CN115032287A - 一种四氢大麻酚、大麻二酚的定量分析方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种四氢大麻酚、大麻二酚的定量分析方法。本发明的分析方法包括如下步骤：将待测样品注入气相色谱，经程序升温，采用外标法检测得到大麻二酚和/或四氢大麻酚的总含量；其中，所述气相色谱的进样口温度为200～300℃；所述的经程序升温为从150℃升至280℃；所述的经程序升温的升温速率为10～30℃/min。本发明分析方法可简便准确检测大麻花叶原料或提取物中可利用的THC、CBD总量。其一，无需对待测样品进行特别预处理，只需采用一定有机溶剂达到对待测样品中大麻素类成分完全有效提取和简单过滤即可；其二，无需使用THCA和CBDA对照品，就可实现对THC、CBD实际总量进行检测；其三，定量检测分析结果准确可靠。

Description

一种四氢大麻酚、大麻二酚的定量分析方法

技术领域

本发明涉及一种四氢大麻酚、大麻二酚的定量分析方法。

背景技术

大麻Cannabis sativa L.为桑科大麻属一年生草本植物，在世界各地均有野生或栽培，药用历史悠久，中医里的“火麻仁”即为大麻去壳后的种仁，一些传统医学包括中国古代的大麻入药部位还包括麻籽、雌花序(大麻植物中大麻素类成分含量最高的部位)等。

大麻花叶中含有丰富的大麻素类生物活性物质，迄今已从不同大麻植株中分离鉴定百余种大麻素类化合物，其中最广为人知的是四氢大麻酚(即 THC)和大麻二酚(即CBD)。

然而，目前国家和地方对工业大麻花叶原料或提取物(包括制成品)中实际THC和CBD总量尚无简便有效的分析方法。

大麻植物体内THCA和CBDA(大麻二酚酸)分别为THC和CBD的生物合成前体，在一定条件下脱羧转化为THC和CBD，因此采收的大麻花叶原料一般都含有不同比例的THCA和CBDA。

目前对大麻花叶原料中大麻素类化合物的含量测定方法均为液相色谱法。刘胜贵等人在专利“一种工业大麻花叶中CBD和THC含量的测定方法 (CN 110780003 A)”中，将干燥后的大麻花叶粉碎，用甲醇进行超声提取，采用高效液相色谱法以外标法定量检测待测液中大麻二酚及四氢大麻酚的含量。该法仅测定了大麻二酚和四氢大麻酚的含量，未能同时对大麻二酚酸和四氢大麻酚酸进行含量测定。赵立宁等人在专利“CBD、CBDA、THC中一种或几种物质的定性定量检测方法(CN 109725080 A)”中，将粉碎后的大麻花叶用甲醇进行超声提取，采用高效液相色谱法以乙酸水溶液和乙腈的混合物为流动相等度洗脱，外标法检测大麻二酚、大麻二酚酸、四氢大麻酚中一种或几种物质的含量，但未能同时检测其中四氢大麻酚酸的含量。

以上方法均无法实现对大麻植物或提取物(包括制成品)中实际含有的 THC、CBD总量的准确定量分析。与此同时，THCA和CBDA对照品制备难度较大，获得较为困难，采用液相色谱法同时测定植物中THCA和THC、 CBDA和CBD以准确描述植物中可利用的THC和CBD总量的方法，实际操作受到较大程度制约。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术中缺少对大麻花叶中四氢大麻酚(THC)和大麻二酚(CBD)总量的测定方法，本发明提供一种四氢大麻酚、大麻二酚的定量分析方法。

本发明提供一种四氢大麻酚、大麻二酚的定量分析方法，其包括如下步骤：将待测样品注入气相色谱，经程序升温，采用外标法检测得到大麻二酚和/或四氢大麻酚的总含量；其中，所述的经程序升温为从150℃升至280℃；所述的经程序升温的升温速率为10～30℃/min。

本发明中，较佳地，所述气相色谱的进样口温度为200～300℃。

当所述气相色谱的进样口温度为200～300℃时，大麻二酚的总含量的定义为待测样品内大麻二酚和大麻二酚酸的含量；四氢大麻酚的总含量为四氢大麻酚和四氢大麻酚酸的含量。

