葡萄糖苷。本发明首次公开了从苦西瓜中提取纯化获得葫芦素E及其糖苷的方法,所得终产物的产率和纯度高,流程简单,易于工业化放大生产。
Description
技术领域
本发明属于天然药物化学领域,具体地说,涉及一种从苦西瓜中制备葫芦素E及糖苷的方法。
背景技术
苦西瓜是指葫芦科西瓜属带有苦味的西瓜品种,如药西瓜(拉丁名Citrulluscolocynthis)、未经驯化的西瓜(拉丁名Citrullus lanatus(Thunb.)Matsum.et Nakai,英文名Water Melon)野生品种及人工培育的带苦味的西瓜等。其中,药西瓜又称“苦西瓜”、“苦苹果”或“苦黄瓜”,原产于地中海地区,在我国主要分布在新疆等地,是维吾尔族习用药材,收载于我国一九九八年卫生部颁药材标准(维吾尔分册)中。主要适用于由寒气所引起的各种疾病,缓解疼痛,通气,消肿止痛。主治便秘,瘫痪,开窍,牙疼,胸闷,风湿等。
苦西瓜果实和根中含有多种葫芦素成分,其中以葫芦素E及其单葡萄糖苷含量最高。现代药理研究表明,葫芦素类化合物具有很强的抗癌活性。据报道,葫芦素B、E、I,对乳腺癌、肺癌、肝癌等癌细胞的增殖具有很强的抑制作用。甜瓜中的葫芦素B、E已被开发成五类中药“葫芦素片”,主要应用于湿热毒盛所致迁延性肝炎、慢性肝炎及原发性肝癌的辅助治疗。
葫芦素E(Cucurbitacin E),异名α-西洋苦瓜素。分子式C32H44O8,分子量:556.695,CAS号:18444-66-1。葫芦素E最早分别于1909年和1910在喷瓜和药西瓜中被发现,此后,在甜瓜、西瓜、雪胆、栝楼、天花粉等葫芦科植物中发现有葫芦素E的存在,其中,以甜瓜蒂中的含量最高,但仍不足0.4%(干重)。目前市售的葫芦素E均从甜瓜蒂中提取纯化而来,但甜瓜蒂中主要为葫芦素B,而葫芦素E含量相对极低,且二者极性大小接近,这给葫芦素E的提纯带来很大的干扰,使得工艺流程复杂,成本难以得到有效的降低,售价高达四万元每克。
前期研究发现,药西瓜和西瓜野生品种中葫芦素E及其单葡萄糖苷的含量很高,其中,药西瓜中葫芦素E及其单葡萄糖苷合计达到6%(湿重)(图1),但目前尚未有苦西瓜中葫芦素E及其糖苷制备工艺的文献报道,本发明采用葫芦素E及其糖苷含量极高的苦西瓜为提取原材料,可极大地降低葫芦素E及其糖苷的生产成本。
发明内容
本发明的目的是提供一种从苦西瓜中提取葫芦素E及其糖苷的方法。
为了实现本发明目的,本发明提供的苦西瓜中葫芦素E及糖苷的制备方法,用乙醇提取苦西瓜,然后除去乙醇,收集醇提物,再经过大孔树脂柱层析分离,半制备HPLC纯化,分别得到式(I)和式(II)所示的葫芦素E及单葡萄糖苷。
本发明中醇提对象为苦西瓜鲜药材,或干药材粗粉。具体地,鲜药材用匀浆机打碎后,用乙醇提取;或者,将成熟的苦西瓜晒干、粉碎,过24目筛,得到干药材粗粉,然后用乙醇提取。
前述的方法,包括以下步骤:
1)用乙醇提取苦西瓜,然后除去乙醇,收集醇提物;
2)将所述醇提物溶解于乙醇中,使乙醇含量达20%,离心或抽滤收集上清液或滤液;
3)所述上清液或滤液进行大孔树脂柱层析分离,依次用水、30%乙醇、浓度不低于35%的乙醇、浓度不低于60%的乙醇梯度洗脱,分别收集浓度不低于35%和不低于60%的乙醇洗脱组分;
4)将收集得到的浓度不低于35%的乙醇洗脱组分用半制备HPLC进行分离纯化,得到式(II)所示化合物;
5)将收集得到的浓度不低于60%乙醇水洗脱组分用半制备HPLC进行分离纯化,得到式(I)化合物。
优选地,步骤1)中所述苦西瓜选自药西瓜或西瓜野生品种。
优选地,步骤1)中所述乙醇的浓度为40%~95%。
优选地,步骤1)提取方法选自渗漉提取、加热回流提取或浸渍提取中的任一种。
优选地,步骤3)中所用大孔树脂的型号选自D101、AB-8、HP-20、H-103、DA-201、DM-130、XAD-16或DS-401。
