CN107383040B

CN107383040B - 一种从早香柚油胞层中分离纯化佛手柑素的方法

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Publication number: CN107383040B
Application number: CN201710543355.9A
Authority: CN
Inventors: 李鲜; 刘意隆; 孙崇德
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2017-07-05
Filing date: 2017-07-05
Publication date: 2019-06-07
Anticipated expiration: 2037-07-05
Also published as: CN107383040A

Abstract

本发明提供一种从早香柚油胞层中分离纯化佛手柑素的方法，采用硅胶柱色谱和高速逆流色谱(HSCCC)联用技术，以早香柚油胞层冷干粉为原料，先制备硅胶粗提物粉末，再经HSCCC进一步分离纯化得到高纯度的佛手柑素。本发明工艺简单，不需要惰性气体保护及高温高压；生产周期短，流程安全、易操作；整个过程使用HPLC精确定量，准确度高；提取和HSCCC所用溶剂可回收后反复使用，成本低。本发明纯化的产物纯度高，回收率高，最终纯化得到的佛手柑素纯度≥94％，适用于科学研究和工业化生产。

Description

一种从早香柚油胞层中分离纯化佛手柑素的方法

技术领域

本发明属于天然植物中有效成分的提取分离纯化技术领域，具体涉及一种从早香柚油胞层中分离纯化佛手柑素的方法，是一种以早香柚油胞层为原料，采用硅胶柱和HSCCC联用技术分离纯化佛手柑素的方法。

背景技术

佛手柑素(bergamottin)，别名佛手柑亭、香柠檬亭、香柠檬素，分子式：C₂₁H₂₂O₄，分子量：338.40，CAS号：7380-40-7，存在于佛手、柚类、葡萄柚等柑橘属水果以及一些传统中药材如羌活中，不溶于水，能溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯等有机溶剂。结构式如下：

佛手柑素是一种天然的呋喃香豆素类化合物。药学活性研究表明，佛手柑素能使细胞色素P450酶系中多种药物代谢相关酶失活，从而影响胃肠道对药物的吸收，增加口服药物的生物利用度。此外，佛手柑素还能抑制癌细胞的增殖、侵袭和迁移，具有抗癌、抗菌、防诱变等多种生物学活性，受到广泛关注。然而，市面上高纯度佛手柑素售价昂贵且稀少，因此绝大多数活性研究仅限于体外细胞实验，进一步的体内代谢研究却相对较少。关于“从天然植物中快速有效地提取分离纯化佛手柑素”的研究也少见报道。

柚子是我国南方地区盛产的一种水果，然而占整果43％～48％的柚皮在鲜食或食品加工过程中却通常被丢弃，这不仅造成严重的资源浪费，还导致环境污染。研究从柚皮中提取高纯度的佛手柑素，可进一步加强柚皮资源的开发利用，降低生产成本，提高原料利用率，并为佛手柑素的药学活性研究及其相关作用机理研究提供工作基础和技术支持，最大程度地提高柚子的附加值。

发明内容

本发明的目的是提供一种从早香柚油胞层中分离纯化佛手柑素的方法，通过以下步骤实现：

(1)制备硅胶粗提物粉末：一定质量烘干的早香柚油胞层粉末用石油醚(60～90℃)按固液比1:20超声提取两次，过滤后合并两次滤液，在旋转蒸发仪上蒸干得浸膏，与适量硅胶拌样，挥干后制成上样粉末，按上样量与硅胶用量为1g:50g的比例装柱，加入上样粉末后的硅胶柱用石油醚-乙酸乙酯(13:1)溶液洗脱佛手柑素，合并含有佛手柑素的洗脱液，在旋转蒸发仪上40℃蒸干得硅胶粗提物粉末；

