CN102764320A - 山大颜提取物及其制备方法与抗肿瘤应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种山大颜提取物及其制备方法与抗肿瘤应用。山大颜提取物由如下方法制备而成：将山大颜经乙醇或甲醇加热回流或渗滤提取，减压浓缩得到浸膏，经大孔树脂富集，甲醇－水洗脱，得到山大颜提取物。本发明的山大颜提取物可用于制备治疗肿瘤的药物和保健品，其效部位成分明确，毒性小，药理作用强，具有良好的药用前景；制备工艺简单、易于大规模生产。
Description
技术领域
本发明涉及天然药物及化学药物领域，具体涉及山大颜提取物及其主要成分的制备方法和在抗肿瘤方面的应用。
背景技术
目前，我国共有恶性肿瘤患者约450万人，每年新增病例200多万，死亡病例约170万。恶性肿瘤已经超越心脑血管疾病，成为威胁人类生命的第一大杀手[1]。因此，研究开发抗癌药物一直是全世界医药界难点和热点。在我国，临床上中草药已被广泛应用于抗肿瘤，具有确切的疗效、较低的毒副作用、不易产生耐药等特点[2-4]，越来越受到医药工作者的关注。据统计，目前抗肿瘤药物中约有60%来源于天然产物[5-6]。
山大颜为茜草科植物九节木（Psychotria asiatica L.）的干燥叶及嫩枝，又名大丹叶、暗山公、暗山香、刀伤木、青龙吐雾（台湾）。具有清热燥湿、解毒、杀虫等功效。临床上常用于治疗感冒、上呼吸道感染、急性扁桃体炎、肠炎、细菌性痢疾、高血压等疾病[7-8]。近年有研究表明，山大颜能具有显著的抗老年痴呆的活性[9]。同时也是国家非物质文化遗产——广东凉茶的常用中药之一，但是尚未见山大颜在抗肿瘤研究方面的报道。本专利首次公开了山大颜总三萜皂苷及其7种主要成分Psychotrianosides A~G的抗肿瘤作用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种山大颜提取物及其制备方法和在抗肿瘤方面的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种山大颜提取物，其化学成分主要为三萜皂苷类，其中总三萜皂苷所占质量百分数为20~90%；所述总三萜皂苷主要是13-28环氧的乌苏烷型三萜皂苷，主要包括新化合物Psychotrianosides A~F(1~6)和从自然界中首次获得的天然产物Psychotrianosides G(7)（结构如图1所示）的混合物，此7种三萜皂苷占总三萜皂苷质量的20~80%；所述具有抗肿瘤作用的山大颜提取物HPLC检测总皂苷含有上述7种三萜皂苷的含量依次为：6~10%的1、10~40%的2、2~5%的3、3~8%的4、3~8%的5、3~8%的6、10~15%的7；所述百分比为质量百分比；
所述具有抗肿瘤作用的山大颜主要成分是指三萜皂苷化合物Psychotrianosides A~G。
所述Psychotrianosides A~G的制备方法包括以下步骤：山大颜经乙醇/水加热提取，减压浓缩得浸膏，浸膏加水搅拌，依次用有机溶剂萃取，正丁醇部位大孔树脂富集，乙醇/水洗脱，产物在经反相ODS分离纯化（甲醇/水洗脱）、重结晶后得到。
所述山大颜提取物由如下方法制备而成：将山大颜经乙醇或甲醇加热回流或渗滤提取，减压浓缩得到浸膏，经大孔树脂富集，甲醇－水洗脱，得到山大颜提取物。所述乙醇或甲醇的体积浓度是65~90%。具体包括如下步骤：山大颜（Psychotria sp.）干燥茎经乙醇(或甲醇)80℃回流(或渗滤)提取，减压浓缩得到浸膏，浸膏经大孔树脂富集，甲醇—水(V/V=40~90%)梯度洗脱，得到山大颜提取物；该提取物经硅胶柱层析分离，用石油醚（PE）-乙酸乙酯（EtOAc）(100:0→0:100) 梯度洗脱（10个百分点为一个梯度），TLC追踪，得到18个馏分(C1-C18)，馏分C15经氯仿甲醇（10:1~10:3）梯度洗脱（每100ml为一个流份），TLC追踪，得两个馏分A1（10:1）和A2（10:3）；A1经反相碳十八（简称ODS）(VMeOH/VH2O=85:15)分离纯化，TLC追踪，依次得7,1。A2经ODS(VMeOH/VH2O=60:40)分离纯化，TLC追踪，10%硫酸乙醇显色，依次得2和3；C18经ODS(VMeOH/VH2O=50:50~60:40)纯化，TLC追踪，10%硫酸乙醇显色，依次得4、5、6。
上述山大颜提取物能用于制备治疗肿瘤药物或保健品，所述肿瘤为胃癌、肝癌、肺癌、肠癌、鼻咽癌、乳腺癌、耐药型肝癌或耐药型乳腺癌。
肿瘤细胞包括NCI-N87（人胃癌细胞）、A549（人非小细胞肺癌细胞）、Lovo（人结肠癌细胞）、CNE-2（人鼻咽癌细胞）、DU145（人前列腺癌细胞）、KB（人口腔上皮癌细胞）、MDA-MB-231（人乳腺癌细胞）、HepG2（人肝癌细胞）、HepG2/ADM（人肝癌多柔比星耐药株）、MCF-7（人乳腺癌细胞）、MCF-7/ADR（人乳腺癌阿霉素耐药株）。本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
1、山大颜提取物总三萜皂苷用于治疗癌症，有效部位成分明确，毒性小，药理作用强，具有良好的药用前景。
2、本发明的山大颜提取物（20~100μg/ml浓度下）和Psychotrianosides A~G（5~50μM）即可显著抑制肿瘤细胞敏感株和多药耐药株的生长。
3、本发明的山大颜提取物在体内可明显抑制移植瘤的生长，灌胃给药200mg/kg的抑制率达43.63%；Psychotrianosides B灌胃给药50mg/kg的抑制率达48.71%。
4、本发明的山大颜提取物和Psychotrianosides B在体内毒性很 低，灌胃给药5g/kg仍未见明显毒性。
5、本发明的原料山大颜资源广泛、价廉，制备工艺简单、易于大规模生产，所得提取物中总三萜皂苷含量高达50%以上。
6、本发明中的含有Psychotrianosides A~G七种有效成分的、总含量为1~99%的山大颜提取物总三萜皂苷可与药学上可接受的赋型剂一起，采用本领域的常规方法制备成各种剂型，如片剂、丸剂、胶囊剂、颗粒剂等。给药剂量为50-500mg/人/次，每天1~3次。
附图说明