优选地,步骤3)中所述浓度不低于35%的乙醇,其浓度范围为35%~60%;所述浓度不低于60%的乙醇,其浓度范围为60%~95%。
优选地,步骤4)进行HPLC分离纯化时,所用反相色谱柱的填料为C8或C18,柱规格为20mm×250mm。
优选地,步骤4)进行HPLC分离纯化时,所用流动相为甲醇-水或乙腈-水,体积比10:90~70:30。
优选地,步骤5)进行HPLC分离纯化时,所用流动相为甲醇-水或乙腈-水,体积比30:70~80:20。
在本发明的一个具体实施方式中,苦西瓜中葫芦素E及糖苷的制备方法为:取1kg苦西瓜干药材粗粉,加入1倍重量的75%乙醇润湿浸泡6小时,然后将润湿好的药西瓜样品加入到渗漉筒中,用75%乙醇渗漉提取,收集8倍量的渗滤液,减压真空浓缩至无醇味(体积约剩0.5L);浓缩液中加入130mL 95%乙醇,使得浓缩液乙醇含量达到20%,离心过滤,得上清液;将上清液加样至D101大孔树脂进行分离,依次用水、30%乙醇、50%乙醇、80%乙醇梯度洗脱,分别收集50%和80%乙醇洗脱液,减压浓缩得浸膏。
50%乙醇洗脱所得浸膏用Agilent 1260半制备HPLC进行分离纯化,DAD检测器,采集波长为230nm,制备柱规格为反相C18色谱柱20mm×250mm,流动相为甲醇:水体积比45:55的混合液,流速为8ml/min,收集保留时间为16.5min的流出峰,得到9.3g式(II)所示化合物,纯度为98.5%。
80%乙醇洗脱所得浸膏用Agilent 1260半制备HPLC进行分离纯化,DAD检测器,采集波长为230nm,制备柱规格为反相C18色谱柱20mm×250mm,流动相为甲醇:水体积比65:35的混合液,流速为8ml/min,收集保留时间为19min的流出峰,得到3.1g式(I)所示化合物,纯度为97.6%。
在本发明的另一个具体实施方式中,苦西瓜中葫芦素E及糖苷的制备方法为:
取1kg苦西瓜鲜药材,用匀浆机打碎,用75%乙醇回流提取3次,每次1h,提取溶剂量分别为6倍量、5倍量和5倍量;合并提取液,减压真空浓缩至无醇味(体积约剩0.8L);向浓缩液中加入200mL 95%乙醇,使得浓缩液乙醇含量达到20%,离心过滤,得上清液;将上清液加样至D101大孔树脂进行分离,依次用水、30%乙醇、50%乙醇、80%乙醇梯度洗脱,分别收集50%和80%乙醇洗脱液,减压浓缩回收溶剂得浸膏。
50%乙醇洗脱所得浸膏用Agilent 1260半制备HPLC进行分离纯化,DAD检测器,采集波长为230nm,制备柱规格为反相C18色谱柱20mm×250mm,流动相为甲醇:水体积比45:55混合液,流速为8ml/min,收集保留时间为16.5min的流出峰,得到5.8g式(II)所示化合物,纯度为98.3%。
80%乙醇洗脱所得浸膏用Agilent 1260半制备HPLC进行分离纯化,DAD检测器,采集波长为230nm,制备柱规格为反相C18色谱柱20mm×250mm,流动相为甲醇:水体积比65:35的混合液,流速为8ml/min,收集保留时间为19min的流出峰,得到2.2g式(I)所示化合物,纯度为98.0%。
葫芦素E,结构式如式(I)所示,为白色粉末。
结构确认:
HRESIMS m/z:579.2955[M+Na]+(calcd for C32H44O8Na:579.2928);
UV(MeOH)λmax:236nm;
1H-NMR(CDCl3,400MHz):δ7.06(1H,d,J=15.6Hz,H-24),6.47(1H,d,J=15.6Hz,H-23),5.95(1H,d,H-1),5.77(1H,m,H-6),4.36(1H,m,H-16),3.50(1H,brs,H-10),3.21(1H,d,J=14.6Hz,H-12a),2.71(1H,d,J=14.6Hz,H-12b),2.47(1H,d,J=8.0Hz,H-17),2.37(1H,m,H-7a),2.04(1H,m,H-8),1.88(1H,m,H-15a),2.00(3H,s,CH3CO),1.89(1H,m,H-7b),1.56(3H,s,H-27),1.54(3H,s,H-26),1.47(1H,m,H-15b),1.42(3H,s,H-21),1.38(3H,s,H-30),1.35(3H,s,H-28),1.25(3H,s,H-29),1.03(3H,s,H-19),0.99(3H,s,H-18)。
