CN115746157B

CN115746157B - 一种美味扇菇多糖及其制备方法和用途

Info

Publication number: CN115746157B
Application number: CN202211484250.8A
Authority: CN
Inventors: 刘洋; 王�琦; 王子璇; 随玉; 戴映迪
Original assignee: Jilin Agricultural University
Current assignee: Jilin Agricultural University
Priority date: 2022-11-24
Filing date: 2022-11-24
Publication date: 2023-08-08
Anticipated expiration: 2042-11-24
Also published as: CN115746157A; ZA202300229B

Abstract

本发明公开了一种美味扇菇多糖及其制备方法和用途，属于天然药物开发领域。该美味扇菇多糖包括半乳糖、甘露糖、葡萄糖和岩藻糖，分别占所述美味扇菇多糖的摩尔百分比为48.27％、26.02％、16.26％和9.03％；其构型组成包括α构型和β构型，分子量为42280.41Da。本发明通过实验证实该多糖具有免疫调节活性，可以使巨噬细胞的增殖与吞噬能力增强，并且使ROS、NO、白细胞介素以及炎症因子的分泌能力提高，明显上调p‑p65蛋白表达，可用于制备提高机体免疫力的药物，为美味扇菇后续的开发和利用提供研究基础，具有重要的经济价值和市场价值。

Description

一种美味扇菇多糖及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及天然药物开发领域，特别是涉及一种美味扇菇多糖及其制备方法和用途。

背景技术

巨噬细胞具有清除细胞碎片及病原体、产生细胞因子和其他调节因子、维持体内稳态等多种功能，是机体中重要的免疫细胞。多糖是真菌中重要的活性成分，大量研究表明，食药用菌多糖如裂褶菌多糖、羊肚菌多糖等可调节免疫细胞，促进其细胞因子的产生，增强其吞噬作用，进而提高机体免疫能力。因此多糖在药物开发上具有重要应用价值。

美味扇菇(Sarcomyxa edulis)隶属于担子菌门、蘑菇纲、蘑菇目、小菇科、美味扇菇属。中医认为，美味扇菇性甘、温，还具有祛风活络、清热祛湿的作用，其味道鲜美，肉质肥厚，具有较高的营养和药用价值，是重要的天然药物资源。目前，对美味扇菇的巨噬细胞免疫活性研究尚未见报道。因此，对其进行药用价值的开发和利用具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种美味扇菇多糖及其制备方法和用途，以解决上述现有技术存在的问题，该美味扇菇多糖具有免疫调节活性，可用于制备提高机体免疫力的药物，为美味扇菇后续的开发和利用提供研究基础，具有重要的经济价值和市场价值。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种美味扇菇多糖，包括半乳糖、甘露糖、葡萄糖和岩藻糖，分别占所述美味扇菇多糖的摩尔百分比为48.27％、26.02％、16.26％和9.03％。

进一步地，所述美味扇菇多糖的分子量为42280.41Da。

进一步地，所述美味扇菇多糖的构型组成包括α构型和β构型。

本发明还提供一种所述的美味扇菇多糖的制备方法，包括以美味扇菇为原料，通过热水浸提、乙醇沉淀和离子交换层析纯化，得到所述美味扇菇多糖的步骤。

进一步地，具体步骤如下：

(1)将美味扇菇菌粉通过热水浸提，浓缩后，加入无水乙醇进行沉淀，取沉淀冻干得美味扇菇样品；

(2)将美味扇菇样品经2-3次sevag试剂去除蛋白，再经透析袋透析除杂后，浓缩冷冻干燥获得美味扇菇粗多糖；

(3)将获得的美味扇菇粗多糖经2次离子交换层析法纯化，获得所述美味扇菇多糖。

进一步地，在步骤(1)中，所述热水浸提的条件：温度为80℃，料液比为1g：30mL，时间为3h；所述浓缩是将提取液浓缩至原浓度1/4。

进一步地，在步骤(2)中，所述美味扇菇样品加入去离子水溶解后，以体积比1:1加入sevag试剂振荡30min，离心去除蛋白，再采用相同方法再次去除蛋白。

进一步地，在步骤(3)中，第一次离子交换层析法具体为：将美味扇菇粗多糖加水溶解后，上样至DEAE-52纤维素凝胶柱，依次用0-0.3mol/L NaCl进行洗脱；第二次离子交换层析法具体为：采用Sephacryl S-400葡聚糖凝胶柱纯化，洗脱液为0.15mol/NaCl，洗脱速度为0.5mL/min。

