CN108218935B

CN108218935B - 利用离子液体从紫荆叶中提取杨梅苷、槲皮苷和阿福豆苷的方法

Info

Publication number: CN108218935B
Application number: CN201810116162.XA
Authority: CN
Inventors: 李昌勤; 康文艺; 王金梅; 史梦珺; 何楠; 呼谧允
Original assignee: Henan University
Current assignee: Henan University
Priority date: 2018-02-06
Filing date: 2018-02-06
Publication date: 2020-11-03
Anticipated expiration: 2038-02-06
Also published as: CN108218935A

Abstract

本发明涉及一种利用离子液体从紫荆叶中提取杨梅苷、槲皮苷和阿福豆苷的方法，其特征在于，将干燥的紫荆叶粉末与萃取剂混合后于室温进行超声萃取，超声萃取结束后，离心，取上清液即得；所述萃取剂由离子液体与乙醇混合组成。验证试验中杨梅苷、槲皮苷和阿福豆苷的平均含量为8.6915、1.5865和1.0920 mg/g（n=3）。结果表明，本发明采用离子液体结合正交试验筛选最佳提取工艺，对紫荆叶的能源开发及利用提供了科学依据。

Description

利用离子液体从紫荆叶中提取杨梅苷、槲皮苷和阿福豆苷的方法

技术领域

本发明属于医药或/和保健品技术领域，具体涉及一种利用离子液体结合正交试验法从紫荆叶中优化提取杨梅苷、槲皮苷和阿福豆苷的方法。

背景技术

紫荆叶为豆科植物紫荆（Cercis chinensis）的干燥叶，其化学成分主要有黄酮类、二苯乙烯类、酚酸类、木脂素类、氰苷类等。有研究发现，紫荆叶和茎的乙醇提取物能够清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基和抑制Fe2⁺造成的脂质过氧化，并通过活性追踪的方法从紫荆叶的乙醇提取物中分离包括杨梅苷、槲皮苷和阿福豆苷等二十个化合物，其中杨梅苷、槲皮苷等黄酮类成分具有抗氧化、抗肿瘤和保肝等活性。

因此，选择一种合适的提取方式，尽可能完全的提取紫荆叶中杨梅苷、槲皮苷等黄酮类成分对其活性成分的开发利用有着举足轻重的作用。众所周知，传统的有机溶剂提取方法耗时长、效果不显著，对环境也有污染且提取不完全。而近年来兴起的离子液体（IonicLiquid）是一种新型的绿色有机溶剂，又称室温熔盐，由特定的、体积相对较大的、结构不对称的有机阳离子和体积相对较小的无机阴离子组成，具有良好的热稳定性和化学稳定性、粘度范围宽、可调节性和溶解性好等特点，其原理是通过溶解部分植物细胞壁, 使得中草药化学成分更充分的溶出，从而増大提取率，缩短提取时间。因此，在一定条件下，选择合适的离子液体作为萃取剂，能够获得更佳的萃取分离效果。

目前，文献研究中未见关于离子液体对紫荆叶杨梅苷和槲皮苷等黄酮类成分的萃取报道。因此，本发明采用离子液体-超声波辅助萃取-高效液相色谱法，通过SPSS 19.0设计正交试验，同时对紫荆叶中的杨梅苷、槲皮苷、阿福豆苷三种成分进行含量测定，筛取最佳的提取工艺，并对其进行了方法学考察。

发明内容

本发明目的在于克服现有技术缺陷，提供一种利用离子液体从紫荆叶中优化提取杨梅苷、槲皮苷和阿福豆苷的方法，该提取方法操作简单，提取效率高。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种利用离子液体从紫荆叶中提取杨梅苷、槲皮苷和阿福豆苷的方法，其将干燥的紫荆叶粉末与萃取剂混合后于室温（25－30℃）进行超声萃取，超声萃取结束后，离心，取上清液即得；所述萃取剂由离子液体与乙醇混合组成。