13C NMR(CDCl3,100MHz):δ212.3(C-11),202.6(C-22),199.0(C-3),170.3(CH3CO),151.8(C-24),144.5(C-2),136.7(C-5),120.8(C-6),120.5(C-23),114.8(C-1),79.3(C-25),78.3(C-20),71.5(C-16),58.5(C-17),50.7(C-13),48.9(C-9),48.7(C-12),48.3(C-14),47.5(C-4),45.5(C-15),41.6(C-8),35.1(C-10),25.9(C-27),26.3(C-26),27.9(C-28),24.1(C-21),23.8(C-7),22.0(CH3CO),20.4(C-29),20.1(C-19),18.4(C-30),19.7(C-18)。
葫芦素E单葡萄糖苷,结构式如式(II)所示,为白色粉末。
结构确认:
HRESIMS m/z:741.3481[M+Na]+(calcd for C38H54O13Na:741.3457);
UV(MeOH)λmax:236nm;
1H-NMR(DMSO-d6,400MHz):δ6.79(1H,d,J=15.6Hz,H-24),6.84(1H,d,J=15.6Hz,H-23),5.80(1H,d,H-1),5.71(1H,brs,H-6),4.49(1H,m,H-16),3.61(1H,brs,H-10),3.35(1H,d,J=14.7Hz,H-12a),2.45(1H,d,J=14.7Hz,H-12b),2.35(1H,d,J=8.0Hz,H-17),2.26(1H,m,H-7a),1.97(3H,s,CH3CO),1.93(1H,m,H-7b),1.91(1H,m,H-8),1.73(1H,m,H-15a),1.50(3H,s,H-27),1.50(3H,s,H-26),1.30(3H,s,H-30),1.28(1H,m,H-15b),1.27(3H,s,H-21),1.18(3H,s,H-28),1.18(3H,s,H-29),0.86(3H,s,H-19),0.76(3H,s,H-18);4.57(1H,d,J=7.7Hz,H-1'),3.72(1H,m,H-6'a),3.61(1H,m,H-6'b),3.27(1H,m,H-5'),3.20(1H,m,H-3'),3.13(1H,s,H-4'),3.09(1H,s,H-2')。
13C NMR(DMSO-d6,100MHz):δ214.3(C-11),204.6(C-22),196.0(C-3),169.3(CH3CO),148.8(C-24),145.3(C-2),136.4(C-5),121.8(C-23),120.7(C-6),120.6(C-1),79.5(C-25),78.8(C-20),69.4(C-16),59.3(C-17),50.2(C-13),49.0(C-12),48.8(C-4),48.3(C-9),47.5(C-14),45.8(C-15),41.2(C-8),34.4(C-10),27.2(C-29),26.3(C-27),26.3(C-26),25.6(C-21),20.5(C-28),21.9(CH3CO),20.1(C-18),19.8(C-19),17.7(C-30);98.8(C-1'),77.5(C-5'),76.9(C-3'),72.8(C-2'),69.0(C-4'),60.0(C-6')。
