CN113105523A - 一种低环肽a含量的亚麻籽环肽混合物的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种低环肽A含量的亚麻籽环肽混合物的制备方法。所述方法包括以下步骤：将亚麻籽粉碎，过筛并干燥得到干燥亚麻籽粉；采用固液萃取法，用丙酮提取3‑8h，得到含有疏水性亚麻肽的亚麻籽油，减压浓缩，并用氮气或惰性气体对所得亚麻籽油进行抗氧化保护；将亚麻籽油与甲醇水溶液混合后萃取，离心，取上层清液减压浓缩，收集提取物；往提取物中加入无水乙醇，然后离心，取上层清液减压浓缩，收集提取物；重复无水乙醇提取的操作两次，将最后一次获得的上清液进行减压浓缩即得。本发明中对亚麻籽总环肽的提取，不需要有毒试剂(乙腈)和柱层析的参与，使用甲醇水溶液对亚麻籽总环肽进行提取，具有操作简便、成本低、条件温和的优势。
Description
技术领域
本发明属于药物技术领域，具体涉及一种低环肽A含量的亚麻籽环肽混合物的制备方法。
背景技术
亚麻(Linum usitatissimum L.)又称胡麻，属于双子叶植物一年生或多年生草本植物。我国亚麻主要分布在华北、西北等地区，主要产区在甘肃、宁夏和山西等地区。我国亚麻籽目前年均产量仅次于加拿大，位居世界第二。近年来随着我国对健康食品需求的不断增长，消费市场对亚麻籽认可度显著上升，亚麻籽油中富含油酸、硬脂酸、棕榈酸及n-3系列多不饱和脂肪酸(α-亚麻酸含量80％左右)，对预防心血管疾病具有良好的生理作用，主要表现为降血脂、预防糖尿病、抗肿瘤、抗癌、抗炎、减缓更年期症状、改善骨质疏松症状、抗动脉粥样硬化等生理功能特性。
亚麻籽油中含有一类结构独特的疏水性环状多肽，其在油中含量约为0.5～2.0mg/g。亚麻籽环肽是存在于亚麻籽及亚麻籽油中的特色脂质伴随物，其环状结构不存在游离氨基，相比于线性环肽具有一定的稳定性，已报道具有多种生理功能和医药价值的环状多肽，在形成荷尔蒙、抗生素、离子载体系统、抗真菌素、癌制剂以及毒素等方面展现出丰富多样的生物活性，具有重大的应用价值。是未来的高附加值产品。环肽A是第一个从亚麻籽原油的沉淀物中分离出来的，随后发现的亚麻籽环肽，按照其发现顺序以字母表顺序依次命名：如1968年Weygand发现类似环肽B，在1997年至2001年又发现的7种天然环肽C-I(常见的亚麻籽环肽化学结构如图4-7所示)。
随着对环肽的研究进一步的深入，现已有多达30余种环肽被发现。大多数环肽含有易被氧化的蛋氨酸基团，其在氧化稳定性上有着独特的性质:如在亚麻籽油贮藏过程中，环肽含有蛋氨酸基团(环肽A除外)，巯基的存在使其对氧化较为敏感，是一种天然的抗氧化剂，在食品抗氧化及化妆品等方面具有较大的应用价值。环肽A(图7)作为亚麻籽环肽中较为独特的一种，其含量最高(在总环肽含量中约占25％左右)但不含有蛋氨酸基团，其抗氧化能力较低，对亚麻籽总环肽的抗氧化能力其负面作用，截止至目前，国内关于如何从亚麻籽总环肽中去除环肽A鲜有报道。
发明内容
为解决现有技术的缺点和不足之处，本发明提供一种低环肽A含量的亚麻籽环肽混合物的制备方法。
本发明的另一目的在于提供上述制备方法中获得环肽A含量低的亚麻籽环肽混合物。
本发明目的通过以下技术方案实现：
一种低环肽A含量的亚麻籽环肽混合物的制备方法，包括以下步骤：
1)亚麻籽的前处理：将粗筛选处理的亚麻籽粉碎，过筛并干燥，得到干燥亚麻籽粉；
2)含亚麻籽环肽的亚麻籽油提取：取步骤1)获得的干燥亚麻籽粉，采用固液萃取法，用丙酮提取3-8h，得到含有疏水性亚麻肽的亚麻籽油，减压浓缩，并用氮气或惰性气体对所得亚麻籽油进行抗氧化保护；
3)亚麻籽总环肽的提取：将步骤2)获得的亚麻籽油与甲醇水溶液混合后，萃取，然后将固液混合物进行离心，取上层清液减压浓缩，获得提取物；其中甲醇水溶液中甲醇与水的体积比例为4:6-2:8；
4)环肽A的脱除：往步骤3)中获得的提取物中加入无水乙醇，然后将混合物进行离心，收集取上层清液；