(2)分离纯化佛手柑素：配制己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(1:1:2:0.625)溶剂体系，充分摇匀静置1h后，分别接出上、下相，超声脱气30min，上相为固定相，下相为流动相。固定相先以30mL/min流速泵入高速逆流色谱(HSCCC)，稳定后，将逆流色谱仪的转速调至900rpm，同时流动相以2mL/min速度通过HSCCC，待流出液分层(即流出的固定相体积恒定)后，将硅胶粗提物溶于适量固定相进样(进样浓度约为12mg/ml)，根据检测图谱分管收集各组分，用高效液相色谱(HPLC)测定各管纯度，合并含有单一佛手柑素的各管，在旋转蒸干仪上蒸干即得到高纯度佛手柑素，回收率≥65％，产品纯度均≥94％。本发明纯化得到的佛手柑素经过HPLC和质谱(MS)鉴定，与文献报道一致。

本发明采用硅胶柱和HSCCC联用技术，以早香柚油胞层烘干粉末为原料分离纯化得到高纯度的佛手柑素。本发明有如下优点：(1)工艺简单，不需要惰性气体保护及高温高压；(2)生产流程较安全、易操作；(3)生产周期较短；(4)纯化的产物纯度高，回收率高；(5)整个过程使用HPLC精确定量，保证准确度；(6)提取和HSCCC所用溶剂可回收后重复使用，成本低。

附图说明

图1为本发明的工艺流程图。

图2为早香柚油胞层粗提液HPLC检测图谱。

图3为硅胶柱纯化所得样品的HPLC检测图谱。

图4为硅胶柱纯化后的样品经HSCCC进一步纯化后的HPLC检测图谱。

图5为实施例2的HSCCC分离图谱。

图6为实施例3的HSCCC分离图谱。

图7为实施例4的HSCCC分离图谱。

图8为硅胶柱和HSCCC联用技术分离纯化得到的佛手柑素单体质谱鉴定图谱。

具体实施方式

本发明结合附图和实施例作进一步的说明。

实施例1：本发明通过以下试验进行影响因素的筛选确定

1、纯化材料的选择

将收集到的7个柚类品种的油胞层冷冻干燥后用磨样罐磨成细小的粉末。精确称取一定量的冷冻干燥粉末，用石油醚(60～90℃)按固液比1:20超声提取两次，过滤后合并两次滤液，将滤液蒸干，得到的浸膏再溶于适量色谱甲醇中，用于佛手柑素的HPLC分析。HPLC流动相包括纯水(A)和色谱乙腈(B)，采用0-1min:10％B,1-5min:10-80％B,5-10min:80％B,10-12min:80-95％B,12-15min:95％B,15-19min:95-10％B,19-21min:10％B梯度洗脱，流速为1ml/min，固定相为WatersC18分析柱(4.6×250mm，5μm)，柱温为室温，检测波长250nm。结果表明在各品种柑橘属果实中，早香柚果实油胞层中佛手柑素含量最高(表1)。

表1

2、提取溶剂的选择

称取一定量的早香柚油胞层冷冻干燥粉末，分别溶于选定的5种有机溶剂中(固液比1：20)，超声提取两次，10000rpm离心10min后，合并两次上清液，用于佛手柑素的HPLC分析。结果表明石油醚最适合作为早香柚油胞层的提取溶剂(表2，图2)。

表2

3、HSCCC溶剂体系的选择

硅胶粗提物粉末经HPLC检测包含1号物质和佛手柑素(图3)，通过测定分配系数(K)来初步筛选用于HSCCC的溶剂体系。将预先配好的不同的溶剂体系充分混匀，静置分层后，吸取同样体积的上下相，加入硅胶粗提物粉末，分别测定上下相中佛手柑素的峰面积，固定相与流动相中的佛手柑素峰面积之比为分配系数(表3)。根据0.5<K<2.5且被分离两种物质K值的比值最好大于1.5的原则，己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(1:1:2:0.625)溶剂体系适合用作佛手柑素的分离纯化体系。经HSCCC进一步纯化后得到纯度较高的粉末(图4，图5-7)，其结构做质谱(MS)鉴定。质谱条件：ESI离子源，正离子模式(ESI⁺)；毛细管电压：4000V；雾化器压力：45psi；干燥气体(N₂)温度：325℃；流速：5.0L/min；质量扫描范围：m/z 50～1000。质谱数据采集采用MRM模式。特征碎片与文献报道一致，确认为佛手柑素(图8)。