本发明中，较佳地，所述的程序升温可为40min内从150℃升至280℃。

本发明中，较佳地，所述的程序升温分为第一阶段升温和第二阶段升温。

其中，较佳地，所述的第一阶段升温可为温度由150℃升至195℃。

其中，较佳地，所述的第一阶段升温的升温速率可为10℃/min。

其中，较佳地，所述的第二阶段升温可为温度由195℃升至280℃。

其中，较佳地，所述的第二阶段升温的升温速率可为30℃/min。

其中，较佳地，所述的程序升温中，所述的第一阶段升温结束后柱温保持10～20min，例如18min。

本发明中，所述的气相色谱的检测器的温度可为200～300℃。

本发明中，所述的气相色谱中，氢气流量可为35～45mL/min。

本发明中，所述的气相色谱中，空气流量可为350～450mL/min。

本发明中，较佳地，所述的进样口温度可为250～300℃。

本发明中，所述的待测样品可以为大麻花叶原料提取物或含大麻二酚、大麻二酚酸、四氢大麻酚和四氢大麻酚酸的混合液。

本发明中，所述的气相色谱的色谱柱可为Agilent HP-5(0.320mm×30m， 0.25μm)。

本发明中，所述的待测样品的进样量可为1μL。

本发明中，所述的大麻花叶原料提取物的制备方法包括以下步骤：将粉碎后的大麻花叶采用有机溶剂进行超声提取。

本发明中，所述的有机溶剂为本领域常规的有机溶剂，所述的有机溶剂选自甲醇、丙酮、乙醚、环己烷、石油醚和乙酸乙酯中的一种或多种；优选为甲醇。

本发明中，所述的有机溶剂与所述的大麻花叶原料的体积质量比可为 50mL/g。

本发明中，所述的分析方法采用内标法或外标法。

本发明中，大麻花叶原料提取物的制备方法包括以下步骤：在室温下，将粉碎后的大麻花叶采用有机溶剂进行超声提取，经0.22μm微孔滤膜过滤，加入内标溶液正二十烷。

本发明中，较佳地，所述的经程序升温为从以10℃/min由150℃升至 195℃；保温18min，然后以30℃/min由195℃升至200℃；保温30min。

发明人在探究大麻花叶的分析方法发现，当气相色谱进样口的温度增加时，测定四氢大麻酚THC和大麻二酚CBD总量会增加。在此基础上，发明人查阅资料发现大麻二酚酸和四氢大麻酚酸在加热的条件下会转变为大麻二酚和四氢大麻酚。发明人在上述的研究的基础上进一步的开发了本发明的气相定量分析方法。

在不违背本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明中的室温一般为20-35℃。

除工业大麻花叶原料外，本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：

本发明发现大麻二酚酸和四氢大麻酚酸在通过气相色谱进样口时会脱羧转变为四氢大麻酚THC和大麻二酚CBD。本发明技术可简便准确检测大麻花叶原料或提取物(包括制成品)中可利用的THC、CBD总量。其一，无需对待测样品进行特别预处理，只需采用一定有机溶剂达到对待测样品中大麻素类成分完全有效提取和简单过滤即可；其二，无需使用THCA和 CBDA对照品，就可实现对THC、CBD实际总量进行检测；其三，定量检测分析结果准确可靠。因此，本发明所述方法操作简单、稳定、重现性好、检测效率高，具有较强实用性。

附图说明

图1为THC对照品的GC图；

图2为CBD对照品的GC图；

图3为实施例1对云南工业大麻花叶原料的GC图；

图4为实施例2对黑龙江工业大麻花叶原料的GC图。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

工业大麻花叶原料由云南翰谷生物科技有限公司和黑龙江省黑河市孙吴县科技局提供。

实施例1

准确称取云南工业大麻花叶粉末0.2g于锥形瓶中，加甲醇10mL，室温超声提取30分钟，放置至室温。加甲醇补足重量，摇匀，经0.22μm微孔滤膜过滤，得澄清透明滤液，内标为正二十烷，使得内标溶液的浓度为 0.12mg/mL。

标准品溶液的制备：大麻二酚和大麻二酚酸的标准品溶液购自美国Sigma公司，浓度为1mg/mL的四氢大麻酚标准品溶液用色谱纯甲醇稀释为 1μg/mL、4μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL、100μg/mL的系列对照品溶液，对照品溶液中同时加入内标，使得内标终浓度为10μg/mL，

大麻二酚酸(CBDA)自制对照品的制备方法：

取工业大麻花叶粉末1kg(其中大麻二酚酸的含量约为0.8％)，装填至 5升超临界萃取釜中，设置萃取釜的萃取温度为50℃，压力为35MPa，提取 90min，逐步调节分离釜的温度和压力收集温度为45℃、压力为7MPa条件下的初级提取物，为灰绿色半固体37g，HPLC纯度75.1％，其中，大麻二酚酸的含量为20％，分离萃取率为92.5％。