具体的，上述提取方法中，所述萃取剂由离子液体与65－75%乙醇水溶液混合组成，所述离子液体为［BMIM］BF₄、［BMIM］Br、［BMIM］PF₆或［HMIM］PF₆；萃取剂中离子液体浓度为0.5－0.9 mol/L。文中如无特殊说明，乙醇均指的是体积浓度。

进一步优选的，可以将紫荆叶粉末与萃取剂按照固液比1g：30－90ml进行添加，紫荆叶粉末的适宜目数范围在60－90目。

为了获得较好的提取效果，超声萃取时间以30－60min为宜，离心转速以3000－6000 r/min为宜。

本发明利用离子液体从紫荆叶中提取杨梅苷、槲皮苷和阿福豆苷的方法构思步骤如下：

1）首先选择合适的溶剂来溶解离子液体并确定最佳的萃取剂类型；分别比较甲醇、乙腈、70%乙醇和水来溶解离子液体并对紫荆叶进行提取，筛选出70%乙醇对目标分析物的提取率最好。接着分别比较了［BMIM］BF₄/70%乙醇，［BMIM］Br/70%乙醇，［BMIM］PF₆/70%乙醇，［HMIM］PF₆/70%乙醇四种萃取剂对目标分析物的萃取率，最终确定［BMIM］BF₄/70%乙醇为最佳萃取剂；

2）在步骤1）的基础上，设计提取条件的因素水平，以提取紫荆叶工艺中的不同控制参数为因子，通过单因素分析法来确定正交试验设计方法的因素水平；筛选多个提取工艺的控制参数后，选取影响最大的几个控制参数为因子：以固液比（倍）、萃取剂浓度（mol/L）、超声时间（min）、离心转速（r/min）、粉碎目数（目）为五个因子，进行正交试验；

3）采用SPSS 19.0设计正交试验，通过直观分析和方差分析法分析并确定杨梅苷、槲皮苷和阿福豆苷的最大提取率以及其对应的因子水平；

4）根据杨梅苷、槲皮苷和阿福豆苷的最大提取率对应的控制参数因子水平，在最优化条件下提取紫荆叶中杨梅苷、槲皮苷和阿福豆苷，检测提取率（将供试品溶液用高效液相色谱仪在254 nm处检测峰面积，与杨梅苷、槲皮苷和阿福豆苷标准曲线比较，计算杨梅苷、槲皮苷和阿福豆苷的萃取量）。将实际提取率与传统溶剂检测值相比较，确定离子液体萃取的先进性。

本发明提供了一种利用离子液体结合正交实验法优化提取杨梅苷、槲皮苷、阿福豆苷的工艺，采用正交设计发考察杨梅苷、槲皮苷、阿福豆苷的提取工艺，运用直观分析和方差分析法对正交试验所得数据进行分析处理，最后得到杨梅苷、槲皮苷、阿福豆苷的最佳提取工艺。本发明为中药研究者们提供了新的思路和途径，本实验建立的最佳提取条件是科学可行的，可用于优化选取合适工业扩大化生产的提取技术，改善陈旧工艺，提高效率，为紫荆叶的综合利用提供实验依据。此外，本发明提取方法操作简单，提取效率高，适合大规模工业化生产。

附图说明

图1为混合对照品（A）与紫荆叶供试品（B）的HPLC图，图中，1.杨梅苷，2.槲皮苷，3.阿福豆苷；

图2为萃取剂种类对紫荆叶中杨梅苷、槲皮苷、阿福豆苷萃取率的影响；

图3为萃取剂浓度对紫荆叶中杨梅苷、槲皮苷、阿福豆苷萃取率的影响；

图4为粉碎目数对紫荆叶中杨梅苷、槲皮苷、阿福豆苷萃取率的影响；

图5为超声时间对紫荆叶中杨梅苷、槲皮苷、阿福豆苷萃取率的影响；

图6为固液比对紫荆叶中杨梅苷、槲皮苷、阿福豆苷萃取率的影响；

图7 为离心转速对紫荆叶中杨梅苷、槲皮苷、阿福豆苷萃取率的影响。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的技术方案作进一步地详细介绍，但本发明的保护范围并不局限于此。