本发明的有益效果如下:
本发明首次公开了一种从苦西瓜中提取纯化获得葫芦素E及其糖苷的方法,该方法对苦西瓜中的目标成分提取率较高,可达20%,纯度高达98%以上。所用的苦西瓜葫芦素E及糖苷含量远高于目前常用的甜瓜蒂,既解决了甜瓜蒂药材来源困难的问题,又大大降低了成本,使得原来“万元”级别的葫芦素E原料有望降低到“千元”水平。生产工艺简单,所用溶剂仅为乙醇、甲醇、水等,对环境污染性较小。对设备要求不高,易于工业化放大生产。
附图说明
图1为药西瓜葫芦素E及其糖苷含量分析。其中,A:药西瓜横切面图,B:不同取样位置含量分析,C:分别为药西瓜中葫芦素E及其单糖苷的含量(湿重)。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。若未特别指明,实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段,所用原料均为市售商品。
实施例1药西瓜中葫芦素E及糖苷的制备方法
取1kg药西瓜粗粉,加入1倍重量的75%乙醇润湿浸泡6小时,然后将润湿好的药西瓜样品加入到渗漉筒中,用75%乙醇渗漉提取,收集8倍量的渗滤液,减压真空浓缩至无醇味(体积约剩0.5L)。浓缩液中加入130mL 95%乙醇,使得浓缩液醇含量达到20%,离心过滤,得上清液和残渣。上清液上D101大孔树脂进行分离,依次用水、30%乙醇、50%乙醇、80%乙醇梯度洗脱,分别收集50%和80%乙醇洗脱液,减压浓缩回收溶剂得浸膏。50%乙醇洗脱所得浸膏用Agilent 1260半制备HPLC进行分离纯化,DAD检测器,采集波长为230nm,制备柱规格为反相C18色谱柱(20×250mm),流动相为甲醇:水(体积比45:55),流速为8ml/min,收集保留时间为16.5min左右的流出峰,得9.3g式(II)化合物,纯度为98.5%。80%乙醇洗脱所得浸膏用Agilent 1260半制备HPLC进行分离纯化,DAD检测器,采集波长为230nm,制备柱规格为反相C18色谱柱(20×250mm),流动相为甲醇:水(体积比65:35),流速为8ml/min,收集保留时间为19min左右的流出峰,得3.1g式(I)化合物,纯度为97.6%,提取率为20.6%。
实施例2药西瓜中葫芦素E及糖苷的制备方法
取1kg的药西瓜粗粉,加入1倍重量的75%乙醇润湿浸泡6小时,然后将润湿好的药西瓜样品加入到渗漉筒中,用75%乙醇渗漉提取,收集8倍量的渗滤液,减压真空浓缩至无醇味(体积约剩0.5L)。浓缩液中加入130mL95%乙醇,使得浓缩液醇含量达到20%,离心过滤,得上清液和残渣。上清液上AB-8大孔树脂进行分离,依次用水、30%乙醇、50%乙醇、80%乙醇梯度洗脱,分别收集50%和80%乙醇洗脱液,减压浓缩回收溶剂得浸膏。50%乙醇洗脱所得浸膏用Agilent 1260半制备HPLC进行分离纯化,DAD检测器,采集波长为230nm,制备柱规格为反相C18色谱柱(20×250mm),流动相为甲醇:水(体积比45:55),流速为8ml/min,收集保留时间为16.5min左右的流出峰,得10.1g式(II)化合物,纯度为98.1%。80%乙醇洗脱所得浸膏用Agilent 1260半制备HPLC进行分离纯化,DAD检测器,采集波长为230nm,制备柱规格为反相C18色谱柱(20×250mm),流动相为甲醇:水(体积比65:35),流速为8ml/min,收集保留时间为19min左右的流出峰,得3.6g式(I)化合物,纯度为97.7%,提取率为22.8%。
实施例3药西瓜中葫芦素E及糖苷的制备方法