取粒径100μm的聚苯乙烯微球以丙酮-水浸泡充分，取150ml装柱，另取实施例3中透明油状初级提取物5g加适量丙酮溶解上样，采用50％丙酮- 水等度洗脱，收集CBDA集中的洗脱流份，减压回收溶剂，得到含量大于 90％的CBDA粗品，收率为79％，HPLC纯度为90％。

取制备得到的CBDA粗品0.33g加适量甲醇溶解，注入高效液相色谱仪，采用WatersSymmetry PrepC18半制备色谱柱(7.8×300mm，7μm)，流动相为乙腈-0.1％甲酸水溶液(68:32)，UV检测器波长210nm，收集CBDA 流出部分，减压回收溶剂并蒸干，即得CBDA纯品99％，共得纯品0.27g，收率为91％(85.3％)，HPLC纯度为99.5％。

大麻二酚(CBD)自制对照品的制备方法：制备方法参考大麻二酚酸的制备方法，其中萃取后通过200～300目硅胶柱(流动相乙酸乙酯：石油醚＝1： 99)除杂，得CBD粗品；然后经过高效制备液相(色谱柱为资生堂UG80 C18柱，规格20mmI.D×250mm 5μm，流动相乙腈：水＝68：32)纯化，得 CBD纯品。CBD纯品HPLC纯度为99.6％。

对照品溶液的制备：大麻二酚、大麻二酚酸对照品为自制对照品，纯度 99％以上，分别精密称取大麻二酚、大麻二酚酸对照品10mg于10mL容量瓶中，甲醇溶解定容，得浓度分别为1.0277mg/mL和1.11mg/mL的对照品溶液，将上述对照品溶液用色谱级甲醇稀释为4μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、 40μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、500μg/mL的系列对照品溶液并加入内标物，使得内标终浓度为0.06mg/mL，以上述色谱条件进气相色谱仪检测，以物质浓度为横坐标，对照品与内标物峰面积比为纵坐标绘制标准曲线。

气相色谱分析条件：进样口温度300℃，分流比2：1，检测器加热温度 300℃，空气流量400mL/min，氢气燃气流量40mL/min，尾吹气流量10mL/min，气相色谱柱流量为2.5mL/min，按表1方式程序升温，进样量1μL。

表1柱温程序升温方式

外标定量法：在上述色谱条件下，待测样品用气相色谱进行检测，对照大麻二酚、四氢大麻酚标准对照品的对应保留时间，记录大麻二酚、四氢大麻酚的峰面积与内标物峰面积的比值，将峰面积比值带入外标曲线，即可得到待测液中大麻二酚、四氢大麻酚的浓度，进而计算得大麻花叶样品中大麻二酚、四氢大麻酚的含量，测定结果：大麻二酚含量0.4％，四氢大麻酚含量 0.025％。测试结果与液相测试法测定结果一致。

实施例2

准确称取黑龙江工业大麻花叶粉末0.2g于锥形瓶中，加入分析纯甲醇10mL，采用常温超声提取，提取时间为30分钟，静置至室温。用分析纯甲醇补足提取液重量，摇匀，静置。

用注射器吸取上清液1.5mL，经0.22μm微孔滤膜过滤，得到澄清透明的待测液。取提取液4mL向其中加入内标溶液，使得内标溶液的浓度为 0.06mg/mL。

气相色谱条件与实施例1相同。

对照品溶液的配制和内标定量法与实施例1相同。测定结果：大麻二酚含量0.77％，四氢大麻酚含量0.043％。测试结果与液相测试法测定结果一致。

实施例3不同气化温度(进样口温度)考察

分别在气化温度150℃、200℃、250℃、300℃、350℃下测定浓度相同的CBD和CBDA对照品，重复进样两次，记录CBD、CBDA对照品色谱峰峰面积并计算其比值，具体数据见下方表1。

表1

表中，通过气相检测到的物质，无论是CBD还是CBDA的保留时间相同，转化比＝CBDA对照品峰面积/CBD对照品峰面积。检测结果显示，CBD 和CBDA对照品保留时间一致，随着气化温度的上升，CBDA转化为CBD 的转化比逐渐增加，当增加到300度时，变化趋于稳定。GC-MS结果显示， CBD和CBDA对照品的保留时间一致，质谱碎片数据基本一致，分子离子峰为314，基本可以认为CBDA在该条件下转化为CBD。

