CN106442805A - 一种库尔勒香梨果实石细胞中磨木木质素提取的方法 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及一种库尔勒香梨果实石细胞中磨木木质素提取的方法，包括预处理、除汁、分离、干燥、粗木质素提取、磨木木质素提纯，将粗制木质素溶解于吡啶‑冰醋酸‑水混合溶液中；溶解后加入三氯甲烷静置萃取，分离出三氯甲烷层；并在40~45℃条件下真空干燥浓缩到原来体积的1/10；浓缩后的溶液中加入乙醚，离心分离出白色沉淀，移至常温培养皿中逐渐变为棕黄色胶状物；使用烘箱烘干沉淀物，最终获得棕黄色粉状物为MWL，保存备用。本发明对现有的MWL提取及其碱性硝基苯氧化产物的检测方法进行了改进，明确了MWL的提取率，香梨果肉中MWL提取率为6‰；使用安捷伦1260型高效液相色谱仪检测，提高了主要六种物质的检测精度；资源综合利用率高，明确了MWL提取工艺参数。
Description
技术领域
本发明涉及天然产物有效成分的提取及检测技术领域，尤其涉及一种库尔勒香梨果实石细胞中磨木木质素提取的方法。
背景技术
木质素（lignin）的基本结构单元为苯基丙烷，以醚键和碳碳键相联结，在木质素骨架中的侧链上有各种不同的化学官能团。这些单元结构间键型组成的变化和化学官能团差异都可能对木质素的力学性质和化学结构变化产生影响。木质素单体主要有三种：香豆醇，松柏醇和芥子醇，分别聚合成三种木质素；对羟基苯基木质素（p-Hydroxyphenyllignin,H-木质素）、愈创木基木质素（Guaiacyl lignin,G-木质素）、紫丁香基木质素（Syringyl lignin,S-木质素）。石细胞是梨果实组织的主要构成，梨果实中石细胞含量与木质素含量呈正相关，精确测定木质素含量反应梨果实品质有重要意义。磨木木质素（Milled Wood Lignin , MWL）被认为是的木质素最稳定试样，因此是结构分析中用得最多的木质素样品。木质素的提取纯化方法，依据其溶解性可以分为两类：一种是将木质素以外的成分进行降解，木质素作为不溶物质而沉淀下来；另一种分离方法是利用有机溶剂将木质素进行溶解，从而木质素与纤维素等物质的分离，得到木质素。（苏同福，木质素的测定方法研究进展，河南农业大学学报，2007,41（3）：356-362）。在试验操作中通常会综合两类方法运用。主要方法有：碱法、超滤法、碱析法、酸沉淀法、絮凝沉淀法、高沸醇溶剂法、二氧六环溶剂法等。从植物体中分离提取木质素是利用二氧六环法，利用二氧六环溶剂可溶解木质素的特性，经过苯醇或者丙酮和水抽提的材料粉末溶于二氧六环-水的混合溶剂，MWL溶解于二氧六环中，从而得到粗制MWL。粗制MWL再经过吡啶/冰醋酸/水混合液溶解后，利用三氯甲烷对其进行萃取，然后用乙醚使其沉淀，从而得到精制纯化的木质素。
木质素的分子结构中存在着多种活性基团，所以木质素的制备要求极其温和的环境。降解木质素常用方法有三种：高锰酸钾降解、硝基苯和氧化铜氧化，Sun以麦草为试材，研究了硝基苯和氧化铜氧化降解方法的差别，发现这两者的主要区别只在于硝基苯氧化产物的量是氧化铜氧化产物的两倍，同时这种方法比高锰酸钾氧化更简单，使用这种方法主要是为了按照三种苯丙烷结构(愈创木基丙烷，紫丁香基丙烷和对羟基苯丙烷)单元的比例对木质素进行分类，用这种方法可鉴定不同植物来源和植物中不同形态部位的木质素。
研究木质素结构以用红外光谱，紫外光谱、核磁共振谱和高效液相色谱等分析手段进行检测。本发明采用高效液相色谱检测MWL硝基苯氧化产物，进行定性定量。本发明使用有机试剂用量较少，用量明确，用时较短，操作简单提取率高。
