CN111474273A - 九节木抗阿尔兹海默综合症活性部位的制备及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种九节木抗阿尔兹海默综合症活性部位的制备及检测方法，涉及植物药提取方法及其检测方法领域。其制备方法通过粉碎、溶解、提取、浓缩干燥等部分制备出具有抗阿尔兹海默综合症活性部位的九节木提取物。其检测方法通过将提取物功过溶解、层析、洗脱、干燥、定容、过滤、梯度洗脱的方法将其检测并得到相应的指纹图谱。本发明优化了九节木提取的工艺条件，从而确定九节木的最佳提取工艺，提高了九节木的抗阿尔兹海默症活性部位提取率，可进一步提高九节木的药理作用。同时解决目前九节木指纹图谱标准缺少的问题，为九节木药材质量提供一种检测标准。
Description
技术领域
本发明涉及植物药提取方法及其检测方法，具体涉及一种九节木抗阿尔兹海默综合症活性部位的制备及检测方法。
背景技术
茜草科九节属植物九节木(Psychotria rubra(Lour)Poir.))别名九节、山大颜、牛屎乌、大舟叶、刀伤木、青龙吐雾等，为一种传统中草药，在民间使用较为广泛，人们常用九节煎煮凉茶，作为日常的保健品。
九节木中含有挥发油类、皂苷类、甾体、萜类、鞣质、黄酮类等化合物，其根茎叶有抗炎抗菌的功效，可用于治疗肝炎、肠炎、痢疾等病(国家中医药管理局.中华本草(第6卷)[M].上海科学技术出版社,1999:466-467.)。
九节木叶有祛风除湿的功效，用于风湿骨痛、跌打骨折等，根有清热解毒的功效，可用于咽喉肿痛、感冒发烧、皮肤溃烂等(陈彬.九节木粉外敷治疗慢性皮肤溃疡32例[J].安徽中医学院学报,1994(03):41.)。
现代研究发现，九节具有缓解老年痴呆作用：乙醇提取物能增强模型小鼠的记忆，提高小鼠的血清SOD酶和ChAT酶的活力，可缓解老年痴呆症状(张金花,卢海啸,李家洲.山大颜抗老年痴呆作用的实验研究[J].中国药师,2011,14(03):365-366.)；九节乙酸乙酯部位和水部位可显著降低小鼠血清的LPO、MDA含量以及AChE酶活力，提高SOD酶活力，能抑制阿尔茨海默病模型小鼠脑中的乙酰胆碱酯酶的酶活力(卢海啸,勾玲,李典鹏.九节木的抗阿尔茨海默病活性部位筛选[J].玉林师范学院学报,2015,36(05):43-47.)。
另外，九节木具有抗肿瘤、抗真菌、增强免疫调节的作用，可抑制小鼠乳腺癌细胞周期，对KB细胞株具有很强的活性；九节木中的吡咯吲哚生物碱除了对生长激素的抑制素具有拮抗作用，还对血小板具有抗凝集活性；九节木挥发油对皮肤炎具有抗炎功效。
中药指纹图谱是指某种(或某地)中药材或中成药经适当处理后，采用一定的分析手段，得到的能够标示该中药材或中成药药物特性的共有峰的图谱。指纹图谱从中医整体观念和中药药效来自多种化学物质综合作用的观点出发，能够建立比较客观、整体和多指标的综合评价体系，并通过图谱的整体特征，能够比较全面地反映出中药所含化学成分的种类与数量，已经成为国际公认的控制评价中药和天然药物质量的有效手段。
中药是基于其多种化学成分发挥综合的治疗作用，具有整体性和模糊性的特点，若仅以单一或几种化学成分作为指标的传统中药质量评价方法，难以达到中药质量控制评价的目的。九节木化学成分复杂，涵盖为数众多的脂溶性成分和水溶性成分，各类化学成分性质、极性等差异极大，药材质量难以判定，但目前尚无九节成分的指纹图谱的研究报道，研究一种能够精确的判断药材质量的方法成为了亟待解决的问题。
发明内容