实施例4气相法测试条件和操作与实施例1相同，不同之处如表2所示。

表2

从表中数据可以看出当柱温升温程序中第一次升温的柱温较高时，例如 230℃或210℃时最终检测CBD的总含量偏高，其中主要原因CBD的峰不能与杂质峰分开。进样口温度为250℃时，测定结果偏低。

本发明中气相法测准的依据为与液相法含量测定值是否吻合。一般情况，以不同方法测定结果的相对误差来判断(本发明气相法相对液相检测结果的相对误差小于±3％，在可允许接受范围内)。当气相含量值低于液相时，大概率是因为测试样品中CBDA没有完全转变为CBD；当气相含量高于液相时，分析原因显示气相色谱系统在实际测定时出现未能实现样品中CBD与其它组分的完全有效分离，导致测定结果偏高。

实施例5气相色谱测定结果与液相色谱测定结果数据对比

液相色谱柱为Agilent Extend C18(5μm 4.6×250mm)；流动相A为0.1％磷酸溶液，B为乙腈，按下表进行梯度洗脱，流速：1mL/min；柱温：25℃；样品盘温度：10℃；检测波长：220nm；进样量：10μL。

将实施例1待测液，使用采用液相分析法测得CBD含量为0.1679％和 CBDA含量为0.2634％，CBD总含量计算公式为CBD含量+CBDA含量×Mr(CBD)/Mr(CBDA)，计算得CBD总含量为0.40％。

梯度洗脱程序如表3

表3

Claims (10)

1.一种四氢大麻酚、大麻二酚的定量分析方法，其特征在于，其包括如下步骤：将待测样品注入气相色谱，经程序升温，采用外标法检测得到大麻二酚和/或四氢大麻酚的总含量；其中，所述的经程序升温为从150℃升至280℃；所述的经程序升温的升温速率为10～30℃/min。

2.如权利要求1所述的四氢大麻酚、大麻二酚的定量分析方法，其特征在于，所述气相色谱的进样口温度为200～300℃；

和/或，所述的程序升温为40min内从150℃升至280℃；

和/或，所述的程序升温分为第一阶段升温和第二阶段升温。

3.如权利要求2所述的四氢大麻酚、大麻二酚的定量分析方法，其特征在于，所述的第一阶段升温为温度由150℃升至195℃；

和/或，所述的第一阶段升温的升温速率为10℃/min；

和/或，所述的第二阶段升温为温度由195℃升至280℃；

和/或，所述的第二阶段升温的升温速率为30℃/min；

和/或，所述的程序升温中，所述的第一阶段升温结束后柱温保持10～20min；

和/或，所述的进样口温度为250～300℃。

4.如权利要求3所述的四氢大麻酚、大麻二酚的定量分析方法，其特征在于，所述的气相色谱的检测器的温度为200～300℃；

和/或，所述的气相色谱中，氢气流量为35～45mL/min；

和/或，所述的气相色谱中，空气流量可为350～450mL/min。

5.如权利要求3所述的四氢大麻酚、大麻二酚的定量分析方法，其特征在于，所述的第一阶段升温结束后柱温保持18min；

和/或，所述的待测样品为大麻花叶原料提取物或含大麻二酚、大麻二酚酸、四氢大麻酚和四氢大麻酚酸的混合液；

和/或，所述的待测样品的进样量为1μL；

和/或，所述的气相色谱的色谱柱为Agilent HP-5。

6.如权利要求1-5中任一项所述的四氢大麻酚、大麻二酚的定量分析方法，其特征在于，所述的经程序升温为从以10℃/min由150℃升至195℃；保温18min，然后以30℃/min由195℃升至200℃；保温30min。

7.如权利要求5所述的四氢大麻酚、大麻二酚的定量分析方法，其特征在于，所述的大麻花叶原料提取物的制备方法包括以下步骤：将粉碎后的大麻花叶采用有机溶剂进行超声提取。

8.如权利要求7所述的四氢大麻酚、大麻二酚的定量分析方法，其特征在于，所述的有机溶剂选自甲醇、丙酮、乙醚、环己烷、石油醚和乙酸乙酯中的一种或多种；

和/或，所述的有机溶剂与所述的大麻花叶原料的体积质量比可为50mL/g。

9.如权利要求8所述的四氢大麻酚、大麻二酚的定量分析方法，其特征在于，所述的有机溶剂为甲醇。

10.如权利要求9所述的四氢大麻酚、大麻二酚的定量分析方法，其特征在于，大麻花叶原料提取物的制备方法包括以下步骤：在室温下，将粉碎后的大麻花叶采用有机溶剂进行超声提取，经0.22μm微孔滤膜过滤，加入内标溶液正二十烷。

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