图1为山大颜中三萜皂苷类成分的化学结构图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1、山大颜提取物的制备
干燥的山大颜（Psychotria sp.）茎（产于广东从化）2.0kg，粉碎后过20目筛，用95%乙醇25L渗滤提取，滤出提取液，减压浓缩至浸膏（300g），然后加入2L的水，进行大孔树脂富集，洗脱剂甲醇—水梯度洗脱（10个百分点为一个梯度），TLC追踪，50~90%段收集，减压浓缩除去溶剂即为山大颜提取物（60g）。经HPLC测定，总三萜皂苷的质量含量为88%。其中7种三萜皂苷的含量依次为：8.5%的1、22.8%的2、2.5%的3、6.0%的4、2.5%的5、5.0%的6、15.0%的7；所述百分比为质量百分比。
实施例2、山大颜提取物的制备
干燥的山大颜（Psychotria sp.）茎（产于广东从化）2.0kg，粉碎后过20目筛，用甲醇25L渗滤提取，滤出提取液，减压浓缩至浸膏（350g），然后加入2L的水，进行大孔树脂富集，洗脱剂甲醇-水 （10个百分点为一个梯度），TLC追踪，65~90%段收集，减压浓缩除去溶剂即为山大颜提取物（70g）。经HPLC测定，总三萜皂苷的质量含量为93%。其中7种三萜皂苷的含量依次为：9.0%的1、35.0%的2、2.5%的3、7.0%的4、2.5%的5、5.5%的6、14.0%的7；所述百分比为质量百分比。
实施例3、山大颜提取物的制备
干燥的山大颜（Psychotria sp.）茎（产于广东从化）2.0kg，粉碎后过20目筛，用60-80%甲醇/水25L加热回流提取，滤出提取液，减压浓缩至浸膏（500g），然后加入2L的水，进行大孔树脂富集，洗脱剂甲醇—水（10个百分点为一个梯度），TLC追踪，55~90%段收集，减压浓缩除去溶剂即为山大颜提取物（75g）。经HPLC测定，总三萜皂苷的质量含量为95%。其中7种三萜皂苷的含量依次为：8.0%的1、37.0%的2、3.0%的3、7.0%的4、3.0%的5、4.5%的6、13.5%的7；所述百分比为质量百分比。
实施例4、山大颜提取物的制备
干燥的山大颜（Psychotria sp.）茎（产于广东从化）2.0kg，粉碎后过20目筛，用60-80%甲醇/水25L加热回流提取，滤出提取液，减压浓缩至浸膏（550g），然后加入2L的水，捏溶，依次用石油醚和乙醚提出低极性成分，正丁醇萃取，减压浓缩除去溶剂即为山大颜提取物（70g）。经HPLC测定，总三萜皂苷质量含量为40.0-75.0%。其中7种三萜皂苷的含量依次为：2.0~4.0%的1、15.0~35.0%的2、1.5~3.0%的3、3.5~5.0%的4、1.5~3.0%的5、1.5~3.0%的6、13.5~15.0%的7；所述百分比为质量百分比。
实施例5、山大颜提取物的制备
干燥的山大颜（Psychotria sp.）茎（产于广东从化）2.0kg，粉碎后过20目筛，用60-80%乙醇/水25L加热回流提取，滤出提取液，减压浓缩至浸膏（600g），然后加入2L的水，捏溶，依次用石油醚和乙醚提出低极性成分，正丁醇萃取，减压浓缩除去溶剂即为山大颜提取物（75g）。经测定，总三萜皂苷质量含量为60-80%。其中7种三萜皂苷的含量依次为：3.0~5.0%的1、20.0~35.0%的2、2.5~3.0%的3、3.5~5.0%的4、2.5~3.0%的5、2.5~3.0%的6、13.5~15.0%的7；所述百分比为质量百分比。
实施例6、新化合物的分离、物理常数和光谱数据
（1）新化合物的提取分离：山大颜10kg，粉碎成粗粉，采用甲醇渗漉提取，减压回收溶剂至无醇味，得浸膏约1.0kg。浸膏加少量水混悬，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得到石油醚部位50g、乙酸乙酯部位82g和正丁醇部位380g。对乙酸乙酯部位进行硅胶柱层析分离，用PE-EtOAc(100:0→0:100)梯度洗脱得到18个馏分(C1-C18)，馏分C15经氯仿甲醇梯度洗脱得两个馏分A1和A2；A1经ODS(VMeOH/VH2O=85:15)分离纯化得7(60mg)和1(30mg)。A2经ODS(VMeOH/VH2O=60:40)分离纯化得2(600mg),3(30mg)；C18经ODS(VMeOH/VH2O=50:50~60:40)纯化得4(30mg),5(20mg),6(20mg)。
（2）新化合物的结构检测：
NMR测试：取各样品30mg用0.5ml氘代吡啶溶解置于核磁管（φ=3mm）中在核磁测试仪(美国Varian公司，Varian INOVA500NB)进行1H、13C、DEPT、1H-1H COSY、HMBC、HMQC、TOCSY测试，得到化合物相应谱图，以备解析。
MS测试：
低分辨质谱检测：样品甲醇溶解在液质联用仪（Thremo公司，LCQ DECA XP液-质联用仪）上进行LC-ESI-MS测试及多级质谱测试，得到化合物相应谱图，以备解析。
高分辨质谱检测：样品甲醇溶解在液质联用仪（日本岛津LCMS-IT-TOF高分辨液相-质谱联用仪）上进行高分辨质谱测试，得到化合物相应谱图，以备解析。
旋光测试：精确称量样品，甲醇溶解于容量瓶（25ml），在旋光仪（德国SCHM IDT+HAENSCH公司，POLARTRON IC HH W5旋光仪)上测试旋光，计算比旋光。
（3）新化合物Psychotrianosides A(1)的物理常数和波谱数据