本发明针对上述现有技术存在的问题，本发明第一个目的是提供一种九节木抗阿尔兹海默综合症活性部位的制备方法。第二个目的是针对其制备方法所得的试样提供一种标准的检测方法。
为实现本发明的第一个目的，通过以下技术方案予以实现：
一种九节木抗阿尔兹海默综合症活性部位的制备方法，包括以下步骤：
取干燥的九节木的根部，粉碎后过筛，得干燥九节木根部粉末；
在所得粉末中加入甲醇溶解，其料液比为40-60:1g/ml；
加热，在80-90℃下提取1-2次，每次提取时间为100-150min，提取后过滤取，得提取液，浓缩干燥，得九节木含有抗阿尔兹海默症活性部位。
优选地，所述过筛中，使用的筛为大于等于50目筛。
优选地，所述甲醇的体积百分比为80％。
进一步优选地，所述粉末和甲醇的料液比为50:1g/ml。
更进一步优选地，所述提取的提取条件为：在80℃下提取2次，每次提取时间为120min。
为实现本发明的第二个目的，通过以下技术方案予以实现：
一种九节木抗阿尔兹海默综合症活性部位的检测方法，包括以下步骤：
(1)活性部位的提取：取干燥的九节木的根部，粉碎后过筛，得干燥九节木根部粉末；在所得粉末中加入甲醇，其料液比为40-60:1g/ml，加热，在80-90℃下提取1-2次，每次提取时间为100-150min，提取后过滤，得提取液，浓缩干燥，得九节木抗阿尔兹海默症活性部位；
(2)供试品溶液制备：称取九节木抗阿尔兹海默症活性部位，用纯化水溶解后流动上大孔树脂层析柱，依次用纯化水和含水甲醇洗脱；将纯化水洗脱液与含水甲醇洗脱液合并浓缩至干燥，再用纯化水溶解，定容并过滤，所得滤液为供试品溶液；
(3)供试品溶液的测定：吸取所述供试品溶液注入高效液相色谱仪，梯度洗脱进行测定，得到九节木的指纹图谱；
其中，高效液相色谱的色谱条件为：色谱柱的填料为十八烷基硅烷键合硅胶；流动相A为乙腈，流动相B为磷酸水溶液，流动相中A与B的体积比随时间逐渐增加；检测波长为220～240nm；梯度洗脱程序如下：
0-5min时，流动相A:流动相B＝4％:96％
5-7min时，流动相A:流动相B＝10％:90％
7-27min时，流动相A:流动相B＝15％:85％
27-35min时，流动相A:流动相B＝75％:25％
35-42min时，流动相A:流动相B＝100％:0％。
优选地，所述步骤(2)中，九节木提取物与纯化水的比例为1g:100ml；九节木提取物与含水甲醇的比例为1g:300ml；含水甲醇的体积百分比为50％。
优选地，所述步骤(2)中，大孔树脂为D101大孔树脂；定容为定容至2mL容量瓶中；过滤使用0.45μm微孔滤头。
优选地，所述步骤(3)中，色谱柱为Kromasil C18分析柱,4.6mm×250mm,5μm；流动相B为0.4％磷酸水溶液；所述梯度洗脱时间为44分钟，流速1mL·min-1，进样量10μl，检测波长232nm。
本发明的积极效果如下：
(1)本发明优化了九节木提取的工艺条件，从而确定九节木的最佳提取工艺，为提高九节木的抗阿尔兹海默症活性部位提取率研究提供科学依据，又可进一步提高九节木的药理作用。同时解决目前九节木指纹图谱标准缺少的问题，为九节木药材质量提供一种检测标准。
(2)采用一测多评法同时鉴定及测定九节木的抗阿尔兹海默症活性部位，有效地全面监控九节木药材质量、监控生产工艺的稳定性，保证其质量的稳定、均一、可控、有效的避免了九节木药材伪品，保证九节木药材生产流通秩序。
附图说明
图1为实施例4建立的10批九节木HPLC的色谱图；
图2为实施例4样品的HPLC色谱图；