5)步骤4)获得的上层清液进行减压浓缩后，重复步骤的4)的操作两次，将最后一次获得的上清液进行减压浓缩后，为低环肽A含量的亚麻籽环肽混合物。
优选的，步骤1)中，所述过筛是指过60-80目筛；所述干燥是指在40-60℃干燥12-36h。
优选的，步骤2)中，丙酮提取的时间为6h。
优选的，步骤3)中，所述亚麻籽油与甲醇水溶液的体积比为1:1-1:5；所述萃取是指在25-50℃萃取0.5-1.5h；所述离心的转速为5500～6500rpm，离心的时间为5～10分钟。
优选的，步骤3)中甲醇与水的体积比例为4:6，亚麻籽油与甲醇水溶液的体积比为1:2。
优选的，步骤4)中提取物与无水乙醇的比例为1g：1-10mL；所述离心的转速为5500～6500rpm，离心的时间为5～10分钟。
更优选的，步骤4)中提取物与无水乙醇的比例为1g：1-7mL。
最优选的，步骤4)中提取物与无水乙醇比例为1g：2mL。
所述低环肽A含量的亚麻籽环肽混合物中环肽A的含量≤5％，优选的为≤3％。
与现有技术相比，本发明具有如下优点及有益效果：
1)本发明中对亚麻籽总环肽的提取，不需要有毒试剂(乙腈)和柱层析的参与，使用甲醇水溶液对亚麻籽总环肽进行提取，具有操作简便、成本低、条件温和的优势。
2)本发明中利用环肽A不含蛋氨酸、在无水乙醇中溶解性差的特点，使用无水乙醇析出的方式，降低了亚麻籽总环肽中环肽A的含量。相比传统方法涉及柱层析而言，操作简便，可大规模制备，能高效去除亚麻籽总环肽中抗氧化能力低、占比大的环肽A，所获得的环肽混合物具有相对更好的抗氧化活性。
附图说明
图1为实施例1中步骤3)所获的亚麻籽总环肽(提取物)液相色谱图。
图2为实施例1中经过步骤5)处理后低环肽A含量的亚麻籽环肽混合物的液相色谱图。
图3为实施例1中步骤4)中离心获得的沉淀物的液相色谱图。
图4-7为常见亚麻籽环肽的化学结构，其中图7为亚麻籽环肽A的化学结构。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。本发明涉及的原料均可从市场上直接购买。对于未特别注明的工艺参数，可参照常规技术进行。
本发明中涉及到的测定方法：
(1)产物中环肽A含量的测定
分析操作具体为：所制备的低环肽A含量的亚麻籽环肽混合物用乙腈溶解，制成0.1mg/mL溶液，使用0.45μm的滤膜过滤保存备用。柱型Kinetex
phenyl-hexyl column(2.6μm，150×4.6mm)，进样量10μL，流速：0.5mL/min，柱温25℃，紫外检测波长为214nm，流动相A、B分别为水和乙腈，梯度洗脱程序见表2-3。标准方程的建立：以乙腈为溶剂配制浓度50μg/mL的seg-A溶液，且配制不同浓度环肽A标准品溶液(10、50、100、300、500μg/mL)，并将seg-A与其混合，应用2.2.4中液相色谱条件进行液相分析。以单体峰面积与seg-A峰面积之比为X轴，环肽单体浓度为Y轴，得到线性回归方程，即环肽单体标准曲线方程。
(2)产物的抗氧化能力测定
所制得的低环肽A含量的环肽混合物的抗氧化能力，使用基于AOCS油脂加速氧化方法(Cd 12b-92)进行测定：仪器为OSI仪器(Omnion，ADM，Rockville，MD，USA)，将获得的低环肽A含量的亚麻籽环肽混合物，按2％的比例加入到5.0g亚麻籽油甘油三酯中，后将其加入到仪器的玻璃试管，通入100℃空气(130mL/min)进入加速氧化，当样品的电导率达到临界值后仪器自动停止，并记录时间(h)，该时间为样品的氧化诱导时间，其中空白样品(未加入环肽混合物的亚麻籽甘油三酯氧化诱导时间为2.3h。
实施例1
一种低环肽A含量的亚麻籽环肽制备方法，包括以下步骤：
1)亚麻籽的前处理：将粗筛选处理的亚麻籽，经粉碎机粉碎后，过80目筛，将过筛后亚麻籽粉置于烘箱中，40℃干燥12h，得干燥的亚麻籽粉；
2)含亚麻籽环肽的亚麻籽油提取：取适量的步骤1)获得的干燥亚麻籽粉，采用固液萃取法，丙酮提取6h，得到含有疏水性亚麻肽的亚麻籽油，减压浓缩，并用惰性气体对所得亚麻籽油进行抗氧化保护；