发明内容
本发明的目的就在于为了解决上述问题而提供一种库尔勒香梨果实石细胞中磨木木质素提取的方法，其可以高效的提取香梨果实石细胞中磨木木质素。
本发明的目的是这样实现的：一种库尔勒香梨果实石细胞中磨木木质素提取的方法，其包括如下操作步骤：
步骤一、预处理：将香梨果实去皮去心室后，手工使用刀片取香梨果实胴部果肉；将果肉切成约1.0 cm3块，装于保鲜袋中在-20℃冰柜中冷冻12 h；
步骤二、除汁：样品解冻后，使用搅拌机（HR1724，PHILIPS滤网200目）去除大量果汁后，加入400ml蒸馏水于果渣（主要是石细胞）中，继续倾倒洗液，重复4次，最后将果渣倒出；滤除果汁，滤网(孔径74 μm，200目)保留搅拌破碎的果渣组织；
步骤三、分离：使用均质机（T10，IKA，转速20000~30000 rap/min、破碎率80%、悬浮颗粒直径5~10 μm）匀浆3~5 min，使石细胞充分与果肉分离。将匀浆液3000 rap/min离心8~12min，沉淀物主要是石细胞；
步骤四、干燥：将石细胞从离心杯中取出，置烘箱中60～65℃烘至恒重，取出放置到干燥器中冷却至室温。收集石细胞，称量，精确到1 mg；
步骤五、粗木质素提取：取一定量石细胞机器研磨过200目筛；取10 g石细胞粉末使用苯-乙醇(2:1，V/V)浸提12 h，料液比为1:10；将浸提液用抽滤装置过滤分离，取滤渣在静置状态下用二氧六环-水浸提，25~45℃，料液比1:8~14，提取36~72 h，滤出抽提液。将上述抽提液用旋转蒸发仪在40~45℃条件下浓缩，真空压为0.075 MPa~0.085 MPa得粗制木质素；
步骤六、磨木木质素提纯：将粗制木质素溶解于吡啶-冰醋酸-水(9:1:4，V/V)混合溶液中；溶解后加入15倍体积三氯甲烷静置萃取，分离出三氯甲烷层（下层为三氯甲烷层）；并在40~45℃条件下真空干燥浓缩到原来体积的1/10，仪器工作参数为：30~35 min，转速40rap/min,温度35~40℃，真空压为0.080~0.085 MPa；浓缩后的溶液中加入5倍体积乙醚，3000 rap/min，10~15 min离心分离出白色沉淀，移至常温培养皿中逐渐变为棕黄色胶状物；使用烘箱烘干沉淀物。称重精确到1.0 mg。最终获得棕黄色粉状物为MWL，保存备用。
进一步地，所述步骤一中选取材料为香梨果肉中石细胞。
进一步地，所述步骤五中1,4-二氧六环与水的体积比例为7:3；
进一步地，所述步骤五中1,4-二氧六环与水浸提时间为48 h；
进一步地，所述步骤五中1,4-二氧六环与水浸提温度为35℃；
进一步地，所述步骤五中1,4-二氧六环与水浸提中料液比为1:12。
检测磨木木质素碱性硝基苯氧化产物的方法，其包括如下操作步骤：
步骤一、MWL碱性硝基苯氧化降解反应：称取MWL 30 mg，加入硝基苯60~800 μL，2 mol/L NaOH溶液7 mL，充分溶解后，185℃油浴5 h，升温时间为15~20 min；待反应物冷却至60℃左右，滴加1 mol/L HCl溶液调节至pH=4~5；用15倍体积三氯甲烷萃取三次，收集三氯甲烷层（下层）旋转蒸发浓缩15 min，转速30~40 rap/min，温度35~40℃，真空压为0.070~0.075MPa，用甲醇溶解备用，甲醇为色谱级；