仪器与试剂。

槲皮苷（批号17042804）购于成都普菲德生物技术有限公司，纯度大于98%；杨梅苷、阿福豆苷，纯度大于98%。1-己基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐[HMIM]PF₆（赛默飞世尔科技公司，美国）、溴化1-丁基-3-甲基咪唑[BMIM]Br（默克股份两合公司，德国）、1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐[BMIM]BF₄（默克股份两合公司，德国）、1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐[BMIM]PF₆（默克股份两合公司，德国）。乙腈、甲醇（HPLC级），冰乙酸（天津市福晨化学试剂厂），水为纯净水（杭州娃哈哈百利食品有限公司）。

岛津LC-20AT系列高效液相色谱仪（日本岛津）：LC-20AT液相色谱输液泵、CTO-10AS柱温箱、SPD-20A紫外检测器、LC-Solution色谱数据处理系统；KQ-500DB型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司，江苏）；分样筛（上虞市五四仪器筛具厂，浙江）；TGL-16型高速离心机（江苏金坛市中大仪器厂）；AB135-S型十万级电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司，瑞士）。

实验方法与结果。

2.1杨梅苷、槲皮苷和阿福豆苷含量测定方法的建立。

2.1.1对照品溶液的制备

取杨梅苷、槲皮苷和阿福豆苷适量，精密称定，加甲醇溶解，制得每毫升含249.86μg杨梅苷、69.58 μg槲皮苷和22.91 μg阿福豆苷的混合对照品溶液。

2.1.2供试品溶液的制备

精密称取紫荆叶粉末（90目）1g，加入萃取剂（所述萃取剂由离子液体［BMIM］BF₄与70%乙醇混合组成，萃取剂中离子液体［BMIM］BF₄浓度为0.7 mol/L。）50 mL，室温超声萃取50 min，3000 r/min离心5 min后，吸取上层清液，经0.22 μm微孔滤膜过滤，取滤液，即得（上述所述粉碎目数、萃取溶液、固液比、超声时间以及离心转速为正交试验所设计因素的最优条件）。

2.1.3色谱条件和系统适用性实验

表1 紫荆叶含量测定的色谱条件

按照上述色谱条件，分别进样对照品溶液和供试品溶液，进样体积10 μL，记录色谱图，见图1。在此色谱条件下，样品中杨梅苷、槲皮苷和阿福豆苷的色谱峰与对照品出峰时间一致，三种化合物分离度良好。

2.1.4线性关系考察

精密吸取混合对照品溶液2、5、10、15、20和25 μL，按2.3.1项下色谱条件进样测定，记录各组分峰面积。以峰面积（Y）为纵坐标，进样质量（X，μg）为横坐标，作图得回归方程：杨梅苷Y=2896540X-93968，r=0.9997；槲皮苷；Y=4208940X-60256，r=0.9998；阿福豆苷Y=2741410X-1610.5，r=0.9999。结果表明，进样量杨梅苷在0.4997~6.247μg、槲皮苷在0.1392~1.739 μg、阿福豆苷在0.04582~0.5728 μg与峰面积响应值呈良好的线性关系。

2.1.5重复性实验

精确称量紫荆叶样品6份，按2.1.2制备样品（即试验筛选的最优条件），并按照2.1.3项下色谱条件进样10 μL，结果显示杨梅苷、槲皮苷和阿福豆苷的RSD分别为1.17%、2.96%和2.00%，表明本实验方法重复性好。

2.1.6精密度实验

精密吸取混合对照品溶液10 μL，按照2.1.3项下色谱条件连续进样6次，结果显示杨梅苷、槲皮苷和阿福豆苷的RSD分别为1.28%、0.72%和0.43%，表明仪器精密度良好，可以准确反映物质的量。