3)亚麻籽总环肽的提取：将步骤2)中获得的亚麻籽油与甲醇水溶液(甲醇：水体积比例为4:6)按体积比1:2混合后，在温度25℃下萃取时间为1h，后将固液混合物进行离心，离心转速为6500rpm，离心时间为10分钟，取上层清液减压浓缩，获得提取物；
4)环肽A的脱除：往步骤3)中获得的提取物中加入无水乙醇，提取物与无水乙醇比例为1g：2mL，然后将混合物进行离心，离心转速为6500rpm，离心时间为10分钟，收集上层清液；
5)步骤4)获得的上层清液进行减压浓缩后，重复步骤的4)的操作两次，将最后一次获得的上清液进行减压浓缩后，为低环肽A含量的亚麻籽环肽混合物。
经高效液相检测，步骤5)获得的亚麻籽环肽混合物中环肽A含量为3.0％wt.，加入亚麻籽甘油三酯后油脂氧化诱导时间为4.0h，环肽混合物收率71.6％。其中的环肽混合物收率是指步骤5)获得的亚麻籽环肽混合物质量与步骤3)中获得的提取物的质量之比。
参照上述步骤，改变步骤4)中提取物与无水乙醇的比例，检测最终得到的亚麻籽环肽混合物中环肽A的含量以及环肽混合物收率，结果如下所示：
实施例2
1)亚麻籽的前处理：将粗筛选处理的亚麻籽，经粉碎机粉碎后，过80目筛，将过筛后亚麻籽粉置于烘箱中，60℃干燥36h，得干燥的亚麻籽粉；
2)含亚麻籽环肽的亚麻籽油提取：取适量的步骤1)获得的干燥亚麻籽粉，采用固液萃取法，丙酮提取3-8h，得到含有疏水性亚麻肽的亚麻籽油，减压浓缩，并用惰性气体对所得亚麻籽油进行抗氧化保护；
3)亚麻籽总环肽的提取：将步骤2)中获得的亚麻籽油与甲醇水溶液(甲醇：水体积比例为3:7)按体积比1:1混合后，在温度40℃下萃取时间为1h，后将固液混合物进行离心，离心转速为5500rpm，离心时间为10分钟，取上层清液减压浓缩，获得提取物；
4)环肽A的脱除：往步骤3)中获得的提取物中加入无水乙醇，提取物与无水乙醇比例为1g：7mL，然后将混合物进行离心，离心转速为5500rpm，离心时间为10分钟，收集上层清液；
5)步骤4)获得的上层清液进行减压浓缩后，重复步骤的4)的操作两次，将最后一次获得的上清液进行减压浓缩后，为低环肽A含量的亚麻籽环肽混合物。
经高效液相检测，步骤5)获得的亚麻籽环肽混合物中环肽A含量为4.1％wt.,加入亚麻籽甘油三酯后油脂氧化诱导时间为3.2h，环肽混合物收率77.4％。
实施例3
1)亚麻籽的前处理：将粗筛选处理的亚麻籽，经粉碎机粉碎后，过80目筛，将过筛后亚麻籽粉置于烘箱中，50℃干燥24h，得干燥的亚麻籽粉；
2)含亚麻籽环肽的亚麻籽油提取：取适量的步骤1)获得的干燥亚麻籽粉，采用固液萃取法，丙酮提取5h，得到含有疏水性亚麻肽的亚麻籽油，减压浓缩，并用惰性气体对所得亚麻籽油进行抗氧化保护；
3)亚麻籽总环肽的提取：将步骤2)中获得的亚麻籽油与甲醇水溶液(甲醇：水体积比例为2:8)按体积比1:3混合后，在温度50℃下萃取时间为1.5h，后将固液混合物进行离心，离心转速为6000rpm，离心时间为10分钟，取上层清液减压浓缩，获得提取物；
4)环肽A的脱除：往步骤3)中获得的提取物中加入无水乙醇，提取物与无水乙醇比例为1g：10mL，然后将混合物进行离心，离心转速为6000rpm，离心时间为10分钟，收集上层清液；
5)步骤4)获得的上层清液进行减压浓缩后，重复步骤的4)的操作两次，将最后一次获得的上清液进行减压浓缩后，为低环肽A含量的亚麻籽环肽混合物。
经高效液相检测，步骤5)获得的亚麻籽环肽混合物中环肽A含量为4.7％wt.,加入亚麻籽甘油三酯后油脂氧化诱导时间为3.0h，环肽混合物收率87.2％。
实施例4
1)亚麻籽的前处理：将粗筛选处理的亚麻籽，经粉碎机粉碎后，过60目筛，将过筛后亚麻籽粉置于烘箱中，40℃干燥24h，得干燥的亚麻籽粉；
2)含亚麻籽环肽的亚麻籽油提取：取适量的步骤1)获得的干燥亚麻籽粉，采用固液萃取法，丙酮提取8h，得到含有疏水性亚麻肽的亚麻籽油，减压浓缩，并用惰性气体对所得亚麻籽油进行抗氧化保护；