白色无定型粉末，[α]20 D8.00°(c=0.05,MeOH);HR-ESI-MS m/z629.4041[M+Na]+(calcd.for C35H58O8Na,629.4024);1H NMR(Pyr-d5)δH,ppm,1.65(dd,13.4,3.2,1H,H-1),1.81(d,12.3,1H,H-2),1.97(dd,13.5,3.2,1H,H-2),3.37(dd,4.0,12.0,1H,H-3),0.79(d,8.0,1H,H-1),1.47(t,13.2,H-12),2.07(dd,14.4,5.6,H-12),1.49(d,13.7,H-15),2.25(dd,14.7,5.3,H-15),4.26(br s,1H,H-16),1.87(dd,2.4,12.0,1H,H-18),2.05(dd,2.4,12.0,1H,H-19),2.79(dd,12.0,15.2,1H,H-19),1.25(dd,13.6,8.7,H-21),2.56(dt,5.1,13.6,1H,H-21),1.59(dd,13.6,5.0,H-22),1.91(dd,13.6,5.0,H-22),1.26(s,3H,H-23)0.98(s,3H,H-24),0.91(s,3H, H-25),1.37(s,3H,H-26),1.63(s,3H,H-27),3.33(dd,4.0,10.0,1H,H-28),3.63(dd,4.0,10.0,1H,H-28),1.35(s,3H,H-29),3.84(m,1H,H-30),4.32(m,1H,H-30),4.79(d,8.0,1H,Ara-H-1),4.44(dd,8.0,10.0,1H,Ara-H-2),4.17(dd,8.0,10.0,1H,Ara-H-3),4.26(m,1H,Ara-H-4),3.77(d,12.0,1H,Ara-H-5),4.01(d,10.4,1H,Ara-H-5);13C NMR(Pyr-d5)δC,ppm38.8(C-1),26.3(C-2),88.2(C-3),39.2(C-4),55.4(C-5),17.4(C-6),33.9(C-7),42.0(C-8),50.7(C-9),39.0(C-10),18.8(C-11),31.2(C-12),86.1(C-13),44.2(C-14),36.8(C-15),77.2(C-16),44.1(C-17),50.6(C-18),34.0(C-19),36.7(C-20),36.4(C-21),31.2(C-22),27.6(C-23),16.7(C-24),16.5(C-25),18.3(C-26),19.4(C-27),77.7(C-28),28.5(C-29),66.6(C-30),107.4(Ara-C-1),72.9(Ara-C-2),74.6(Ara-C-3),69.4(Ara-C-4),66.0(Ara-C-5).
（4）新化合物Psychotrianosides B(2)的物理常数和波谱数据
白色无定型粉末,[α]20 D+23.04°(c,0.217,MeOH);HR-ESI-MS m/z921.4815[M+Na]+(calcd.for C46H74O17Na,921.4818);ESI-MS m/z905[M+Li]+,773[M+Li-C5H8O4]+,611[M+Li-C5H8O4-C6H10O5]+,479[M+Li-C5H8O4-C6H10O5-C5H8O4]+;1H NMR(Pyr-d5)δH,ppm,1.66(dd,3.2,13.6,1H,H-1),1.86(d,13.6,1H,H-2),2.04(m,1H,H-2),3.31(dd,4.0,12.0,1H,H-3),0.74(d,11.2,1H,H-5),1.43(t,13.2,H-12),2.09(br d,12.8,1H,H-12),1.49(d,13.7,H-15),2.15(dd,5.6,15.0,1H,H-15),4.23(br s,1H,H-16),1.38(t,13.2,1H,H-18),2.09(br d,12.8,1H, H-19),2.83(br t,13.6,1H,H-19),2.51(dt,4.8,13.2,1H,H-21),1.94(dd,5.0,14.0,1H,H-22),1.26(s,3H,H-23),0.98(s,3H,H-24),0.84(s,3H,H-25),1.27(s,3H,H-26),1.53(s,3H,H-27),3.14(d,7.6,1H,H-28),3.54(d,7.6,1H,H-28),9.60(s,1H,H-29),0.99(s,3H,H-30),4.64(d,7.2,1H,Ara-H-1),4.26(dd,7.4,11.8,1H,Ara-H-2),3.98(dd,3.2,9.2,1H,Ara-H-3),4.12(br s,1H,Ara-H-4),3.72(d,12.0,1H,Ara-H-5),4.63(t,6.4,1H,Ara-H-5),4.98(d,7.6,1H,Glc-H-1),3.87(dd,2.4,8.0,1H,Glc-H-2),3.93(br s,1H,Glc-H-3),4.18(dd,4.4,9.6,1H,Glc-H-4),3.82(br s,1H,Glc-H-5),4.28(dd,5.6,12.6,1H,Glc-H-6),4.43(d,10.0,1H,Glc-H-6),4.83(d,6.0,1H,Xyl-H-1),3.93a(br s,1H,Xyl-H-2),4.19(br d,4.4,1H,Xyl-H-3),3.95(br s,1H,Xyl-H-4),3.42(br t,1H,9.6,Xyl-H-5),4.28(br t,1H,9.2,Xyl-H-5);13C NMR(Pyr-d5)δC,ppm,39.8(C-1),27.3(C-2),89.3(C-3),40.2(C-4),56.2(C-5),18.4(C-6),32.1(C-7),45.1(C-8),50.9(C-9),37.3(C-10),19.6(C-11),32.4(C-12),86.9(C-13),43.0(C-14),37.3(C-15),77.4(C-16),44.5(C-17),53.8(C-18),33.1(C-19),48.5(C-20),34.8(C-21),31.0(C-22),28.6(C-23),17.3(C-24),16.9(C-25),19.0(C-26),20.3(C-27),78.1(C-28),207.4(C-29),24.6(C-30),107.3(Ara-C-1),73.6(Ara-C-2),74.3(Ara-C-3),81.0(Ara-C-4),66.99(Ara-C-5),105.12(Glc-C-1),85.0(Glc-C-2),77.6(Glc-C-3),70.8(Glc-C-4),78.0(Glc-C-5),62.2(Glc-C-6),107.8(Xyl-C-1),76.1(Xyl-C-2),77.4(Xyl-C-3),70.2(Xyl-C-4),66.2(Xyl-C-5).