取1kg的药西瓜粗粉,用75%的乙醇回流提取3次,每次1h,提取溶剂量分别为6倍量,5倍量,5倍量。合并提取液,减压真空浓缩至无醇味(体积约剩0.8L)。浓缩液中加入200mL 95%乙醇,使得浓缩液醇含量达到20%,离心过滤,得上清液和残渣。上清液上D101大孔树脂进行分离,依次用水、30%乙醇、50%乙醇、80%乙醇梯度洗脱,分别收集50%和80%乙醇洗脱液,减压浓缩回收溶剂得浸膏。50%乙醇洗脱所得浸膏用Agilent 1260半制备HPLC进行分离纯化,DAD检测器,采集波长为230nm,制备柱规格为反相C18色谱柱(20×250mm),流动相为甲醇:水(体积比45:55),流速为8ml/min,收集保留时间为16.5min左右的流出峰,得8.7g式(II)化合物,纯度为98.3%。80%乙醇洗脱所得浸膏用Agilent 1260半制备HPLC进行分离纯化,DAD检测器,采集波长为230nm,制备柱规格为反相C18色谱柱(20×250mm),流动相为甲醇:水(体积比65:35),流速为8ml/min,收集保留时间为19min左右的流出峰,得3.2g式(I)化合物,纯度为98.0%,提取率为19.7%。
实施例4野生西瓜中葫芦素E及糖苷的制备方法
取1kg的野生西瓜粗粉,加入1倍重量的75%乙醇润湿浸泡6小时,然后将润湿好的野生西瓜样品加入到渗漉筒中,用75%乙醇渗漉提取,收集8倍量的渗滤液,减压真空浓缩至无醇味(体积约剩0.5L)。浓缩液中加入200mL 95%乙醇,使得浓缩液醇含量达到20%,离心过滤,得上清液和残渣。上清液加至D101大孔树脂进行分离,依次用水、30%乙醇、50%乙醇、80%乙醇梯度洗脱,分别收集50%和80%乙醇洗脱液,减压浓缩回收溶剂得浸膏。50%乙醇洗脱所得浸膏用Agilent 1260半制备HPLC进行分离纯化,DAD检测器,采集波长为230nm,制备柱规格为反相C18色谱柱(20×250mm),流动相为甲醇:水(体积比45:55),流速为8ml/min,收集保留时间为16.5min左右的流出峰,得6.4g式(II)化合物,纯度为98.3%。80%乙醇洗脱所得浸膏用Agilent 1260半制备HPLC进行分离纯化,DAD检测器,采集波长为230nm,制备柱规格为反相C18色谱柱(20×250mm),流动相为甲醇:水(体积比65:35),流速为8ml/min,收集保留时间为19min左右的流出峰,得2.1g式(I)化合物,纯度为98.0%,提取率为20.5%。
虽然,上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述,但在本发明基础上,可以对之做一些修改或改进,这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此,在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进,均属于本发明要求保护的范围。
Claims (10)
1.苦西瓜中葫芦素E及糖苷的制备方法,其特征在于,用乙醇提取苦西瓜,然后除去乙醇,收集醇提物,再经过大孔树脂柱层析分离,半制备HPLC纯化,分别得到式(I)和式(II)所示的葫芦素E及单葡萄糖苷;
其中,所述苦西瓜是指鲜药材,或干药材粗粉。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,包括以下步骤:
1)用乙醇提取苦西瓜,然后除去乙醇,收集醇提物;
2)将所述醇提物溶解于乙醇中,使乙醇含量达20%,离心或抽滤收集上清液或滤液;
3)所述上清液或滤液进行大孔树脂柱层析分离,依次用水、30%乙醇、浓度不低于35%的乙醇、浓度不低于60%的乙醇梯度洗脱,分别收集浓度不低于35%和不低于60%的乙醇洗脱组分;
4)将收集得到的浓度不低于35%的乙醇洗脱组分用半制备HPLC进行分离纯化,得到式(II)所示化合物;
5)将收集得到的浓度不低于60%乙醇水洗脱组分用半制备HPLC进行分离纯化,得到式(I)化合物。