图3为实施例4九节木根的相似度。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。其中，附图仅用于示例性说明，表示的仅是示意图，而非实物图，不能理解为对本专利的限制。
实施例1九节木抗阿尔兹海默症活性部位制备方法
取干燥的九节木根，粉碎后过50目筛，然后加入80％体积百分比甲醇，每次加入的料液比为40:1g/ml，然后加热至90℃下提取2次，每次提取时间为100min，过滤后，浓缩干燥.即可得到含有抗阿尔兹海默症活性部位的九节木提取物。
实施例2九节木抗阿尔兹海默症活性部位制备方法
取干燥的九节木根，粉碎后过50目筛，然后加入80％体积百分比甲醇，每次加入的料液比为60:1g/ml，然后加热至90℃下提取1次，每次提取时间为150min，过滤后，浓缩干燥.即可得到含有抗阿尔兹海默症活性部位的九节木提取物。
实施例3九节木抗阿尔兹海默症活性部位制备方法
取干燥的九节木根，粉碎后过50目筛，然后加入80％体积百分比甲醇，每次加入的料液比为50:1g/ml，然后加热至80℃下提取2次，每次提取时间为120min，过滤后，浓缩干燥.即可得到含有抗阿尔兹海默症活性部位的九节木提取物。
实施例4九节木抗阿尔兹海默症活性部位HPLC指纹图谱建立和验证：
4.1实验材料
4.1.1仪器
4.1.2试药与试剂
4.1.3实验材料
4.1.4药材
本实验所用的材料均采自广西各地，经鉴定为茜草科九节属植物九节Psychotriarubra(Lour.)Poir的样品。标取其根部洗净、砍碎、晒干、粉碎、过筛，其具体过程为实施例1中所记载的方法。
药材来源如下表。
九节木药材来源
4.2实验方法
4.2.1色谱条件
色谱柱：Kromasil C18分析柱(4.6mm×250mm,5μm)，流动相：A：乙腈；B：0.4％磷酸水溶液；梯度洗脱44分钟，流速1mL.min-1，进样量10μm，检测波长：232nm。进行HPLC分析，色谱条件如下表。
梯度洗脱表
4.2.2溶液配制
供试品溶液制备：精密称取2g九节木提取物，用少量的纯化水溶解后流动上样，用纯化水200mL洗脱D101大孔树脂，接着用50％甲醇300mL洗脱，最后用无水甲醇300mL洗脱，将纯化水洗脱液与50％甲醇洗脱液合并浓缩至干燥，纯化水溶解，定容至2mL容量瓶中，0.45μm微孔滤头过滤即得。
4.2.3共有指纹峰的标定
对10批九节木进行指纹图谱分析，将10个产地的九节木指纹图谱匹配后共有29个共有峰，其中图谱中的27号共有峰的峰面积最大，而且较为稳定，因此选定27号为参考峰。其他的共有峰相对保留时间分别是是1号(0.18±0.41％)、2号(0.22±0.75％)、3号(0.24±1.0％)、4号(0.25±0.05％)、5号(0.24±0.48％))、6号(0.37±0.42％)、7号(0.38±0.73％)、8号(0.40±1.9％)、9号(0.43±1.4％)、10号(0.45±0.77％)、11号(0.48±0.95％)、12号(0.48±0.37％)、13号(0.49±0.90％)、14号(0.50±0.46％)、15号(0.51±0.50％)、16号(0.52±0.45％)、17号(0.54±1.1％)、18号(0.55±0.55％)、19号(0.58±0.74％)、20号(0.60±0.69％)、21号(0.62±0.47％)、22号(0.70±2.8％)、23号(0.77±2.1％)、24号(0.84±2.4％)、25号(0.93±0.10％)、26号(0.97±0.13％)、28号(1.05±0.10％)、29号(1.08±0.03％)。