2.1.7稳定性实验

精密称取紫荆叶1 g，按2.1.2制备样品制备样品，并按照2.1.3项下色谱条件分别在0 h、4h、8h、12h、16h、20h、24h进样10 μL，结果显示杨梅苷、槲皮苷和阿福豆苷的RSD分别为2.68%、0.97%和2.32%，表明供试液中杨梅苷、槲皮苷和阿福豆苷在24 h内基本稳定。

2.1.8加样回收试验

称取已知杨梅苷、槲皮苷和阿福豆苷含量的紫荆叶样品6份，按2.1.2制备供试品溶液，测定样品中所含杨梅苷、槲皮苷和阿福豆苷的含量，再分别加入相当于样品中杨梅苷、槲皮苷和阿福豆苷质量的80%的标准品，按照2.1.3项下色谱条件进样10 μL，杨梅苷、槲皮苷和阿福豆苷的平均加样回收率分别为100.70%、105.32%和104.80%，其RSD值分别为2.90%、2.33%和2.65%，说明其反应的测试结果的准确度符合要求。

2.2萃取剂的选择

萃取剂类型的选择对目标分析物萃取率的影响很大。本实验首先选取［BMIM］BF₄，［BMIM］Br，［BMIM］PF₆，［HMIM］PF₆四种类型的离子液体作为萃取剂。这四种离子液体均为咪唑类，在空气和溶液中稳定，能够与木质纤维素竞争性结合，从而使纤维素高效溶解，使植物细胞内的成分更加完全的溶出，增加萃取率。但由于离子液体多为粘稠的液体，且［BMIM］Br呈固体结晶状，所以选择合适的溶剂来溶解离子液体尤为重要。试验比较了70%乙醇、甲醇、乙腈和水四种溶剂，按照2.1.2制备样品，并通过上述2.1.3色谱条件注入HPLC分析，比较三种目标分析物杨梅苷、槲皮苷和阿福豆苷的含量。结果显示，水和乙腈不能提取出紫荆叶中的黄酮类成分。如图2所示，70%乙醇对目标分析物的提取率最好，故试验选择70%乙醇作为溶剂。

接下来比较了［BMIM］BF₄/70%乙醇，［BMIM］Br/70%乙醇，［BMIM］PF₆/70%乙醇，［HMIM］PF₆/70%乙醇四种萃取剂对目标分析物杨梅苷、槲皮苷和阿福豆苷的萃取结果，最终结果如图2显示，［BMIM］BF₄/70%乙醇对目标分析物的萃取率最高，这可能与离子液体的自身组成结构有关。故本试验选择［BMIM］BF₄/70%乙醇作为萃取剂。

2.3萃取剂浓度的选择

结果如图3所示，在萃取剂浓度为0.1~0.7 mol/L时，随着萃取剂浓度的增大，目标分析物杨梅苷、槲皮苷和阿福豆苷的萃取率呈增加的趋势；而随着萃取剂浓度的进一步增加，反而呈降低趋势。这可能是因为随着离子液体浓度的增加，溶剂的扩散力降低，很难进入药材内部，不能够充分地提取药材中的成分，而造成萃取率下降。因此，选择0.7 mol/L为最佳的萃取剂浓度。

2.4粉碎目数的选择

按照上述实验方法，其他试验条件相同，分别考察了紫荆叶粉末目数为24目、40目、50目、60目、70目和90目对目标分析物杨梅苷、槲皮苷和阿福豆苷萃取量的影响。如图4显示，随着粉碎目数的增大，萃取量有随之增大的趋势，而当粉碎目数为70目时，对目标分析物的萃取率达到最大。这可能是因为离子液体具有黏性，随着粉末粒度的逐渐减小，样品中的化学成分越易被提取，但若当粉末粒度太小时，又容易被离子液体凝聚成团，反而阻碍其化学成分的释放。

