CN111323496A - Hplc检测管萼山豆根中4种生物碱含量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明建立HPLC法同时测定管萼山豆根中苦参碱，金雀花碱、氧化苦参碱、N‑甲酰基金雀花碱4种生物碱的方法，采用Boston Green ODS PC₁₈(4.6*250mm,5μm)柱，乙腈‑0.2％磷酸(含0.01％三乙胺)为流动相，流速0.8mL/min，检测波长220nm，柱温30℃。建立的HPLC方法简便、快速，重现性良好，适合该药材生物碱的定量测定，为药材选择与质量控制提供一种简单有效的方法。

Description

HPLC检测管萼山豆根中4种生物碱含量的方法

所属技术领域

本发明涉及一种HPLC检测管萼山豆根中4种生物碱含量的方法，属于检测技术领域。

背景技术

管萼山豆根(Euchresta tubulosa Dunn)是豆科山豆根属植物，又名鄂豆根、胡豆莲、豆根、鸦片七(湘西地区)，民间习用根茎，利咽喉，治腹胀、腹痛，主要产自湖北西北、湖南、四川。山豆根属植物性苦寒，具有较强的清热、镇痛、消炎和抗癌等作用，对治疗咽喉痛、牙痛、胃腹痛、毒虫咬伤等有良好疗效。在武陵山区的土家族将管萼山豆根誉“信誉极高的民族药”，同属植物山豆根(E.japonica Hook.f.ex Regel)在日本民间用于抗癌、抗心律不齐、消炎和治疗溃疡。尹玉琴等研究发现，管萼山豆根总生物碱也具有镇静、镇痛及降温等中枢系统抑制作用，目前尚未见有关管萼山豆根中生物碱类化合物的含量测定报道，我们已经从管萼山豆根茎中分离得到苦参碱，金雀花碱、氧化苦参碱、N-甲酰基金雀花碱。

发明内容

本发明通过建立HPLC法同时测定4种生物碱的含量，为今后该药材及同属药材选择和评价提供依据。

一种HPLC检测管萼山豆根中4种生物碱含量的方法，包括以下步骤：

(1)生物碱提取：管萼山豆根根、茎、叶于50℃烘干后粉碎,过30目筛，加入纯净水，其中加入水量L与管萼山豆根重量kg比1:25-350，超声20-40min后，75-85℃回流提取2h，提取后滤纸过滤1次，加水定容至1500mL，作为生物碱样品溶液；

(2)HPLC检测：色谱柱为Boston Green ODS PC18(4.6*250mm，5μm)柱，流动相为乙腈-0.2％磷酸水溶液，流速0.8mL/min，柱温30℃，检测波长220nm，进样量10μL，其中乙腈与0.2％磷酸水溶液的体积L比为0.04:0.76。

所述0.2％磷酸水溶液中优选含有0.01％三乙胺的0.2％磷酸水溶液。

技术效果

1、本发明方法可以快速检测管萼山豆根根、茎、叶中苦参碱，金雀花碱、氧化苦参碱、 N-甲酰基金雀花碱这四种生物碱。

2、节省时间、提高效率，为今后该药材及同属药材选择和评价提供依据。

附图说明

图1对照品及样品HPLC：a—对照品图谱；b—样品图谱(茎的水提物)；0溶剂峰，1金雀花碱，2苦参碱，3氧化苦参碱，4N-甲酰基金雀花碱；

图2苦参碱的含量对比图；

图3氧化苦参碱的含量对比图；

图4金雀花碱的含量对比图；

图5 N-甲酰基-金雀花碱的含量对比图；

图6管萼山豆根根、茎、叶中几种生物碱的含量对比图。

具体实施方式

下面，本发明将用实施例进行进一步的说明，但是它并不限于这些实施例的任一个或类似实例。

实施例1

1供试溶液的制备分别称取管萼山豆根根、茎、叶样品各9份，每份5g，分别加入纯净水，95％乙醇，pH＝2 的稀酸水(各组平行3份)，液料比1:30，超声20min后，80℃回流提取2h。提取后过滤，加水定容至150mL(酸水提取液预先用氨水调节碱性pH＝7)，分别取各样品适量，稀释10倍，作为供试品溶液。

2对照品溶液的制备

分别称取4种生物碱1～4对照品:5.5、5.2、5.4与5.4mg，置于10mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度线，配制成0.500mg/mL的对照品储备溶液。分别精密量取各储备液适量，配成混合对照品溶液(a)：苦参碱，、金雀花碱、氧化苦参碱、N–甲酰基金雀花碱浓度为 0.1mg/mL，用于条件摸索。预实验表明，供试液中苦参碱浓度在0.001～0.01mg/mL之间，其它3种在0.01～0.1mg/mL之间，因此绘制标准曲线所用混合对照品溶液(b)苦参碱浓度调整为0.01mg/mL，其它3种生物碱浓度为0.1mg/mL。分别吸取混合对照品溶液(b)1、2、4、 6、8mL置于10mL容量瓶，加甲醇定容至刻度线，配置成不同浓度梯度的对照品溶液。