表3

溶剂体系(v/v)	配比	K<sub>1</sub>	K<sub>2</sub>	K<sub>2</sub>/K<sub>1</sub>
					己烷-甲醇-乙腈-水	10:8:1:1	0.34	0.31	0.91
氯仿-甲醇-水	2:1:1	0.05	0.05	1
					氯仿-甲醇-水	13:7:8	0.25	0.33	1.32
氯仿-甲醇-正丁醇-水	4:3:1:2	0.01	0.01	1
					己烷-乙酸乙酯-甲醇-水	2:1:2:1	2.80	5.91	2.11
己烷-乙酸乙酯-甲醇-水	1:1:2:0.625	1.50	2.19	1.46
					己烷-乙酸乙酯-甲醇-水	1:1:2:1	1.01	1.24	1.22
己烷-乙酸乙酯-甲醇-水	5:5:7:3	2.30	4.21	1.83

实施例2

本发明分离纯化佛手柑素的操作方法按照如下三个步骤来进行：

参见图1，(1)称取80g早香柚油胞层冷冻干燥粉末，按固液比1:20加入石油醚(60～90℃)超声提取两次，过滤后合并两次滤液，在旋转蒸发仪上蒸干得浸膏，与适量硅胶拌样，挥干后制成上样粉末，按上样量与硅胶用量为1g:50g的比例装柱，加入上样粉末后的硅胶柱用石油醚-乙酸乙酯(13:1)溶液洗脱佛手柑素，合并含有佛手柑素的洗脱液，在旋转蒸发仪上40℃蒸干得硅胶粗提物74.6mg，粗提物中佛手柑素含量≥40％；

(2)采用HSCCC纯化佛手柑素：将74.6mg硅胶粗提物溶于6ml上相中，吸取200μl用于液相检测纯度，剩余样品作为HSCCC纯化的上样液。配制己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(1:1:2:0.625)溶剂体系，充分摇匀静置1h后，分别接出上、下相，超声脱气30min，上相为固定相，下相为流动相。固定相先以30mL/min流速泵入高速逆流色谱(HSCCC)，稳定后，将逆流色谱仪的转速调至900rpm，同时流动相以2mL/min速度通过HSCCC，待流出液分层(即流出的固定相体积恒定)后，将准备好的样品进样，根据检测图谱(如图5)分管收集各组分，合并含有单一佛手柑素的各管在旋转蒸发仪上蒸干得佛手柑素22.6mg，纯度≥94％。结果参见图5。

实施例3

参见图1，(1)称取90g早香柚油胞层冷冻干燥粉末，按固液比1:20加入石油醚(60～90℃)超声提取两次，过滤后合并两次滤液，在旋转蒸发仪上蒸干得浸膏，与适量硅胶拌样，挥干后制成上样粉末，按上样量与硅胶用量为1g:50g的比例装柱，加入上样粉末后的硅胶柱用石油醚-乙酸乙酯(13:1)溶液洗脱佛手柑素，合并含有佛手柑素的洗脱液，在旋转蒸发仪上40℃蒸干得硅胶粗提物83.2mg，粗提物中佛手柑素含量≥40％。