步骤二、MWL碱性硝基苯氧化产物标准曲线绘制：分别精确称取6.0 mg对羟基苯甲酸、香草酸、丁香酸、对羟基苯甲醛、香草醛和丁香醛，用色谱级甲醇溶解然后分别配制成浓度为0.6 mg/mL、0.45 mg/mL、0.30 mg/mL、0.18 mg/mL、0.09 mg/mL、0.06 mg/mL标准品溶液，高效液相色谱仪分析检测，将色谱图积分，记录峰面积，以标准浓度为纵坐标，浓度的单位为mg/mL，峰面积为横坐标，绘制标准曲线。
步骤三、样品中碱性硝基苯氧化产物的测定：将步骤（1）的提取液经0.22 μm滤膜过滤，高效液相色谱仪检测，将色谱图积分，记录峰面积，外标法计算，即得样品中碱性硝基苯氧化产物的含量。
进一步地，所述步骤二中硝基苯用量为240 μL。
进一步地，所述步骤三中按照如下色谱条件进行测定：Agilent Poroshell 120EC-C18柱(粒径为2.7 μm，由1.7 μm直径的实心核和0.5 μm厚的多孔外层构成)，250 mm×4.6 mm，孔径4.0 μm，保护柱：AgilentEC-C18（4.6×5 mm,4.0 μm）；流动相：乙腈：水=12：88(V/V)，含1%醋酸；进样量：10 μl;流速：0.5 mL/min；柱温：30℃；检测波长:280 nm，254 nm，紫外检测器。
本发明与现有技术比较，其有益的技术效果在于：本发明对现有的MWL提取及其碱性硝基苯氧化产物的检测方法进行了改进，明确了MWL的提取率，香梨果肉中MWL提取率为6‰；使用安捷伦1260型高效液相色谱仪检测，提高了主要六种物质的检测精度；资源综合利用率高，明确了MWL提取工艺参数。在1,4-二氧六环与水的体积比例为7:3，料液比为1：12，提取时间为48 h，提取温度为35℃时提取率最高；在本发明色谱条件下分析MWL硝基苯氧化产物，与标准品保留时间对比，得出一致色谱图。通过计算分离度R>>1.5杂质无干扰，且方法可行性高；在相应的线性范围内，各类线性关系好，决定系数均达0.999以上，相对标准差（RSD）分别为1.239%，1.428%，1.937%，1.657%，1.677%，1.461%，回收率分别为0.957%，1.046%，1.011%，1.015%，1.279%，0.854%。精密度较高，结果准确，且方法可行性高。
附图说明
本发明的具体结构由以下的附图和实施例给出：
图1是对羟基苯甲酸标准曲线；
图2 是香草酸标准曲线；
图3是丁香酸标准曲线；
图4是对羟基苯甲醛标准曲线；
图5是香草醛标准曲线；
图6是丁香醛标准曲线；
图7是溶液比对MWL提取率的影响；
图8是料液比对MWL提取率的影响；
图9是提取温度对MWL提取率的影响；
图10是提取时间对MWL提取率的影响；
图11是硝基苯用量对MWL硝基苯氧化产物的影响；
图12是对羟基苯甲酸、香草酸、丁香酸标准品254nm HPLC色谱图；
图13是香梨果肉石细胞中MWL硝基苯氧化产物254nm HPLC色谱图；
图14是对羟基苯甲醛、香草醛和丁香醛标准品280nm HPLC色谱图；
图15是香梨果肉石细胞中MWL碱性硝基苯氧化产物280nm HPLC色谱图；
图16是本申请的工艺流程图。
具体实施方式
本发明不受下述实施例的限制，可根据本发明的技术方案与实际情况来确定具体的实施方式。
1、原料与药品：