本发明还提供一种提高机体免疫力的药物组合物或保健品，包含所述的美味扇菇多糖。

本发明还提供一种所述的美味扇菇多糖在制备提高机体免疫力药物中的应用，所述药物通过增强机体巨噬细胞的增殖、吞噬和分泌能力，以及上调NF-κB信号通路中p-p65蛋白的表达，发挥提高机体免疫力的功效。

本发明公开了以下技术效果：

本发明首次从天然菌物美味扇菇中获得具有新颖结构和多种生物活性的多糖SEP-0a。通过实验证实该多糖具有免疫调节活性，可以使巨噬细胞的增殖与吞噬能力增强，并且使ROS、NO、白细胞介素以及炎症因子的分泌能力提高，明显上调p-p65蛋白表达，可用于制备提高机体免疫力的药物，为美味扇菇后续的开发和利用提供研究基础，具有重要的经济价值和市场价值。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明美味扇菇多糖洗脱曲线；(A)DEAE-52洗脱曲线，(B)Sephacry S–400洗脱曲线；

图2为本发明SEP-0a单糖组成分析；

图3为本发明SEP-0a分子量分析；

图4为本发明SEP-0a红外光谱分析；

图5为本发明SEP-0a体外免疫活性:(A)巨噬细胞增殖率；(B)巨噬细胞吞噬作用；(C)巨噬细胞分泌ROS；(D)巨噬细胞分泌NO；(E)巨噬细胞分泌TNF-α；(F)巨噬细胞分泌IL-1β；(G)巨噬细胞分泌IL-6(*：p<0.05，与空白组相比显著；**：p<0.01，与空白组相比极显著)；

图6为本发明SEP-0a对RAW264.7细胞在使用NF-κB特异阻断剂后的促进作用：(A)对NO的释放的影响；(B)对TNF-α的释放的影响；(C)对IL-1β的释放的影响；(D)对IL-6的释放的影响(**：p<0.01，与空白组相比极显著；##：p<0.01，与SEP-0a组相比极显著；#：p<0.05，与SEP-0a组相比显著)；

图7为本发明SEP-0a对巨噬细胞NF-κB通路p-p65蛋白表达的影响释放的影响(**：p<0.01，与空白组相比极显著)。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

实施例1美味扇菇多糖提取物的制备

将美味扇菇子实体烘干，粉碎过100目筛，将美味扇菇菌粉在80℃热水，液料比为1:30(g/mL)条件下提取3h；提取液浓缩至原浓度1/4，加入无水乙醇至终浓度75％，4℃封口静置过夜，6000r/min离心15min去上清，沉淀冻干后备用；

将冻干的多糖样品加入去离子水溶解，按照体积比1:1加入sevag试剂(正丁醇：三氯甲烷＝1:4，v/v)在水平摇床上150rpm/min振荡30min，使样品中的蛋白质变性成不溶状态，用离心法除去，再重复加入sevag试剂一次，重复上述步骤；再通过3500Da截留量透析袋透析去除小分子后，旋转蒸发仪浓缩，并通过冷冻干燥机对其冷冻干燥获得美味扇菇多糖SEP；

将SEP用去离子水溶解，上样至DEAE-52纤维素凝胶柱(1.8cm×25cm)，依次用蒸馏水、0.1mol/L、0.3mol/L NaCl进行洗脱，洗脱速度为1mL/min，每管收集6mL，通过苯酚-硫酸法测定多糖含量将含有多糖部分收集，获得多糖组分SEP-0，进一步将SEP-0上样至Sephacryl S-400葡聚糖凝胶柱，0.15mol/NaCl，洗脱速度为0.5mL/min条件下洗脱，收集多糖部分，透析后，冻干获得美味扇菇多糖提取物SEP-0a(图1)。

实施例2美味扇菇多糖SEP-0a单糖组成分析

多糖样品的水解：准确称取SEP-0a 5mg，加入已配制好的2mol/L三氟乙酸溶液，充分振摇，使其混匀，121℃下加热2h，通入N₂，随后对样品进行干燥得到水解后的多糖样品。

单糖标准液的配制以及混合标准液的配制：先依次将岩藻糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、鼠李糖、木糖、甘露糖、果糖、核糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸各100mg加入到加有8mL无菌水的干净的EP管中，先使其溶解，然后于容量瓶中定容至10mL，各个标品配制成10mg/mL的标准品母液。然后将上述混标准品母液稀释100倍，成为0.1mg/mL的标品工作液。