(2)采用HSCCC纯化佛手柑素：将83.2mg硅胶粗提物溶于6.5ml上相中，吸取200μl用于液相检测纯度，剩余样品作为HSCCC纯化的上样液。配制己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(1:1:2:0.625)溶剂体系，充分摇匀静置1h后，分别接出上、下相，超声脱气30min，上相为固定相，下相为流动相。固定相先以30mL/min流速泵入高速逆流色谱(HSCCC)，稳定后，将逆流色谱仪的转速调至900rpm，同时流动相以2mL/min速度通过HSCCC，待流出液分层(即流出的固定相体积恒定)后，将准备好的样品进样，根据检测图谱(如图6)分管收集各组分，合并含有单一佛手柑素的各管在旋转蒸发仪上蒸干得佛手柑素26.8mg，纯度≥94％。结果参见图6。

实施例4

参见图1，(1)称取100g早香柚油胞层冷冻干燥粉末，按固液比1:20加入石油醚(60～90℃)超声提取两次，过滤后合并两次滤液，在旋转蒸发仪上蒸干得浸膏，与适量硅胶拌样，挥干后制成上样粉末，按上样量与硅胶用量为1g:50g的比例装柱，加入上样粉末后的硅胶柱用石油醚-乙酸乙酯(13:1)溶液洗脱佛手柑素，合并含有佛手柑素的洗脱液，在旋转蒸发仪上40℃蒸干得硅胶粗提物97.9mg，粗提物中佛手柑素含量≥40％；

(2)采用HSCCC纯化佛手柑素：将97.9mg硅胶粗提物溶于8ml上相中，吸取200μl用于液相检测纯度，剩余样品作为HSCCC纯化的上样液。配制己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(1:1:2:0.625)溶剂体系，充分摇匀静置1h后，分别接出上、下相，超声脱气30min，上相为固定相，下相为流动相。固定相先以30mL/min流速泵入高速逆流色谱(HSCCC)，稳定后，将逆流色谱仪的转速调至900rpm，同时流动相以2mL/min速度通过HSCCC，待流出液分层(即流出的固定相体积恒定)后，将准备好的样品进样，根据检测图谱(如图7)分管收集各组分，合并含有单一佛手柑素的各管在旋转蒸发仪上蒸干得佛手柑素30.7mg，纯度≥94％。结果参见图7。

Claims

1.一种从早香柚油胞层中分离纯化佛手柑素的方法，其特征在于，通过以下步骤实现：

（1）制备硅胶粗提物粉末：按固液比1:20取一定质量烘干的提取材料早香柚油胞层与60~90℃的石油醚超声提取两次，过滤后合并两次滤液，在旋转蒸发仪上蒸干得浸膏，与适量硅胶拌样，挥干，制成上样粉末，按上样量与硅胶用量为1 g:50 g的比例装柱，加入上样粉末后开始洗脱，收集洗脱液，浓缩干燥得硅胶粗提物粉末；

（2）分离纯化佛手柑素：配制己烷-乙酸乙酯-甲醇-水溶剂系统，充分摇匀静置1 h后，分别接出上、下相，超声脱气30 min，上相为固定相，下相为流动相，固定相先以30 mL/min流速泵入高速逆流色谱，稳定后，将逆流色谱仪的转速调至900 rpm，同时流动相以2 mL/min速度通过高速逆流色谱，待流出液分层后，将硅胶粗提物溶于适量固定相进样，根据检测图谱分管收集各组分，用高效液相色谱测定各管纯度，合并含有单一佛手柑素的各管，将溶液中的有机溶剂在旋转蒸干仪上40℃充分蒸发后，剩余水溶液转移至冷冻干燥仪中冻干，最终得到高纯度佛手柑素；

其中步骤（1）所述的上硅胶柱洗脱条件为用石油醚-乙酸乙酯为13:1的溶液洗脱，合并含有佛手柑素的洗脱液；

步骤（2）配制的溶剂体系选用体积比1:1:2:0.625的己烷-乙酸乙酯-甲醇-水。

2.根据权利要求1所述的一种从早香柚油胞层中分离纯化佛手柑素的方法，其特征在于，步骤（1）提取材料选用早香柚油胞层的冷冻干燥粉末。