库尔勒香梨，购于乌市北园春市场；超纯水（18.25MΩ·cm），AKHL-Ⅲ-24A 艾柯实验室超纯水仪制备；对羟基苯甲酸(4-Hydrxybenzoic acid，CAS 99-96-7)、香草酸（Vanillicacid ,CAS 121-34-6）、丁香酸（Syringic acid，CAS 530-57-4）、对羟基苯甲醛（4-Hydrxybenzaldehyde，CAS 123-08-0）、香草醛（Vanillin ,CAS 121-33-5）、丁香醛（Syringaldehyde，CAS 134-96-3），sigma公司；1,4-二氧六环（CAS，123-91-1），硝基苯（CAS，98-95-3），无水乙醇（CAS，64-17-5），吡啶（CAS，110-86-1），苯（CAS，71-43-2），乙醚（CAS，60-29-7），冰乙酸（CAS，64-19-7），三氯甲烷（CAS，67-66-3），氢氧化钠（CAS，1310-73-2），盐酸（CAS，7647-01-0），二甲基硅油（CAS，9006-65-9），以上皆为分析纯；甲醇（CAS，67-56-1），乙腈（CAS，75-05-8），色谱纯，sigma公司。
2.仪器与设备：
高效液相色谱仪：Agilent 1260，包括在线脱气机，四元泵，自动进样器，柱温箱，紫外检测器，色谱工作站：色谱柱Agilent Poroshell 120 EC-C18柱（250 mm×4.6 mm，4.0 μm），保护柱AgilentEC-C18（4.6×5 mm,4.0 μm）、旋转蒸发仪(RE1100-Pro，Scilogex)、恒温电热油浴锅(DF-101S,金坛市医疗仪器厂)、磁力搅拌机（RCT basic,IKA）、超声波清洗机(SK7200H,上海科导超声仪器有限公司)、研磨粉碎机(A11 basic，IKA)、均质机（T10，IKA）、万分之一电子分析天平(ML204,Mettler Tdedo)、离心机(LXT-ⅡB,上海安亭科学仪器厂)、干燥箱（DZF-6050，上海一恒科学仪器有限公司）、搅拌机（HR1724，PHILIPS）、循环水式多用真空泵（SHB-Ⅲ，郑州长城科工贸有限公司）、纯水仪（AKHL-Ⅲ-24A，艾柯实验室超纯水仪）
实施例1：(1)MWL的提取：
a)预处理：将香梨果实去皮去心室后，手工使用刀片取香梨果实胴部果肉；将果肉切成约1.0cm3块，装于保鲜袋中在-20℃冰柜中冷冻12h；样品解冻后，使用搅拌机（HR1724，PHILIPS滤网200目）去除大量果汁后，加入400ml蒸馏水于果渣（主要是石细胞）中，继续倾倒洗液，重复4次，最后将果渣倒出；滤除果汁，滤网(孔径74 μm，200目)保留搅拌破碎的果渣组织。使用均质机（T10，IKA，转速8000~30000 rap/min、破碎率80%、悬浮颗粒直径5~10μm）匀浆3~5 min，使石细胞充分与果肉分离。将匀浆液3000 rap/min离心8~12 min，沉淀物主要是石细胞。将石细胞从离心杯中取出，置烘箱中60～65℃烘至恒重，取出放置到干燥器中冷却至室温。收集石细胞，称量，精确到1 mg。
（b）粗木质素提取：取一定量石细胞机器研磨过200目筛；取10 g石细胞粉末用苯-乙醇(2:1，V/V)提取12 h；料液比为1:10；将浸提液用抽滤装置分离，滤渣在静置状态下用二氧六环-水提取；按照表1，2优化提取工艺参数。
表1单因素试验设计
表2 L934正交实验因子设计
滤出抽提液。将上述抽提液用旋转蒸发仪在40~45℃条件下浓缩，真空压为0.075 MPa~0.085 MPa得粗制木质素。