具体如下表所示：
九节木HPLC指纹图谱相对保留时间表1
九节木HPLC指纹图谱相对保留时间表2
九节木HPLC指纹图谱相对保留时间表3
九节木HPLC指纹图谱相对保留时间表4
九节木HPLC指纹图谱相对保留时间表5
九节木HPLC指纹图谱相对保留时间表6
上表中，横向标题为共有峰序号，纵向标题为批号。
4.2.4方法学考察
4.2.4.1精密度试验
取同一供试品溶液，按“4.2.1”项下的色谱条件进行连续测定6次，记录色谱图并积分，测得的各个主要色谱峰，计算结果显示各主要色谱峰的相对保留时间RSD<1％，相对峰面积RSD<2.5％，相似度均在0.991以上，说明该方法精密度好。
4.2.4.2稳定性试验
取同一批次供试品溶液，按“4.2.1”项的色谱条件分别在0、2、4、8、12、24h进样检测，记录色谱图并积分，计算结果显示各个主要色谱峰的相对保留时间RSD<1％，相对峰面积RSD<2.3％，相似度均在0.854以上，说明供试品溶液在24h内稳定。取同一批次供试品溶液，分别在连续5天内同一时间进样检测，各个主要色谱峰的相对保留时间RSD<1％，相对峰面积RSD<2.7％，相似度均在0.882以上，说明该方法稳定性好。
4.2.4.3重现性试验
取同一批次供试品粉末6份，按“4.2.2”制备，再按“2.1”项进行测定，结果表明各个色谱峰的相对保留时间RSD<1％，相对峰面积的RSD<3.1％，相似度均在0.972以上，表明分析方法重现性良好。
4.2.5共有指纹峰的相对面积
根据《中药注射剂指纹图谱的研究技术要求(暂行)》的规定：中药材指纹色谱图中，单峰面积占总峰面积大于或等于20％的共有峰，其差值不得大于±20％；单峰面积占总峰面积大于或等于10％，而小于20％的共有峰，其差值不得大于±25％；单峰面积占总峰面积小于10％的共有峰，峰面积比值不作要求，但必须标定相对保留时间。
在九节木指纹图谱中，只有27号共有峰面积大于20％，其余的28个共有峰的峰面积占总峰面积均小于10％峰面积比值不做要求。10批九节木的29个共有峰相对保留面积RSD在13.85％～86.47％。
4.2.6统计方法
将10个不同产地的九节木按照供试品溶液的制备方法制备成供试品溶液，按照上述的“2.1”项色谱条件进样分析，记录指纹图谱。得到的HPLC指纹图谱AIA数据文件导入中药指纹图谱相似度计算软件(A版)，采用多点校正，自动匹配生成九节木根对照指纹图谱作为模版，进行相似度计算。
4.3结果分析
实验结果见图1、2、3和下表。本实验测定了10个不同产地的九节木样品，结果可分辨认出29个共有峰。从图1、图2可以看出，各个色谱峰的分离度较好，色谱峰分布也较均匀，出峰较多的时间段主要集中在11min～27min。可以将29个色谱峰分为3个区：1～4号峰为Ⅰ区，(保留时间Rt大约在5min～9min，以27号峰保留时间为1，则此区的相对保留时间约为0.175～0.250)；5～24号峰为Ⅱ区，(保留时间Rt大约在11min～28min，则此区的相对保留时间约为0.348～0.847)，,25～29号峰为Ⅲ区，(保留时间Rt大约在30min～36min，则此区的相对保留时间约为0.928～1.091)，九节木样品的指纹图谱和相似度结果显示这10批九节木样品的相似度均在0.922(与对照相比)以上，相似度极高。
九节木根的相似度结果