2.5超声时间的选择

分别选择10、20、35、50、和60 min为超声时间，萃取剂浓度为0.7 mol/L，按照上述实验条件，比较不同超声时间对目标分析物杨梅苷、槲皮苷和阿福豆苷萃取率的影响，结果如图5所示。

随着超声时间的延长，对目标分析物的萃取率基本呈现逐渐增加的趋势；当超声时间为35 min时，对目标分析物的萃取率达到最大，之后随着时间的增加，目标分析物的萃取率呈现下降趋势。上述原因可能是因为一定的超声时间会破坏离子液体和目标分析物的结构，具体的原因需要进一步的研究。

2.6固液比的选择

在萃取剂浓度为0.7mol/L时，考察固液比（g：ml）为1:10、1:20、1:30、1:50、1:70和1:90时，离子液体对目标分析物杨梅苷、槲皮苷和阿福豆苷的萃取率的影响。结果如图6所示，随着固液比中液体量的增加，离子液体对目标分析物的萃取率也增加，当固液比达到1:50时，萃取率达到最大值，当继续增加比例时，萃取率反而下降。这可能是因为离子液体自身结果和物理特性的原因。

2.7离心转速的选择

在上述优化的最佳条件下，选择3000、5000、6000、7000和9000 r·min^-1考察离心速度对目标分析物萃取率的影响，如图7所示，萃取率在5000 r·min^-1时达到最大，故实验选择5000 r·min^-1作为离心速度进行方法学验证。

3.1 正交实验

3.1.1 因素水平设计

通过SPSS 19.0设计5因素3水平正交实验（如表3-1所示，每个因素的水平范围都是参照单因素实验的结果而定），以期筛选出紫荆叶中杨梅苷等黄酮类成分的最佳提取条件。并按照表3-1所设计条件制备样品，然后精密吸取15μL，按上述色谱条件一次注入HPLC分析，按照外标法计算杨梅苷、槲皮苷和阿福豆苷的含量。

表3-1正交试验因素和水平表

3.2.1正交法优化紫荆叶中杨梅苷等黄酮类成分的萃取结果

3.2.1.1直观分析（极差分析）

经过萃取剂浓度（mol/L），超声时间（min）、固液比（倍）和离心转速（r/min）5因素3水平的正交试验，发现各组合对杨梅苷、槲皮苷和阿福豆苷的含量影响差异性很大。通过综合评分法，确定此3个指标的权重系数分别是0.5、0. 3和0.2。将实验结果列于表3-2中。

表3-2极差分析结果

由表3-2的结果分析可以看出：萃取剂浓度、超声时间、固液比和离心转速这四个因子对实验结果都有很大的影响。其中，粉碎目数的影响因素最大；离心转速次之。影响顺序的结果为：E> D > A > B >C。

但是极差分析不能够准确地反映出的实验结果的差异是由试验误差还是实验组别水平之间的实质性变化造成的。因此，为了能够更全面、准确的表达实验结果，需进行进一步分析。

3.2.1.2方差分析结果

以综合评分值为指标，应用SPSS 19.0软件对其结果进行方差分析，结果见下表3-3。

表3-3结果表明：E因素为显著性差异。且四个因子的影响顺序为：E> D > A > B >C，与极差分析结果一致。初步确定A₃B₂C₃D₁E₃为最佳的提取工艺，即：萃取剂浓度为0.7 mol/L，超声时间为50 min，固液比为1:50，离心转速3000 r/min,粉碎目数90目。下述参照最佳提取工艺给出了部分实施例。

表3-3影响因素的方差分析结果

对照例

一种利用离子液体从紫荆叶中提取杨梅苷、槲皮苷和阿福豆苷的方法，其将1g干燥的紫荆叶粉末（90目）与50 mL萃取剂70%乙醇混合后，于室温超声萃取50min，超声萃取结束后，3000 r/min离心5 min后，取上清液即得。