（5）新化合物Psychotrianosides C(3)的物理常数和波谱数据
白色无定型粉末,[α]20 D-51.60°(c,0.056,MeOH);HR-ESI-MS m/z905.4859[M+Na]+(calcd.for C46H74O16Na,905.4869);ESI-MS m/z887[M+Li]+,755[M+Li-C5H8O4]+,593[M+Li-C5H8O4-C6H10O5]+,461[M+Li-C5H8O4-C6H10O5-C5H8O4]+;1H NMR(Pyr-d5)δH,ppm,1.90(d,12.0,1H,H-1),2.12(dt,13.5,3.2,1H,H-2),3.31(dd,4.0,12.0,1H,H-3),0.73(d,8.4,1H,H-5),2.26(dd,4.4,11.0,1H,H-12),1.21(m,1H,H-15),1.77(m,1H,H-15),1.99(m,1H,H-18),2.01(m,1H,H-19),2.84(d,16.0,1H,H-19),1.64(dd,13.2,8.0,1H,H-21),1.50(dd,13.2,4.0,1H,H-22),1.91(dd,13.2,4.0,1H,H-22),1.29(s,3H,H-23),1.01(s,3H,H-24),0.86(s,3H,H-25),1.31(s,3H,H-26),1.10(s,3H,H-27),3.52(d,8.0,1H,H-28),3.91(d,8.0,1H,H-28),0.91(s,3H,H-29),1.29(s,3H,H-30),4.67(d,7.2,1H,Ara-H-1),4.31(dd,7.4,11.8,1H,Ara-H-2),4.03(dd,4.8,8.8,1H,Ara-H-3),4.15(br s,1H,Ara-H-4),3.75(d,12.0,1H,Ara-H-5),4.66(br t,6.0,1H,Ara-H-5),5.04(d,8.0,1H,Glc-H-1),3.96a(dd,2.4,8.4,1H,Glc-H-2),4.24(dd,4.8,8.8,1H,Glc-H-3),4.24(dd,4.8,8.8,1H,Glc-H-4),3.86,(br s,1H,Glc-H-5),4.34(dd,4.8,7.2,1H,Glc-H-6),4.45(dd,2.0,11.40,1H,Glc-H-6),4.91(d,8.0,1H,Xyl-H-1),3.98(br t,6.4,1H,Xyl-H-2),3.98(br t,6.4,1H,Xyl-H-3),3.98(br t,6.4,1H,Xyl-H-4),3.48(br t,10.0,1H,Xyl-H-5),4.29(br t,9.6,1H,Xyl-H-5);13C NMR(Pyr-d5)δC,ppm,39.1(C-1),26.3(C-2),88.7(C-3),39.6(C-4),55.1(C-5),18.4(C-6),33.3(C-7),42.9(C-8),50.2(C-9),36.3(C-10),17.2(C-11),24.5(C-12),86.1(C-13), 42.9(C-14),45.7(C-15),212.5(C-16),56.1(C-17),54.6(C-18),35.1(C-19),36.7(C-20),38.6(C-21),31.2(C-22),27.4(C-23),16.7(C-24),16.1(C-25),18.3(C-26),23.5(C-27),75.4(C-28),32.8(C-29),23.0(C-30),107.5(Ara-C-1),73.7(Ara-C-2),74.4(Ara-C-3),81.2(Ara-C-4),66.4(Ara-C-5),105.3(Glc-C-1),86.2(Glc-C-2),77.5(Glc-C-3),70.3(Glc-C-4),78.2(Glc-C-5),62.4(Glc-C-6),107.99(Xyl-C-1),76.2(Xyl-C-2),77.8(Xyl-C-3),70.4(Xyl-C-4),67.2(Xyl-C-5).
（6）新化合物Psychotrianosides D(4)的物理常数和波谱数据
白色无定型粉末,[α]20 D-115.60°(c,0.016,MeOH);HR-ESI-MS m/z,1053.5588[M+Na]+(calcd.for C52H86O20Na,1053.5605);ESI-MS m/z1037[M+Li]+,891[M+Li–C6H10O4]+,905[M+Li-C5H8O4],759[M+Li-C6H10O4-C5H8O4,or M+LiC5H8O4-C6H10O4]+,597[M+Li-C6H10O4-C5H8O4-C6H10O5,or M+Li-C5H8O4-C6H10O4-C6H10O5]+,465[M+Li-C6H10O4-C5H8O4-C6H10O5-C5H8O4,or M+Li-C5H8O4-C6H10O4-C6H10O5-C5H8O4]+;1H NMR(Pyr-d5)δH,ppm,1.67(br d,10.0,1H,H-1),1.54(br d,13.0,1H,H-2),3.30(dd,5.4,11.2,1H,H-3),0.76(d,9.6,1H,H-5),2.24(dd,6.0,14.5,1H,H-12),1.56(d,13.7,1H,H-15),1.90(dd,6.5,15.0,1H,H-15),4.20(br s,1H,H-16),1.68(br d,12.5,1H,H-18),1.28(dd,13.6,8.7,H-19),2.77(dd,11.5,14.5,1H,H-19),1.26(dd,13.6,8.7,H-21),2.55(dt,5.0,13.5,1H,H-21),1.90(dd, 4.2,15.0,1H,H-22),1.26(s,3H,H-23),1.00(s,3H,H-24),0.88(s,3H,H-25),1.28(s,3H,H-26),1.54(s,3H,H-27),3.30(d,7.0,1H,H-28),3.61(d,7.0,1H,H-28),1.07(s,3H,H-29),0.97(s,3H,H-30),4.55(d,7.5,1H,Ara-H-1),4.30(m,1H,Ara-H-2),3.975(dd,3.2,9.2,1H,Ara-H-3),4.097(br s,1H,Ara-H-4),3.71(d,10.0,1H,Ara-H-5),4.64(brt,7.0,1H,Ara-H-5),4.98(d,7.0,1H,Glc-H-1),3.975(d,8.0,1H,Glc-H-2),3.72(br s,1H,Glc-H-3),4.20(dd,4.4,10.0,1H,Glc-H-4),4.12(dd,10.0,1H,Glc-H-5),4.30(dd,4.0,11.5,1H,Glc-H-6),4.39(d,1.0,1H,Glc-H-6),4.86(d,8.0,1H,Xyl-H-1),4.04a(br t,6.4,1H,Xyl-H-2),3.98a(br t,6.4,1H,Xyl-H-3),4.10(br