将所有准备好的糖溶液用0.22μm滤膜过滤后转入色谱瓶中，通过离子交换色谱进行检测，流动相：A相：H₂O；B相：100mM NaOH，进样量为20μL，流速：0.5mL/min。

结果表明，美味扇菇多糖SEP-0a主要由半乳糖、甘露糖、葡萄糖、岩藻糖组成，摩尔百分比为48.27％，26.02％，16.26％，9.03％(图2)。

实施例3美味扇菇多糖SEP-0a的多糖含量测定

将葡萄糖标准品于90℃条件下烘干至恒重，精确称取1.000g，用蒸馏水定容于容量瓶，使之为配制好的10mg/mL的标品母液，准确吸取后定容为1mg/mL的葡萄糖标品溶液，分别精密移取0、10、20、30、40、50、60、70、80μL至管中，并分别补充蒸馏水至200μL，并单独取EP管，加入0.25mg/mL的SEP-0a多糖溶液200μL后，每管分别加入5％苯酚溶液100μL，混匀，迅速缓慢加入浓硫酸0.5mL，混匀后，静置30min后冷却至室温，于96孔板每个样品200μL，酶标仪检测OD₄₉₀值后，根据葡萄糖标准曲线计算多糖含量。结果显示美味扇菇多糖含量为81.67％。

实施例4美味扇菇多糖SEP-0a的多糖分子量检测

通过高效凝胶渗透色谱法，测定SEP-0a的分子量分布，准确称取5mg的SEP-0a组分，加入去离子水1mL，配制为5mg/mL的多糖溶液，使用0.22μm水系滤膜对其进行过滤，进样量为10μL，按照色谱条件进行洗脱并记录保存色谱图。

利用高效凝胶渗透色谱法对Sephacryl S-400凝胶柱层析收集到的组分进行均一性及分子量测定。选用的色谱条件为：检测器为RID-10A视差折光检测器，TSK-gel G-3000PWXL色谱柱(7.8×300mm)，柱温为35℃，0.2mol/L的氯化钠水溶液作为流动相，0.6mL/min的流速进行洗脱。结果如图3所示，该多糖分子量为42280.41Da。

实施例5美味扇菇多糖SEP-0a的红外光谱分析

将1.9mg多糖样品SEP-0a与190.0mg KBr粉末充分混匀后进行压片，4000-400cm^-1的波长频率范围内，置于傅里叶变换红外光谱仪进行扫描测定，重复3次，取平均光谱。采用傅里叶变换红外光谱分析。

结果如图4所示，结果表明SEP-0a在3388cm^-1信号峰是由O-H伸缩振动引起的；2929cm^-1周围的吸收峰是因为C-H的伸缩振动；1353cm^-1、1147cm^-1和1074cm^-1处的吸收峰代表含有吡喃糖环；872cm^-1处表示了β-D-吡喃糖的特征吸收峰；575cm^-1附近的吸收峰表示有α构型存在。

通过以下试验证明本发明美味扇菇多糖的医用用途：

试验例1美味扇菇多糖SEP-0a对巨噬细胞raw264.7的体外免疫调节活性

1.巨噬细胞存活率检测

采用CCK-8法检测SEP-0a对巨噬细胞存活率的影响。取RAW264.7细胞稀释为2.5×10⁴个/mL接种于96孔板，在5％ CO₂恒温培养箱中培养12h，弃去上清，设置6个给药组进行给药，分别为空白对照组(DMEM基础培养液)、SEP-0a不同浓度给药组(50μg/mL、100μg/mL、500μg/mL、1500μg/mL)、阳性对照组(LPS 1μg/mL)，继续培养24h，吸掉培养液，加入CCK-8(CCK-8与DMEM基础培养液以1:10的比例混合)100μL，5％ CO₂培养箱避光培养45min，在450nm处测定吸光度值，并计算细胞存活率。

2.巨噬细胞吞噬作用检测

采用中性红法检测SEP-0a对巨噬细胞吞噬作用的影响。取密度为5000个/孔的RAW264.7细胞接种于96孔板，于5％ CO₂恒温培养箱中培养24h，弃去上清，设置6个给药组进行给药，分别为空白对照组(DMEM基础培养液)、SEP-0a不同浓度给药组(50μg/mL、100μg/mL、500μg/mL、1500μg/mL)、阳性对照组(LPS 1μg/mL)，继续培养24h，吸掉培养液。加入配制好的0.1％中性红染液100μL，37℃的5％ CO₂培养箱避光培养60min，弃上清，用PBS(200μL/孔)进行清洗，重复3次，100μL细胞裂解液/孔，避光裂解2h，在540nm处测定吸光度值。