经检测可知：上清液中杨梅苷、槲皮苷和阿福豆苷的含量分别为：2.2603, 0.4398和 0.2357 (mg/g) (n=3)。

实施例1

一种利用离子液体从紫荆叶中提取杨梅苷、槲皮苷和阿福豆苷的方法，其将1g干燥的紫荆叶粉末（90目）与50mL萃取剂（所述萃取剂由离子液体［BMIM］BF₄与70%乙醇混合组成，萃取剂中离子液体［BMIM］BF₄浓度为0.7 mol/L。）混合后，于室温超声萃取50min，超声萃取结束后，3000 r/min离心5 min后，取上清液即得。

经检测可知：上清液中杨梅苷、槲皮苷和阿福豆苷的含量分别为：8.6915、1.5865和 1.0920 mg/g（n=3）。

实施例2

一种利用离子液体从紫荆叶中提取杨梅苷、槲皮苷和阿福豆苷的方法，其将1g干燥的紫荆叶粉末（90目）与50mL萃取剂（所述萃取剂由离子液体［BMIM］Br与70%乙醇混合组成，萃取剂中离子液体［BMIM］Br浓度为0.7 mol/L。）混合后，于室温超声萃取50min，超声萃取结束后，3000 r/min离心5 min后，取上清液即得。

经检测可知：上清液中杨梅苷、槲皮苷和阿福豆苷的含量分别为：4.3237、1.0285和0.7819 mg/g（n=3）。

结论：本试验以离子液体–超声辅助提取紫荆叶中杨梅苷等黄酮类成分，以期为紫荆叶的开发利用提供理论基础。但是本文尚未发现离子液体类型与不同活性成分的规律性，需要进一步的深入研究。本发明首次以［BMIM］BF₄/70%乙醇溶液为萃取剂，以萃取剂浓度（mol/L），超声时间（min）、固液比（倍）、粉碎目数（目）和离心转速（r/min）5因子3水平设计正交设计试验，利用HPLC法同时分离测定紫荆叶中的杨梅苷、槲皮苷和阿福豆苷的含量。经直观分析和方差分析法得到紫荆叶的最佳提取条件是：萃取剂浓度为0.7 mol/L，粉碎目数为90目，固液比为1:50，超声时间为50 min，离心转速3000 r/min。试验证明杨梅苷、槲皮苷和阿福豆苷的平均含量为8.6915，1.5865 和 1.0920 (mg/g) (n=3)。本发明为中药研究者们提供了新的思路和途径，本实验建立的最佳提取条件是科学可行的，可用于优化选取合适工业扩大化生产的提取技术，改善陈旧工艺，提高效率，为紫荆叶的综合利用提供实验依据。

Claims

1.一种利用离子液体从紫荆叶中提取杨梅苷、槲皮苷和阿福豆苷的方法，其特征在于，将干燥的紫荆叶粉末与萃取剂混合后于室温进行超声萃取，超声萃取结束后，离心，取上清液即得；

所述萃取剂由离子液体与65－75%乙醇混合组成，所述离子液体为［BMIM］BF₄、［BMIM］Br、［BMIM］PF₆或［HMIM］PF₆；萃取剂中离子液体浓度为0.5－0.9 mol/L。

2.如权利要求1所述利用离子液体从紫荆叶中提取杨梅苷、槲皮苷和阿福豆苷的方法，其特征在于，紫荆叶粉末与萃取剂按照固液比1g：30－90 mL进行添加，紫荆叶粉末目数为60－90目。

3.如权利要求1至2任一所述利用离子液体从紫荆叶中提取杨梅苷、槲皮苷和阿福豆苷的方法，其特征在于，超声萃取时间为30－60 min。

4.如权利要求3所述利用离子液体从紫荆叶中提取杨梅苷、槲皮苷和阿福豆苷的方法，其特征在于，离心转速为3000－6000 r/min。