磨木木质素提纯：将粗制木质素溶解于吡啶-冰醋酸-水(9:1:4，V/V)混合溶液中；溶解后加入15倍体积三氯甲烷静置萃取，分离出三氯甲烷层（下层为三氯甲烷层）；并在40~45℃条件下真空干燥浓缩到原来体积的1/10，仪器工作参数为：30~35 min，转速40 rap/min,温度35~40℃，真空压为0.080~0.085 MPa；浓缩后的溶液中加入5倍体积乙醚，3000rap/min，10~15 min离心分离出白色沉淀，移至常温培养皿中逐渐变为棕黄色胶状物；使用烘箱烘干沉淀物。称重精确到1.0 mg。最终获得棕黄色粉状物为MWL，保存备用。
实施例2：（1）碱性硝基苯氧化实验
MWL碱性硝基苯氧化降解反应：称取MWL30 mg，加入硝基苯，按照表3优化MWL碱性硝基苯氧化工艺参数。
表3 MWL碱性硝基苯氧化试验硝基苯用量筛选试验设计
2 mol/L NaOH溶液7 mL，充分溶解后，185℃油浴5 h，升温时间为15~20 min；待反应物冷却至60℃左右，滴加1 mol/L HCl溶液调节至pH=4~5；用15倍体积三氯甲烷萃取三次，收集三氯甲烷层（下层）旋转蒸发浓缩15 min，转速30~40 rap/min，温度35~40℃，真空压为0.070~0.075 MPa，用甲醇溶解备用，甲醇为色谱级。
（2）高效液相色谱测定
（a）MWL碱性硝基苯氧化产物标准曲线绘制
分别精确称取6.0 mg对羟基苯甲酸、香草酸、丁香酸、对羟基苯甲醛、香草醛和丁香醛，用色谱级甲醇溶解然后分别配制成浓度为0.60 mg/mL、0.45 mg/mL、0.3 mg/mL、0.18 mg/mL、0.09 mg/mL、0.06 mg/mL标准品溶液，进样量为10μL,高效液相色谱仪分析检测，将色谱图积分，记录峰面积，以标准浓度为纵坐标，浓度的单位为mg/mL，峰面积为横坐标，绘制标准曲线。
如图1，2，3，4，5，6；
由上图1得标准曲线为：y=5E-10x+0.0052 相关系数0.9996；
图2得标准曲线为：y=9E-10x+0.0133 相关系数0.9993；
图3得标准曲线为：y=2E-09x+0.0097 相关系数0.9992；
图4得标准曲线为：y=4E-10x+0.0111 相关系数0.9992；
图5得标准曲线为：y=7E-10x+0.0088 相关系数0.9991；
图6得标准曲线为：y=1E-09x-0.0008 相关系数0.9993；
表明对羟基苯甲酸、香草酸、丁香酸、对羟基苯甲醛、香草醛和丁香醛在0.06 mg/mL~0.6 mg/mL浓度范围内，色谱峰面积与样品量成线性关系。
本试验采用样品加标回收，称取相同质量的两份样品，分别称取30.0mg MWL碱性硝基苯氧化，在其中一份分别加入0.3 mg六种标准品，按照本发明处理方法处理两份相同的样品，测定其含量。
结果为加标样品浓度分别为：0.289 mg/ml, 0.307 mg/ml, 0.334 mg/ml, 0.305mg/ml, 0.409 mg/ml, 0.251 mg/ml；未加标样品分别为：0.013 mg/ml, 0.013 mg/ml,0.026 mg/ml, 0.005 mg/ml, 0.089 mg/ml, 0.043 mg/ml。使用以下公式对加标回收率进行计算：加标回收率=（加标试样测定值-试样测定值）÷加标量×100%；加标回收率为：0.957%，1.046%，1.011%，1.015%，1.279%，0.854%。
（b）MWL碱性硝基苯氧化产物测定液相条件