根据上述实验结果可知，本发明所得到的九节木指纹图谱精密度好，稳定性高，重现性良好；且各个色谱峰的分离度较好，色谱峰分布也较均匀，相似度极高。为九节木的药材质量提供一个标准的测试方法。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种九节木抗阿尔兹海默综合症活性部位的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
取干燥的九节木的根部，粉碎后过筛，得干燥九节木根部粉末；
在所得粉末中加入甲醇溶解，其料液比为40-60:1g/ml；
加热，在80-90℃下提取1-2次，每次提取时间为100-150min，提取后过滤取，得提取液，浓缩干燥，得九节木含有抗阿尔兹海默症活性部位。
2.根据权利要求1所述的九节木抗阿尔兹海默综合症活性部位的制备方法，其特征在于：所述过筛中，使用的筛为大于等于50目筛。
3.根据权利要求1所述的九节木抗阿尔兹海默综合症活性部位的制备方法，其特征在于：所述甲醇的体积百分比为80％。
4.根据权利要求3所述的九节木抗阿尔兹海默综合症活性部位的制备方法，其特征在于：所述粉末和甲醇的料液比为50:1g/ml。
5.根据权利要求1-4任一所述的九节木抗阿尔兹海默综合症活性部位的制备方法，其特征在于：所述提取的提取条件为：在80℃下提取2次，每次提取时间为120min。
6.一种九节木抗阿尔兹海默综合症活性部位的检测方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)活性部位的提取：取干燥的九节木的根部，粉碎后过筛，得干燥九节木根部粉末；在所得粉末中加入甲醇，其料液比为40-60:1g/ml，加热，在80-90℃下提取1-2次，每次提取时间为100-150min，提取后过滤，得提取液，浓缩干燥，得九节木抗阿尔兹海默症活性部位；
(2)供试品溶液制备：称取九节木抗阿尔兹海默症活性部位，用纯化水溶解后流动上大孔树脂层析柱，依次用纯化水和含水甲醇洗脱；将纯化水洗脱液与含水甲醇洗脱液合并浓缩至干燥，再用纯化水溶解，定容并过滤，所得滤液为供试品溶液；
(3)供试品溶液的测定：吸取所述供试品溶液注入高效液相色谱仪，梯度洗脱进行测定，得到九节木的指纹图谱；
其中，高效液相色谱的色谱条件为：色谱柱的填料为十八烷基硅烷键合硅胶；流动相A为乙腈，流动相B为磷酸水溶液，流动相中A与B的体积比随时间逐渐增加；检测波长为220～240nm；梯度洗脱程序如下：
0-5min时，流动相A:流动相B＝4％:96％
5-7min时，流动相A:流动相B＝10％:90％
7-27min时，流动相A:流动相B＝15％:85％
27-35min时，流动相A:流动相B＝75％:25％
35-42min时，流动相A:流动相B＝100％:0％。
7.根据权利要求6所述的九节木抗阿尔兹海默综合症活性部位的检测方法，其特征在于:所述步骤(2)中，九节木提取物与纯化水的比例为1g:100ml；九节木提取物与含水甲醇的比例为1g:300ml；含水甲醇的体积百分比为50％。
8.根据权利要求6所述的九节木抗阿尔兹海默综合症活性部位的检测方法，其特征在于:所述步骤(2)中，大孔树脂为D101大孔树脂；定容为定容至2mL容量瓶中；过滤使用0.45μm微孔滤头。
9.根据权利要求6所述的九节木抗阿尔兹海默综合症活性部位的检测方法，其特征在于:
所述步骤(3)中，色谱柱为Kromasil C18分析柱,4.6mm×250mm,5μm；流动相B为0.4％磷酸水溶液；所述梯度洗脱时间为44分钟，流速1mL·min-1，进样量10μl，检测波长232nm。
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