3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,步骤1)中所述乙醇的浓度为40%~95%,提取方法选自渗漉提取、加热回流提取或浸渍提取中的任一种。
4.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,步骤3)中所用大孔树脂的型号选自D101、AB-8、HP-20、H-103、DA-201、DM-130、XAD-16或DS-401。
5.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,步骤3)中所述浓度不低于35%的乙醇,其浓度范围为35%~60%;所述浓度不低于60%的乙醇,其浓度范围为60%~95%。
6.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,步骤4)进行HPLC分离纯化时,所用反相色谱柱的填料为C8或C18。
7.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,步骤4)进行HPLC分离纯化时,所用流动相为甲醇-水或乙腈-水,体积比10:90~70:30。
8.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,步骤5)进行HPLC分离纯化时,所用流动相为甲醇-水或乙腈-水,体积比30:70~80:20。
9.根据权利要求1-8任一项所述的方法,其特征在于,所述方法具体为:取1kg苦西瓜干药材粗粉,加入1倍重量的75%乙醇润湿浸泡6小时,然后将润湿好的苦西瓜样品加入到渗漉筒中,用75%乙醇渗漉提取,收集8倍量的渗滤液,减压真空浓缩至无醇味;浓缩液中加入130mL 95%乙醇,使得浓缩液乙醇含量达到20%,离心过滤,得上清液;将上清液加样至D101大孔树脂进行分离,依次用水、30%乙醇、50%乙醇、80%乙醇梯度洗脱,分别收集50%和80%乙醇洗脱液,减压浓缩得浸膏;
50%乙醇洗脱所得浸膏用Agilent 1260半制备HPLC进行分离纯化,DAD检测器,采集波长为230nm,制备柱规格为反相C18色谱柱20mm×250mm,流动相为甲醇:水体积比45:55的混合液,流速为8ml/min,收集保留时间为16.5min的流出峰,得到式(II)所示化合物;
80%乙醇洗脱所得浸膏用Agilent 1260半制备HPLC进行分离纯化,DAD检测器,采集波长为230nm,制备柱规格为反相C18色谱柱20mm×250mm,流动相为甲醇:水体积比65:35的混合液,流速为8ml/min,收集保留时间为19min的流出峰,得到式(I)所示化合物。
10.根据权利要求1-8任一项所述的方法,其特征在于,所述方法具体为:
取1kg苦西瓜鲜药材,用匀浆机打碎,用75%乙醇回流提取3次,每次1h,提取溶剂量分别为6倍量、5倍量和5倍量;合并提取液,减压真空浓缩至无醇味;向浓缩液中加入200mL95%乙醇,使得浓缩液乙醇含量达到20%,离心过滤,得上清液;将上清液加样至D101大孔树脂进行分离,依次用水、30%乙醇、50%乙醇、80%乙醇梯度洗脱,分别收集50%和80%乙醇洗脱液,减压浓缩回收溶剂得浸膏;
50%乙醇洗脱所得浸膏用Agilent 1260半制备HPLC进行分离纯化,DAD检测器,采集波长为230nm,制备柱规格为反相C18色谱柱20mm×250mm,流动相为甲醇:水体积比45:55混合液,流速为8ml/min,收集保留时间为16.5min的流出峰,得到式(II)所示化合物;
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20180720 |
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