3.巨噬细胞产生ROS能力检测

采用2’,7’-二氯荧光黄双乙酸盐(DCFH-DA)荧光探针法检测SEP-0a对巨噬细胞产生ROS的影响。取RAW264.7细胞稀释为5×10⁴个/mL接种于96孔板，在5％ CO₂恒温培养箱中培养12h，弃去上清，设置6个给药组进行给药，分别为空白对照组(DMEM基础培养液)、SEP-0a不同浓度给药组(50μg/mL、100μg/mL、500μg/mL、1500μg/mL)、阳性对照组(LPS 1μg/mL)，继续培养24h，吸掉培养液，每孔加入DCFH-DA 200μL，于37℃恒温培养箱中孵育培养20min，用基础培养液(不含血清)洗涤3次，加入200μL基础培养液，在激发波长为488nm，发射波长为525nm的条件下进行荧光强度检测。

4.巨噬细胞分泌NO能力检测

采用一氧化氮法检测SEP-0a对RAW264.7细胞分泌NO影响。取RAW264.7细胞稀释为2.5×10⁵个/mL接种于96孔板，在5％ CO₂恒温培养箱中培养12h，弃去上清，设置6个给药组进行给药，分别为空白对照组(DMEM基础培养液)、SEP-0a不同浓度给药组(50μg/mL、100μg/mL、500μg/mL、1500μg/mL)、阳性对照组(LPS 1μg/mL)，继续培养24h，吸掉培养液，每孔50μL分别将6组点在新的96孔板中，将标准品用DMEM基础培养液进行稀释，每孔50μL，每组4个复孔，每孔分别先加入Griess ReagentⅠ50μL，然后立即加入Griess ReagentⅡ50μL，在540nm处测定吸光度值。

5.巨噬细胞分泌TNF-α、IL-1β以及IL-6能力检测

采用ELISA法检测SEP-0a对RAW264.7细胞分泌TNF-α、IL-1β以及IL-6的影响。取密度为5000个/孔的RAW264.7细胞接种于96孔板，于5％ CO₂恒温培养箱中培养24h，弃去上清，设置6个给药组进行给药，分别为空白对照组(DMEM基础培养液)、SEP-0a不同浓度给药组(50μg/mL、100μg/mL、500μg/mL、1500μg/mL)、阳性对照组(LPS 1μg/mL)，继续培养24h，吸掉培养液，转移至新的无菌离心管中，2500r/min离心20min，取上清待测。根据说明书说明，使用ELISA试剂盒对TNF-α、IL-1β以及IL-6进行测定，在450nm处测定吸光度值。

美味扇菇多糖SEP-0a对巨噬细胞体外免疫活性调节的结果如图5所示，结果表明经过美味扇菇多糖SEP-0a给药后，RAW264.7细胞的增殖与吞噬能力、产生ROS与NO的能力以及对TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌能力都显著提升，并且在浓度为1500μg/mL时，增殖与吞噬能力和对ROS、NO、白细胞介素以及炎症因子的分泌能力达到最强，始终呈剂量依赖性。这些结果说明美味扇菇多糖可以激活巨噬细胞RAW264.7，并且有较强的体外免疫调节活性。

试验例2美味扇菇多糖SEP-0a对巨噬细胞raw264.7的NF-κB通路的影响

1.巨噬细胞在使用NF-κB特异阻断剂后的促进作用检测

取RAW264.7细胞稀释为2.5×10⁵个/mL接种于96孔板，在5％ CO₂恒温培养箱中培养12h，弃去上清，设置4个给药组进行给药，其中一组加入用基础培养液稀释为10μM的BAY11-7082抑制剂100μL，其他几组分别加入100mL DMEM基础培养，37℃下的5％ CO₂恒温培养箱中孵育培养1h，取出后弃去上清，其中加入BAY11-7082的一组在弃去上清以后，加入SEP-0a 500μg/mL，其他三组加入空白对照组、阳性对照组、SEP-0a 500μg/mL，放回培养箱继续培养24h，后吸取上清于无菌离心管中，在2500r/min下离心20min。NO与细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6的检测方法同上。