将步骤（1）的提取液经0.22 μm滤膜过滤进行量为10 μL，高效液相色谱仪检测，将色谱图积分，记录峰面积，外标法计算，即得样品中碱性硝基苯氧化产物的含量。色谱条件进行测定：安捷伦1260高效液相色谱仪（1260 Infinity，Agilent），Agilent Poroshell 120EC-C18柱（粒径2.7 μm），250 mm× 4.6 mm，孔径4 μm；流动相为乙腈：水=12:88(V/V)，含1%醋酸，流动相经0.45 μm滤膜过滤，超声脱气30 min；进样量：10 μL；流速：0.5 ml/min；柱温：30℃；检测波长:280 nm，254 nm，紫外检测器。
由上述实施例1得出如图7-10的结果：采用有机溶剂提取法提取香梨果肉石细胞中MWL，通过单因素试验、正交试验和验证试验最终确定提取条件：提取时间48 h，提取温度35℃，料液比为7:3，溶液比为1:12。在此提取条件下，测得香梨果肉中石细胞MWL提取率为6‰左右。
由上述实施例2如图11-15所示：硝基苯用量为240 μL时，MWL碱性硝基苯氧化产物（主要六种）对羟基苯甲酸、香草酸、丁香酸、对羟基苯甲醛、香草醛和丁香醛含量较高，依次为0.007 mg/mL、0.192 mg/mL、0.248 mg/mL、0.015 mg/mL、0.244 mg/mL、0.198 mg/mL。
上述说明仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。凡是属于本发明的技术方案所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。
Claims (9)
1.一种库尔勒香梨果实石细胞中磨木木质素提取的方法，其特征在于：
其包括如下操作步骤：
步骤一、预处理：将香梨果实去皮去心室后，手工使用刀片取香梨果实胴部果肉；将果肉切成约1.0 cm3块，装于保鲜袋中在-20℃冰柜中冷冻12 h；
步骤二、除汁：样品解冻后，使用搅拌机（HR1724，PHILIPS滤网200目）去除大量果汁后，加入400ml蒸馏水于果渣（主要是石细胞）中，继续倾倒洗液，重复4次，最后将果渣倒出；滤除果汁，滤网(孔径74 μm，200目)保留搅拌破碎的果渣组织；
步骤三、分离：使用均质机（T10，IKA，转速20000~30000 rap/min、破碎率80%、悬浮颗粒直径5~10 μm）匀浆3~5 min，使石细胞充分与果肉分离；将匀浆液3000 rap/min离心8~12min，沉淀物主要是石细胞；
步骤四、干燥：将石细胞从离心杯中取出，置烘箱中60～65℃烘至恒重，取出放置到干燥器中冷却至室温；收集石细胞，称量，精确到1 mg；
步骤五、粗木质素提取：取一定量石细胞机器研磨过200目筛；取10 g石细胞粉末使用苯-乙醇(2:1，V/V)浸提12 h，料液比为1:10；将浸提液用抽滤装置过滤分离，取滤渣在静置状态下用二氧六环-水浸提，25~45℃，料液比1:8~14，提取36~72 h，滤出抽提液；将上述抽提液用旋转蒸发仪在40~45℃条件下浓缩，真空压为0.075 MPa~0.085 MPa得粗制木质素；
步骤六、磨木木质素提纯：将粗制木质素溶解于吡啶-冰醋酸-水(9:1:4，V/V)混合溶液中；溶解后加入15倍体积三氯甲烷静置萃取，分离出三氯甲烷层（下层为三氯甲烷层）；并在40~45℃条件下真空干燥浓缩到原来体积的1/10，仪器工作参数为：30~35 min，转速40rap/min,温度35~40℃，真空压为0.080~0.085 MPa；浓缩后的溶液中加入5倍体积乙醚，3000 rap/min，10~15 min离心分离出白色沉淀，移至常温培养皿中逐渐变为棕黄色胶状物；使用烘箱烘干沉淀物；称重精确到1.0 mg；最终获得棕黄色粉状物为MWL，保存备用。