3色谱条件

通过多次调整流动相比例和峰形观察，HPLC确定同时测定4种生物碱的条件为：Boston Green ODS PC18(4.6*250mm，5μm)柱，流动相为乙腈-0.2％磷酸(含0.01％三乙胺)(比例： 0.04:0.76)，流速0.8mL/min，柱温30℃，检测波长220nm，进样量10μL。混合对照品溶液(a)HPLC图，样品图(以管萼山豆根茎的水提物图谱为例)见图1，结果表明该方法的系统适用性良好。

4含量测定方法的建立

4.1线性范围考察

采用2.3项下的色谱条件，相应对照品的浓度(mg/mL)为横坐标(X)，以峰面积为纵坐标(Y)绘制标准曲线，进行线性回归分析，结果见表1。相关系数(r)均大于0.999，表明4种生物碱在相应质量浓度范围内线性关系良好。

表1各成分的回归方程，相关系数(r)及线性范围

Table 1Linear regression equations,corrrelation coefficientsandlinear ranges of every constituents

4.2精密度试验^[8]取混合对照品溶液(b)，按2.3项下色谱条件重复进样6次，计算得峰面积的RSD分别为1.87％、1.51％、2.38％、2.12％，表明精密度良好。

4.3重复性试验^[9]精密取管萼山豆根的茎样品6份，按2.1项下的方法制备管萼山豆根茎的水提物供试品溶液，按上述色谱条件进样分析，分别计算4种生物碱的平均质量分数和 RSD，分别为：2.38％、1.58％、2.01％、0.93％，表明该方法重复性较好。

4.4稳定性试验取管萼山豆根茎的水提物供试品溶液，分别于制备后的0、2、4、6、9、 12h进样测定，分别记录4种生物碱的峰面积，求平均值并计算得RSD，分别为：1.01％、1.35％、1.61％、2.19％，表明样品在12h内稳定。

4.5加样回收率试验^[10]精密量取4种生物碱含量已知的管萼山豆根茎样品，准确添加一定浓度的对照品溶液，按样品制备方法操作，测定并计算平均回收率和RSD值，4种生物碱的平均回收率分别为：99.09％、99.50％、98.83％、99.44％，RSD小于2.1％。

5生物碱组分的含量测定及结果分析

按2.3项下的HPLC的方法检测管萼山豆根的根、茎、叶中生物碱，根据标准曲线计算原料中生物碱的含量，并比较不同提取方法的提取率。

5.1各生物碱在根、茎、叶中含量及提取方法对比

各生物碱组分在不营养同器官中的含量及提取方法对比如图2～5。

由图2可以看出，叶中苦参碱的含量最高，约为3.4mg/g，其次是根和茎，分别为2.0mg/g 与1.6mg/g。比较三种溶剂提取效果可以看出，在根、茎、叶中，水煎法均最有利于苦参碱的浸出。

由图3可以看出，根中氧化苦参碱含量最高，约为22.67mg/g，其次是茎(11.93mg/g)，叶中含量最少，仅3.52mg/g。三种提取溶剂提取对氧化苦参碱提取率的浸出影响不明显，酸水提取有利于根中氧化苦参碱的浸出，醇提取叶和茎中氧化苦参碱效果较好。

由图4可以看出，茎中金雀花碱的含量最高，其次是根，而叶中含量最少，三种提取溶剂中，醇的提取率最低，不足其他两种溶剂的50％，因此金雀花碱采用水或酸水法更容易提取得到。

由图5可以看出，根中N-甲酰基金雀花碱的含量最高，其次是茎，叶中含量仍然最少。三种提取方法比较来看，水煎法提取最好，酸水提取次之，醇不利于该生物碱的浸出，约为其他两种方法提取率的20％。

5.2管萼山豆根各营养器官(根、茎、叶)中生物碱的含量比较

不同提取方法提取管萼山豆根根、茎、叶中的生物碱，各化合物的含量对比见图6。由图6可以看出，除叶中苦参碱和氧化苦参碱的含量相当外，根、茎、叶中中几种生物碱含量高低顺序为：金雀花碱>N-甲酰基-金雀花碱>氧化苦参碱>苦参碱，基本具有一致性。其中4种生物碱总含量高低顺序为：根(86.78mg/g)>茎(77.22mg/g)>叶(22.68mg/g)。

Claims (2)

1.一种HPLC检测管萼山豆根中4种生物碱含量的方法，包括以下步骤：

(1)生物碱提取：管萼山豆根根、茎、叶于50℃烘干后粉碎,过30目筛，加入纯净水，其中加入水量L与管萼山豆根重量kg比1:25-350，超声20-40min后，75-85℃回流提取2h，提取后滤纸过滤1次，加水定容至1500mL，作为生物碱样品溶液；

(2)HPLC检测：色谱柱为Boston Green ODS PC₁₈柱，流动相为乙腈-0.2％磷酸水溶液，流速0.8mL/min，柱温30℃，检测波长220nm，进样量10μL，其中乙腈与0.2％磷酸水溶液的体积L比为0.04:0.76。

2.根据权利要求1的方法，所述0.2％磷酸水溶液中优选含有0.01％三乙胺的0.2％磷酸水溶液。

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