3)亚麻籽总环肽的提取：将步骤2)中获得的亚麻籽油与甲醇水溶液(甲醇：水体积比例为4:6)按体积比1:2混合后，在温度45℃下萃取时间为1.5h，后将固液混合物进行离心，离心转速为6500rpm，离心时间为5分钟，取上层清液减压浓缩，获得提取物；
4)环肽A的脱除：往步骤3)中获得的提取物中加入无水乙醇，提取物与无水乙醇比例为1g：5mL，然后将混合物进行离心，离心转速为6500rpm，离心时间为5分钟，收集上层清液；
5)步骤4)获得的上层清液进行减压浓缩后，重复步骤的4)的操作两次，将最后一次获得的上清液进行减压浓缩后，为低环肽A含量的亚麻籽环肽混合物。
经高效液相检测，步骤5)获得的亚麻籽环肽混合物中环肽A含量为3.5％wt.,加入亚麻籽甘油三酯后油脂氧化诱导时间为3.8h，环肽混合物收率77.4％。
最优实施例液相色谱图
图1为实施例1中步骤3)所获的亚麻籽总环肽(提取物)液相色谱图，经测定环肽A的含量为25.2％wt.，图2为实施例1中经过步骤5)处理后低环肽A含量的亚麻籽环肽混合物的液相色谱图，其环肽含量为3.0％wt.，图3为实施例1中步骤4)中离心获得的沉淀物的液相色谱图，其中环肽A的含量为86.1％wt.。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种低环肽A含量的亚麻籽环肽混合物的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)亚麻籽的前处理：将粗筛选处理的亚麻籽粉碎，过筛并干燥，得到干燥亚麻籽粉；
2)含亚麻籽环肽的亚麻籽油提取：取步骤1)获得的干燥亚麻籽粉，采用固液萃取法，用丙酮提取3-8h，得到含有疏水性亚麻肽的亚麻籽油，减压浓缩，并用氮气或惰性气体对所得亚麻籽油进行抗氧化保护；
3)亚麻籽总环肽的提取：将步骤2)获得的亚麻籽油与甲醇水溶液混合后，萃取，然后将固液混合物进行离心，取上层清液减压浓缩，获得提取物；其中甲醇水溶液中甲醇与水的体积比例为4:6-2:8；
4)环肽A的脱除：往步骤3)中获得的提取物中加入无水乙醇，然后将混合物进行离心，取上层清液；提取物与无水乙醇的比例为1g：1-10mL；
5)步骤4)获得的上层清液进行减压浓缩后，重复步骤的4)的操作两次，将最后一次获得的上清液进行减压浓缩后，为低环肽A含量的亚麻籽环肽混合物。
2.根据权利要求1所述的一种低环肽A含量的亚麻籽环肽混合物的制备方法，其特征在于，步骤1)中，所述过筛是指过60-80目筛；所述干燥是指在40-60℃干燥12-36h。
3.根据权利要求1所述的一种低环肽A含量的亚麻籽环肽混合物的制备方法，其特征在于，步骤2)中，丙酮提取的时间为6h。
4.根据权利要求1所述的一种低环肽A含量的亚麻籽环肽混合物的制备方法，其特征在于，步骤3)中，所述亚麻籽油与甲醇水溶液的体积比为1:1-1:5；所述萃取是指在25-50℃萃取0.5-1.5h；所述离心的转速为5500～6500rpm，离心的时间为5～10分钟。
5.根据权利要求1所述的一种低环肽A含量的亚麻籽环肽混合物的制备方法，其特征在于，步骤3)中甲醇与水的体积比例为4:6，亚麻籽油与甲醇水溶液的体积比为1:2。
6.根据权利要求1所述的一种低环肽A含量的亚麻籽环肽混合物的制备方法，其特征在于，步骤4)中提取物与无水乙醇的比例为1g：1-7mL；所述离心的转速为5500～6500rpm，离心的时间为5～10分钟。
7.根据权利要求1所述的一种低环肽A含量的亚麻籽环肽混合物的制备方法，其特征在于，步骤4)中提取物与无水乙醇比例为1g：2mL。
8.一种由权利要求1-7任一项所述方法制得的低环肽A含量的亚麻籽环肽混合物，其特征在于，所述低环肽A含量的亚麻籽环肽混合物中环肽A的含量≤5％。
9.根据权利要求8所述的低环肽A含量的亚麻籽环肽混合物，其特征在于，述低环肽A含量的亚麻籽环肽混合物中环肽A的含量≤3％。
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