2.如权利要求1所述的一种库尔勒香梨果实石细胞中磨木木质素提取的方法，其特征在于：所述步骤一中选取材料为香梨果肉中石细胞。
3.如权利要求1所述的一种库尔勒香梨果实石细胞中磨木木质素提取的方法，其特征在于：所述步骤五中1,4-二氧六环与水的体积比例为7:3。
4.如权利要求1所述的一种库尔勒香梨果实石细胞中磨木木质素提取的方法，其特征在于：所述步骤五中1,4-二氧六环与水浸提时间为48 h。
5.如权利要求1所述的一种库尔勒香梨果实石细胞中磨木木质素提取的方法，其特征在于：所述步骤五中1,4-二氧六环与水浸提温度为35℃。
6.如权利要求1所述的一种库尔勒香梨果实石细胞中磨木木质素提取的方法，其特征在于：所述步骤五中1,4-二氧六环与水浸提中料液比为1:12。
7.一种检测磨木木质素碱性硝基苯氧化产物的方法，其特征在于：
其包括如下操作步骤：
步骤一、MWL碱性硝基苯氧化降解反应：称取MWL 30 mg，加入硝基苯60~800 μL，2 mol/L NaOH溶液7 mL，充分溶解后，185℃油浴5 h，升温时间为15~20 min；待反应物冷却至60℃左右，滴加1 mol/L HCl溶液调节至pH=4~5；用15倍体积三氯甲烷萃取三次，收集三氯甲烷层（下层）旋转蒸发浓缩15 min，转速30~40 rap/min，温度35~40℃，真空压为0.070~0.075MPa，用甲醇溶解备用，甲醇为色谱级；
步骤二、MWL碱性硝基苯氧化产物标准曲线绘制：分别精确称取6.0 mg对羟基苯甲酸、香草酸、丁香酸、对羟基苯甲醛、香草醛和丁香醛，用色谱级甲醇溶解然后分别配制成浓度为0.6 mg/mL、0.45 mg/mL、0.30 mg/mL、0.18 mg/mL、0.09 mg/mL、0.06 mg/mL标准品溶液，高效液相色谱仪分析检测，将色谱图积分，记录峰面积，以标准浓度为纵坐标，浓度的单位为mg/mL，峰面积为横坐标，绘制标准曲线；
步骤三、样品中碱性硝基苯氧化产物的测定：将步骤（1）的提取液经0.22 μm滤膜过滤，高效液相色谱仪检测，将色谱图积分，记录峰面积，外标法计算，即得样品中碱性硝基苯氧化产物的含量。
8.如权利要求7所述的检测磨木木质素碱性硝基苯氧化产物的方法，其特征在于：所述步骤二中硝基苯用量为240 μL。
9.如权利要求7所述的检测磨木木质素碱性硝基苯氧化产物的方法，其特征在于：所述步骤三中按照如下色谱条件进行测定：Agilent Poroshell 120 EC-C18柱(粒径为2.7 μm，由1.7 μm直径的实心核和0.5 μm厚的多孔外层构成)，250 mm× 4.6 mm，孔径4.0 μm，保护柱：AgilentEC-C18（4.6×5 mm,4.0 μm）；流动相：乙腈：水=12：88(V/V)，含1%醋酸；进样量：10 μl;流速：0.5 mL/min；柱温：30℃；检测波长:280 nm，254 nm，紫外检测器。
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| CN201611035848.3A Pending CN106442805A (zh) | 2016-11-23 | 2016-11-23 | 一种库尔勒香梨果实石细胞中磨木木质素提取的方法 |
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