2.巨噬细胞NF-κB通路p-p65蛋白表达的测定

采用Western blot法检测SEP-0a对巨噬细胞NF-κB通路p-p65蛋白表达的影响。取密度为1×10⁶个/孔的RAW264.7细胞接种于6孔板，于5％ CO₂恒温培养箱中培养23h，弃去上清，按要求加入BAY11-7082和DMEM基础培养液后培养1h，弃去上清，设置8个给药组进行给药，其中分别为空白对照组(DMEM基础培养液)、阳性对照组(LPS 1μg/mL)、SEP-0a不同浓度给药组(50μg/mL、100μg/mL、500μg/mL、1500μg/mL)、500μg/mL SEP-0a(加入10μM BAY11-7082孵育过的一组)、抑制剂组(10μM BAY11-7082孵育过的另一组与DMEM基础培养液)，继续培养24h，弃上清，PBS洗涤两次后将细胞悬液转移至离心管中，4℃1200r/min离心5min，弃去PBS，加入RIPA裂解液于离心管内3-5min。冰上裂解30min，然后进行12000rpm/min，4℃，离心10min，收集上清，即为总蛋白溶液。

采用BCA法测定蛋白，加入5×上样缓冲液，沸水浴煮沸15min，于－20℃保存备用。将蛋白样品进行SDS-PAGE电泳，电转移至PVDF膜。加入5％的脱脂牛奶室温封闭30min，加入一抗(1:1000)，4℃孵育摇床过夜。在TBST中快速洗脱(5min×3)，加入二抗(1:5000)，摇床慢摇，室温孵育30min，在TBST中快速洗脱(5min×3)。采用ECL化学发光法检测目的条带的信号强度，根据不同的发光强度调整曝光条件，保存成像。

实验结果如图6和图7所示，巨噬细胞RAW264.7在加入BAY11-7082处理后，与SEP-0a组(500μg/m)比，其NO、TNF-α、IL-1β以及IL-6的释放量均明显降低，并且伴随剂量依赖性。而BAY11-7082处理后加入SEP-0a(BAY11-7082+500μg/mL组)相比于BAY11-7082组，可以明显上调p-p65蛋白表达，而单独加入BAY11-7082抑制剂后，则抑制NF-κB信号通路中p-p65蛋白的高表达，使其表达下调明显。说明美味扇菇多糖SEP-0a可以调节巨噬细胞RAW264.7的NF-κB通路，并影响其p-p65蛋白的表达。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims

1.一种美味扇菇多糖，其特征在于，包括半乳糖、甘露糖、葡萄糖和岩藻糖，分别占所述美味扇菇多糖的摩尔百分比为48.27％、26.02％、16.26％和9.03％；

所述美味扇菇多糖的分子量为42280.41Da；

所述美味扇菇多糖的构型组成包括α构型和β构型。

2.一种权利要求1所述的美味扇菇多糖的制备方法，其特征在于，包括以美味扇菇为原料，通过热水浸提、乙醇沉淀和离子交换层析纯化，得到所述美味扇菇多糖的步骤；

具体步骤如下：

(3)将获得的美味扇菇粗多糖经2次离子交换层析法纯化，获得所述美味扇菇多糖；

在步骤(1)中，所述热水浸提的条件：温度为80℃，料液比为1g：30mL，时间为3h；所述浓缩是将提取液浓缩至原浓度1/4。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述美味扇菇样品加入去离子水溶解后，以体积比1:1加入sevag试剂振荡30min，离心去除蛋白，再采用相同方法再次去除蛋白。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，在步骤(3)中，第一次离子交换层析法具体为：将美味扇菇粗多糖加水溶解后，上样至DEAE-52纤维素凝胶柱，依次用0-0.3mol/LNaCl进行洗脱；第二次离子交换层析法具体为：采用SephacrylS-400葡聚糖凝胶柱纯化，洗脱液为0.15mol/L NaCl，洗脱速度为0.5mL/min。

5.一种提高机体免疫力的药物组合物，其特征在于，包含权利要求1所述的美味扇菇多糖。

6.一种权利要求1所述的美味扇菇多糖在制备提高机体免疫力药物中的应用，其特征在于，所述药物通过增强机体巨噬细胞的增殖、吞噬和分泌能力，以及上调NF-κB信号通路中p-p65蛋白的表达，发挥提高机体免疫力的功效。