t,6.4,1H,Xyl-H-4),3.43(brt,8.5,1H,Xyl-H-5),4.20(d,6.0,1H,Xyl-H-5),5.93(d,1.0,1H,Rha-H-1),4.971(d,7.0,1H,Rha-H-2),4.59(dd,3.5,9.5,1H,Rha-H-3),3.975(d,8.8,1H,Rha-H-4),4.097(dd,6.5,9.5,1H,Rha-H-5),1.64(d,6.5,3H,Rha-H-6);13C NMR(Pyr-d5)δC,ppm,39.2(C-1),26.0(C-2),88.7(C-3),39.6(C-4),55.7(C-5),17.8(C-6),33.0(C-7),44.5(C-8),50.5(C-9),36.9(C-10),19.2(C-11),29.7(C-12),86.0(C-13),42.4(C-14),36.7(C-15),77.1(C-16),44.5(C-17),51.5(C-18),34.4(C-19),36.9(C-20),36.9(C-21),31.8(C-22),28.0(C-23),16.7(C-24),16.4(C-25),18.5(C-26),19.5(C-27),77.9(C-28),33.7(C-29),24.7(C-30),107.3(Ara-C-1),73.7(Ara-C-2),74.1(Ara-C-3),81.2(Ara-C-4),65.7(Ara-C-5),105.6(Glc-C-1),81.6(Glc-C-2),77.8(Glc-C-3),70.5(Glc-C-4),86.4(Glc-C-5),61.9(Glc-C-6),104.97(Xyl-C-1),73.6(Xyl-C-2),77.99(Xyl-C-3),69.6(Xyl-C-4),66.6(Xyl-C-5),103.5(Rha-C-1),72.1(Rha-C-2),72.5(Rha-C-3),75.2(Rha-C-4),70.5(Rha-C-5),18.4(Rha-C-6).
（7）新化合物Psychotrianosides E(5)的物理常数和波谱数据
白色无定型粉末,[α]20 D-85.60°(c,0.028,MeOH);HR-ESI-MS m/z,1069.5548[M+Na]+(calcd.for C52H86O21Na,1069.5554);ESI-MS m/z1053[M+Li]+,921[M+Li–C5H8O4]+,759[M+Li–C5H8O4–C6H10O5]+,597[M+Li–C5H8O4-C6H10O5-C6H10O5]+,465[M+Li–C5H8O4-C6H10O5-C6H10O5-C5H8O4]+;1H NMR(Pyr-d5)δH,ppm,1.66(dd,4.0,14.4,1H,H-1),1.80(br t,12.8,1H,H-2),2.00(dd,4.5,13.2,1H,H-2),3.16(dd,4.4,12.0,1H,H-3),0.69(d,11.8,1H,H-5),1.46(t,13.8,1H,H-11),1.80(dd,3.6,11.8,1H,H-11),1.46(t,13.8,1H,H-12),2.00(dd,3.6,13.2,1H,H-12),1.47(br t,14.0,1H,H-15),2.24(dd,4.8,14.4,1H,H-15),3.79(br s,1H,H-16),1.66(br t,14.0,1H,H-18),2.78(br t,13.6,1H,H-19),2.56(dt,4.4,14.2,1H,H-21),1.94(dd,3.2,13.4,1H,H-22),1.21(s,3H,H-23),1.09(s,3H,H-24),0.86(s,3H,H-25),1.34(s,3H,H-26),1.54(s,3H,H-27),3.32(d,7.2,1H,H-28),3.61(d,7.2,1H,H-28),1.08(s,3H,H-29),0.98(s,3H,H-30),4.79(d,6.0,1H,Ara-H-1),4.55(d,6.0,1H,Ara-H-2),4.03(d,4.0,1H,Ara-H-3), 4.22(dd,4.0,8.8,1H,Ara-H-4),3.72(d,12.0,1H,Ara-H-5),4.63(dd,3.6,12.0,1H,Ara-H-5),5.00(d,10.0,1H,Glc I-H-1),3.92(br t,8.8,1H,Glc I-H-2),4.22a(dd,4.0,8.0,1H,Glc I-H-3),4.13(m,1H,Glc I-H-4),4.13(m,1H,Glc I-H-5),4.30(dd,5.2,12.0,1H,Glc I-H-6),4.44(dd,2.0,12.0,1H,Glc I-H-6),4.92(d,8.5,1H,Glc II-H-1),4.25(t,7.6,1H,GlcII-H-2),4.03(d,4.0,1H,Glc II-H-3),4.10a(br t,10.0,1H,Glc II-H-4),4.25(t,7.6,1H,Glc II-H-5),4.56(d,9.6,1H,Glc II-H-6),4.40(d,4.8,1H,Glc II-H-6),5.49(d,8.5,1H,Xyl-H-1),4.10a(br t,10.0,1H,Xyl-H-2),3.79(brs,1H,Xyl-H-3),4.25(t,7.6,1H,Xyl-H-4),3.73(br d,13.5,1H,Xyl-H-5),4.57(d,6.0,1H,Xyl-H-5);13C NMR(Pyr-d5)δC,ppm,39.1(C-1),26.5(C-2),89.0(C-3),39.7(C-4),55.7(C-5),17.9(C-6),32.8(C-7),44.5(C-8),50.5(C-9),36.8(C-10),19.2(C-11),29.9(C-12),86.4(C-13),42.4(C-14),36.8(C-15),78.2(C-16),44.6(C-17),51.5(C-18),38.9(C-19),36.8(C-20),36.9(C-21),31.8(C-22),27.7(C-23),16.6(C-24),16.4(C-25),18.5(C-26),19.2(C-27),77.9(C-28),33.7(C-29),24.3(C-30),104.6(Ara-C-1),79.6(Ara-C-2),76.0(Ara-C-3),71.0(Ara-C-4),64.1(Ara-C-5),104.1(Glc I-C-1),85.3(Glc I-C-2),77.1(Glc I-C-3),70.6(Glc I-C-4),77.7(Glc I-C-5),62.25(Glc I-C-6),107.6(GlcII-C-1),77.5(GlcII-C-2),77.9(GlcII-C-3),76.2(GlcII-C-4),78.5(GlcII-C-5),62.9(GlcII-C-6),104.8(Xyl-C-1),76.2(Xyl-C-2),78.2(Xyl-C-3),71.8(Xyl-C-4),67.4(Xyl-C-5).
（8）新化合物Psychotrianosides F(6)的物理常数和波谱数据
白色无定型粉末,[α]20 D-50.00°(c,0.056,MeOH);HR-ESI-MS m/z,1111.5606[M+Na]+(calcd.for C54H88O22Na,1111.5659);ESI-MS m/z1095[M+Li]+,963[M+Li-C5H8O4],801[M+Li-C5H8O4-C6H10O5]+,655[M+Li-C5H8O4-C6H10O5-C6H10O4]+,497[M+Li–C5H8O4-C6H10O5–C6H10O4-C5H8O4]+;1H NMR(Pyr-d5)δH,ppm,1.67(br d,12.8,1H,H-1),1.80(dt,4.4,12.4,1H,H-2),3.31(dt,4.4,11.6,1H,H-3),0.75(d,10.8,1H,H-5),1.46(br t,14.0,2H,H-6),1.91(dt,2.8,13.8,1H,H-7),1.46(br t,14.0,1H,H-11),1.80(dt,4.4,12.4,1H,H-11),1.46(br t,14.0,1H,H-15),2.24(dd,4.8,14.4,1H,H-15),4.19(brs,1H,H-16),1.67(br d,12.8,1H,H-18),1.32(m,1H,H-19),2.75(br t,13.6,1H,H-19),1.22(t,9.2,1H,H-21),2.53(dt,4.8,13.2,1H,H-21),1.47(br t,11.8,1H,H-22),2.05(t,12.8,1H,H-22),1.24(s,3H,H-23),0.99(s,3H,H-24),0.88(s,3H,H-25),1.34(br s,3H,H-26),1.53(s,3H,H-27),3.31(d,7.0,1H,H-28),3.60(d,7.6,1H,H-28),1.07(s,3H,H-29),3.41(t,10.8,1H,H-30),4.19(brs,1H,H-30),4.634(d,7.2,1H,Ara-H-1), 4.96(d,4.8,1H,Ara-H-2),4.23(dd,3.6,9.2,1H,Ara-H-3),4.08(d,9.6,1H,Ara-H-4),3.70(d,11.6,1H,Ara-H-5),4.62d,10.8,1H,Ara-H-5),4.852(d,8.0,1H,Glc-H-1),3.95(d,7.2,1H,Glc-H-2),3.70(d,11.6,1H,Glc-H-3),4.21(m,1H,Glc-H-4),4.08(d,9.6,1H,Glc-H-5),4.79(dd,5.2,12.0,1H,Glc-H-6),4.98(dd,2.0,11.8,1H,Glc-H-6),2.05(s,3H,AcO),5.89(br s,1H,Rha-H-1),4.97(d,6.4,1H,Rha-H-2),4.51(d,8.8,1H,Rha-H-3),4.47(bt t,7.2,1H,Rha-H-4),4.08(d,9.6,1H,Rha-H-5),1.61(d,6.4,3H,Rha-H-6),4.96(d,7.2,1H,Xyl-H-1),4.01(br t,9.2,1H,Xyl-H-2),4.21(m,1H,Xyl-H-3),4.18(t,7.6,1H,Xyl-H-4),3.65(br d,11.2,1H,Xyl-H-5),4.53(d,6.4,1H,Xyl-H-5);13C NMR(Pyr-d5)δC,ppm,39.2(C-1),26.6(C-2),88.7(C-3),39.6(C-4),55.3(C-5),17.8(C-6),31.7(C-7),44.5(C-8),50.1(C-9),36.8(C-10),19.1(C-11),29.8(C-12),86.3(C-13),42.3(C-14),36.9(C-15),77.0(C-16),44.6(C-17),51.1(C-18),38.9(C-19),36.8(C-20),36.8(C-21),32.8(C-22),27.9(C-23),16.7(C-24),16.4(C-25),18.5(C-26),19.5(C-27),77.6(C-28),33.7(C-29),66.6(C-30),107.2(Ara-C-1),72.4(Ara-C-2),73.7(Ara-C-3),81.2(Ara-C-4),65.7(Ara-C-5),105.0(Glc-C-1),85.3(Glc-C-2),77.8(Glc-C-3),71.0(Glc-C-4),77.9(Glc-C-5),64.4(Glc-C-6),171.0(C=O),20.8(COCH3),103.5(Rha-C-1),72.1(Rha-C-2),72.5(Rha-C-3),80.5(Rha-C-4),69.5(Rha-C-5),18.3(Rha-C-6),105.6(Xyl-C-1),75.9(Xyl-C-2),78.3(Xyl-C-3),71.0(Xyl-C-4),67.3(Xyl-C-5).
（9）天然产物Psychotrianosides G(7)的物理常数和波谱数据
白色无定型粉末,[α]20 D+43.60°(c,0.011,MeOH).1H NMR(Pyr-d5)δH,ppm,1.71(dd,3.2,10.0,1H,H-1),1.93(dt,3.2,13.6,1H,H-2),3.36(dd,4.4,11.6,1H,H-3),0.78(d,12.0,1H,H-5),2.10(t,13.2,1H,H-12),2.54(td,4.8,12.6,1H,H-12),1.43(d,13.7,1H,H-15),1.93(dd,14.7,5.3,1H,H-15),4.26(br s,1H,H-16),1.29(dd,2.4,12.0,1H,H-18),2.09(dd,2.4,12.0,1H,H-19),2.86(dd,13.0,16.0,1H,H-19),1.45(dd,13.6,8.7,1H,H-21),2.52(dt,4.8,12.6,1H,H-21),1.56(dd,13.6,4.8,1H,H-22),1.93(dd,13.6,4.8,1H,H-22),1.02(s,3H,H-23),0.96(s,3H,H-24),0.88(s,3H,H-25),1.32(s,3H,H-26),1.56(s,3H,H-27)3.16(d,7.2,1H,H-28),3.55(d,7.2,1H,H-28),1.30(s,3H,H-29),9.63(br s,1H,H-30),4.78(d,7.2,1H,Ara-H-1),4.43(dd,6.8,12.0,1H,Ara-H-2),4.16(dd,3.2,7.6,1H,Ara-H-3),4.34(m,1H,Ara-H-4),3.84(td,2.4,10.4,1H,Ara-H-5),4.31(m,1H,Ara-H-5);13C NMR(Pyr-d5)δC,ppm,39.2(C-1),26.3(C-2),88.2(C-3),39.6(C-4),55.2(C-5),17.4(C-6),32.1(C-7),43.5(C-8),52.8(C-9),42.0(C-10),18.6(C-11),29.9(C-12),86.3(C-13),44.1(C-14),32.8(C-15),76.8(C-16),47.7(C-17),49.9(C-18),33.8(C-19),36.2(C-20),36.4(C-21),31.8(C-22),23.6(C-23),16.2(C-24),15.9(C-25),18.0(C-26),19.2(C-27),77.1(C-28),27.6(C-29),207.5(C-30),107.4(Ara-C-1),72.4(Ara-C-2),74.1(Ara-C-3),68.9(Ara-C-4),66.1(Ara-C-5);HR-ESI-MS m/z627.3854[M+Na]+(calcd.for C35H56O8Na,627.3867).
实施例7、新化合物Psychotrianosides A~F和天然产物PsychotrianosidesG的制备
（1）Psychotrianosides A（1）和Psychotrianosides G（7）的制备
按照“实施例5”得到山大颜提取物即正丁醇部位。正丁醇部位（10g）进行大孔树脂分离，乙醇/水体系梯度洗脱（100ml为一个流份进行收集），在VEtOH/VH2O=85:15流份合并，减压回收溶剂，得固体1.5g。此固体经ODS再次纯化，甲醇/水体系梯度洗脱，TLC追踪合并。
VMeOH/VH2O=75:25流份合并，减压除去溶剂，乙酸乙酯/乙醇（2:8）反复重结晶，得Psychotrianosides A（300mg），纯度检验达98.5%。
VMeOH/VH2O=80:20流份合并，减压除去溶剂，乙酸乙酯/乙醇（2:8）反复重结晶，得Psychotrianosides A（800mg），纯度检验达98.5%。
（2）Psychotrianosides B（2）和Psychotrianosides C（3）的制备
按照“实施例5”得到山大颜提取物即正丁醇部位。正丁醇部位（10g）进行大孔树脂分离，乙醇/水体系梯度洗脱（100ml为一个流份进行收集），TLC追踪合并，在VEtOH/VH2O=75:25流份合并，减压回收溶剂，得固体3.0g。此固体经反相ODS再次纯化分离，甲醇/水体系梯度洗脱，TLC追踪合并。
在VMeOH/VH2O=70:30流份合并，乙醇反复重结晶3次，得Psychotrianosides B（1.8g），纯度检验达95.8%。
在VMeOH/VH2O=65:35流份合并，乙醇反复重结晶3次，得Psychotrianosides C（50mg），纯度检验达95.8%。
（3）Psychotrianosides D（4）、Psychotrianosides E（5）和Psychotrianosides F（6）的制备
按照“实施例5”得到山大颜提取物即正丁醇部位。正丁醇部位（10g）进行大孔树脂分离，乙醇/水体系梯度洗脱（100ml为一个流份进行收集），TLC追踪合并，在VEtOH/VH2O=60:40流份合并，减压回收溶剂，得固体2.0g。此固体经反相C18进一步纯化，甲醇/水体系梯度洗脱，TLC追踪合并。
在VMeOH/VH2O=45:55流份合并，乙醇反复重结晶3次，得Psychotrianosides D（50mg），纯度检验达96.0%。
在VMeOH/VH2O=50:50流份合并，乙醇反复重结晶3次，得Psychotrianosides E（30mg），纯度检验达97.0%。
在VMeOH/VH2O=55:45流份合并，乙醇反复重结晶3次，得Psychotrianosides F（60mg），纯度检验达95.8%。
实施例8、山大颜提取物中三萜皂苷的HPLC检测方法
Psychotrianosides A~G(1~7)七个三萜皂苷为本发明山大颜总三萜皂苷的主要有效成分，可以作为质量控制的指标成分。按重量百分比计，山大颜中总三萜皂苷的含量高达20-90%。采用高效液相色谱法（HPLC-ELSD）进行分析。具体如下：
检测样品前处理：
山大颜提取物（实施例1~5方法制得）用甲醇溶解定溶至1mg/mL，备用（简称制备液）。取山大颜提取物制备液2mL于磨口塞试管中，挥干溶剂。加入0.4mL5%香草醛—冰醋酸、0.6mL高氯酸混匀，60℃水浴加热15min，冷却，用冰醋酸稀释至10ml，用于检测总三萜皂苷含量。取山大颜提取物制备液1.5mL用于与单体三萜皂 苷对照使用。
单体三萜皂苷按照1mg/mL制备测试液，备用。
样品测试：
山大颜提取物中总三萜皂苷检测：采用HPLC-PAD检测，色谱柱为Kromasil 100-5-18-C18柱（10x250mm,5μm），流动相为甲乙腈-水溶液(80:20)，流速0.8ml/min，柱温35℃，采用SHIMADZULC-20AT泵，SHIMADZU SIL-20A自动进样器，SPD-M20A（190nm-800nm，氘灯和钨灯同时检测）检测器，全波长扫描。选定365、436、530nm检测，出峰时间15.80、23.50、7.89min。
三萜皂苷单体及单体在总皂苷中含量检测：采用高效液相色谱法（HPLC-ELSD）进行分析，色谱柱为Kromasil100-5-18-C18柱（10x250mm,5μm），流动相为甲乙腈-水溶液(80:20)，流速0.8ml/min，柱温50℃，采用SHIMADZU LC-20AT泵，SHIMADZU SIL-20A自动进样器，通微上海ELSD-UM3000蒸发光检测器，ELSD检测器漂移管和LTA温度设置为75℃，空气流速为2.5L/min，喷雾器体压力为3.50MPa。三萜皂苷单体Psychotrianosides A~G(1~7)的保留时间分别为15.95、12.70、23.40、19.60、16.35、18.60、20.90min。山大颜提取物中与单体样品进行对照，按照峰面积比计算得出提取物中7个单体样品的百分含量。
实施例9、山大颜提取物及其主要成分（Psychotrianosides A~G）对肿瘤细胞的增殖抑制作用
试验用测试样品山大颜提取物按照“实施例1至实施例5”制得的提取物为检测对象；主要单体成分按照实施例6中得到的单体化合物进行肿瘤细胞活性的测试。
试验方法：复苏细胞（NCI-N87、A549、Lovo、CNE-2、DU145、 KB、MDA-MB-231、HepG2、HepG2/ADM、MCF-7、MCF-7/ADR），待细胞处于对数生长期，用0.25%胰酶消化，计数，调整细胞数目为1×106/mL并接种于96孔培养板中，每孔100μL，于37℃、5%CO2培养箱中孵育24小时后，加入不同浓度的山大颜提取物及其主要成分，设空白对照组，继续培养24小时后，每孔加入30μLMTT（5mg/mL）溶液，再培养4小时，去除上清，每孔加入100μLDMSO溶解反应产物，运用Thermo Multiskan MK3酶标仪于570nm处检测各孔OD值。平行实验重复三次。
按如下公式计算细胞生长抑制率：
抑制率（%）=（1－加药组OD值／对照组OD值）×100%
以样品浓度为横坐标，以细胞生长抑制率为纵坐标绘制曲线。根据该曲线，计算出半数有效抑制浓度IC50值。
试验结果：山大颜提取物及其主要成分对多种肿瘤细胞及其耐药株的增殖均具有显著抑制作用（表1和表2）。
表1MTT法测定山大颜提取物对肿瘤细胞的生长抑制作用（n=3）
表2MTT法测定山大颜提取物主要成分对肿瘤细胞的生长抑制作用（n=3）
实施例10、山大颜提取物及Psychotrianosides B急性毒性试验
试验用山大颜提取物来自于“实施例1至实施例5”制备所得；Psychotrianosides B主要来源于实施例6中制备所得。
试验方法：取体重18-22g的昆明种小鼠（购自广东省动物中心），随机分组，10只／组，灌胃给药不同剂量的山大颜提取物及Psychotrianosides B，根据小鼠存活情况，计算半数致死剂量LD50。
按如下公式计算半数致死量：
半数致死剂量（mg/kg）=一半小鼠死亡时的剂量／对应小鼠的体重
试验结果：结果表明，山大颜提取物及Psychotrianosides B在5g/kg的给药剂量下，未观察到小鼠的死亡，说明山大颜提取物及Psychotrianosides B毒性较低。
实施例11、山大颜提取物及Psychotrianosides B体内抗肿瘤作用
试验用山大颜提取物来自于“实施例1至实施例5”制备所得；Psychotrianosides B主要来源于实施例6中制备所得。
试验方法：取体重18-22g的昆明种小鼠（购自广东省动物中心），随机分组，10只／组。分别在其右前肢腋下接种H22细胞1×107个，次日称量体重并灌胃给药，每天给药一次，连续给药12天，停药后次日，称量体重，处死动物，取瘤称重。
抑瘤率按如下公式计算：
抑瘤率（%）=（1－给药组平均瘤重／对照组平均瘤重）×100%统计分析采用t检验处理，p<0.05认为有显著性差异。
表3山大颜提取物及Psychotrianosides B对小鼠H22实体瘤生长的抑制作用（n=10）
与Control组相比，*P<0.05有显著性差异
试验结果：结果表明，山大颜提取物对小鼠H22移植瘤的生长有明显抑制作用。不同浓度给药组和对照组小鼠体重无明显差异，亦未见小鼠外观、进食、活动状态等方面异常，说明山大颜提取物的毒副作用较小。
实施例12、山大颜取物的胶囊剂的制备
把本发明山大颜提取物（实施例5）100g和微粉硅胶200g充分混合均匀，过筛，加入适量的硬脂酸镁，混匀，用干法造粒机制粒，过筛，筛取40-80目之间的颗粒，装入胶囊，每粒装0.3g。
实施例13、山大颜提取物的片剂的制备
把本发明山大颜提取物（实施例5）200g和微粉硅胶30g、羟丙纤维素120g混合均匀，用10％预胶化淀粉浆作为粘合剂，湿法造粒，烘干，加入适量的硬脂酸镁混合，压制成2000片片剂。
Claims (7)
1.一种山大颜提取物，其特征在于由如下方法制备而成：将山大颜经乙醇或甲醇加热回流或渗滤提取，减压浓缩得到浸膏，经大孔树脂富集，甲醇－水洗脱，得到山大颜提取物。
2.如权利要求1所述的山大颜提取物，其特征在于，所述醇的体积浓度是65~90%。
3.如权利要求1所述的山大颜提取物，其特征在于，所述山大颜提取物中总三萜皂苷的重量含量为20~90%。
4.如权利要求1所述的山大颜提取物，其特征在于，所述总三萜皂苷中含有13,28环氧特征的乌苏烷型结构Psychotrianosides A~G的混合物，Psychotrianosides A~G的混合物占总三萜皂苷质量的20-80%。
5.权利要求4所述Psychotrianosides A~G的制备方法，其特征包括以下步骤：山大颜经乙醇/水加热提取，减压浓缩得浸膏，浸膏加水搅拌，依次用有机溶剂萃取，正丁醇部位大孔树脂富集，乙醇/水洗脱，产物在经反相ODS分离纯化（甲醇/水洗脱）、重结晶后得到。
6.权利要求1或2或3或4所述山大颜提取物在制备治疗肿瘤药物或保健品中的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述肿瘤为胃癌、肝癌、肺癌、肠癌、鼻咽癌、乳腺癌、耐药型肝癌或耐药型乳腺癌。
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