CN104173335A - 佛手柑素在制备防治糖尿病药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供佛手柑素在制备防治糖尿病药物及在制备防治糖尿病的功能食品或保健品中的应用，所述佛手柑素的化学式为C₂₁H₂₂O₄，相对分子质量为338.4。本发明研究证实在人肝癌HepG2细胞中佛手柑素表现出显著的葡萄糖消耗活性，具良好的浓度依赖性，且其作用浓度远低于阳性药二甲双胍，而药效却优于二甲双胍。在糖尿病KK-A^y小鼠体内佛手柑素可以显著降低糖尿病KK-A^y小鼠的血糖，增加葡萄糖耐量和胰岛素敏感性。本发明通过佛手柑素在细胞和体内两个水平上的降糖活性研究，显示佛手柑素表现出显著的降糖活性，增加葡萄糖耐量和胰岛素敏感性，可作为治疗药物或功能食品、保健品用于糖代谢异常相关疾病的防治。

Description

佛手柑素在制备防治糖尿病药物中的应用

技术领域

本发明属医药领域，涉及天然来源的佛手柑素在制备防治糖尿病药物中的应用，尤其涉及佛手柑素在细胞水平和体内水平上降糖的应用。

背景技术

    糖尿病是一种因体内胰岛素绝对或者相对不足所导致的一系列临床综合症，与遗传基因有着非常密切的关联。糖尿病的主要临床表现为多饮、多尿、多食和体重下降（“三多一少”），以及血糖高、尿液中含有葡萄糖等。世界卫生组织将糖尿病分为四种类型：1型糖尿病、2型糖尿病、其他类型糖尿病和妊娠期糖尿病。目前，1、2型糖尿病尚不能完全治愈，糖尿病的治疗主要是饮食控制配合降糖药物（对于2型糖尿病）或者胰岛素补充相结合治疗糖尿病，因此，糖尿病的预防更加重要。糖尿病可以引起多种并发症。如果糖尿病没有得到足够的控制，可以引起一些急性并发症，如低血糖症、酮症酸中毒、非酮高渗性昏迷。严重的长期并发症包括：心血管疾病、慢性肾衰竭、神经病变及微血管病变。世界卫生组织2011年的的报告指出全世界有3.46亿人患有糖尿病，超过80%的糖尿病死亡发生在低收入和中等收入国家。目前，糖尿病的防治成为国内外学者研究的热点。

佛手柑素（Bergamottin）又称香柠檬素，为香豆素类化合物，具体为呋喃香豆素类，来源于佛手和某些柚类等。香豆素类化合物具有抗癌、抗肿瘤、抗HIV、抗氧化等多种生物活性，且分子量小，合成相对简单，生物利用度高，已成为国内外学者研究的热点。而对于佛手柑素，其药学活性鲜见报道，对于降糖活性，更是未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供佛手柑素在制备防治糖尿病药物中的应用，所述佛手柑素的化学式为C₂₁H₂₂O₄，相对分子质量为338.4，结构式为：

。

本发明所用佛手柑素购自成都瑞芬思生物技术有限公司，研究证实在人肝癌HepG2细胞(in vitro）中佛手柑素表现出显著的葡萄糖消耗活性，具良好的浓度依赖性，且其作用浓度远低于阳性药二甲双胍，而药效却优于二甲双胍。在糖尿病KK-A^y小鼠体内（in vivo）佛手柑素可以显著降低糖尿病KK-A^y小鼠的血糖，增加葡萄糖耐量和胰岛素敏感性。

本发明另一个目的是提供佛手柑素在制备防治糖尿病的功能食品或保健品中的应用。本发明强调佛手柑素这种天然产物在糖尿病防治中的最新发现。

本发明通过佛手柑素在细胞和体内两个水平上的降糖活性研究，以达到将其应用于糖尿病防治的目的，佛手柑素表现出显著的降糖活性。

本发明提供的一种佛手柑素在制备防治糖尿病药物及功能食品中的应用。佛手柑素和降糖药物二甲双胍一样，能够在人肝癌HepG2细胞（in vitro）中显著增加葡萄糖消耗，且其作用浓度远低于阳性药二甲双胍，而药效却优于二甲双胍（5 μg/mL佛手柑素可换算成0.0148 mmol/L佛手柑素，且其葡萄糖消耗量显著高于1 mmol/L二甲双胍）；能够在糖尿病KK-A^y小鼠体内（in vivo）显著降低血糖，增加葡萄糖耐量和胰岛素敏感性。可作为治疗药物或功能食品、保健品用于糖代谢异常相关疾病的防治。

附图说明

图1是以人肝癌HepG2细胞为模型，佛手柑素对其葡萄糖消耗活性的影响。其中，DMSO（二甲亚砜）为阴性对照，常用降糖药Met（二甲双胍）为阳性对照，佛手柑素设置4个浓度（终浓度）梯度，分别为0.625 μg/mL、1.25 μg/mL、2.5 μg/mL和5 μg/mL。用SPSS软件进行差异显著性分析，进行t检验，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，与DMSO组比较。

图2-1是以KK-A^y鼠为饲喂对象，佛手柑素对其空腹血糖的影响，给药两周，第1周测定数值。C57鼠+水为背景组；KK鼠+水为对照组；KK鼠+佛手柑素为处理组，剂量为50 mg/kg BW。用SPSS软件进行差异显著性分析，进行t检验，*p<0.05，与KK+Water组比较。

图2-2是以KK-A^y鼠为饲喂对象，佛手柑素对其空腹血糖的影响，给药两周，第2周测定数值。C57鼠+水为背景组；KK鼠+水为对照组；KK鼠+佛手柑素为处理组，剂量为50 mg/kg BW。用SPSS软件进行差异显著性分析，进行t检验，*p<0.05，与KK+Water组比较。

图3是以KK-A^y鼠为饲喂对象，佛手柑素对其OGTT的影响，给药两周，试验结束前测定一次。给KK-A^y鼠灌胃2 g/kg BW葡萄糖，测定其2 小时内每隔30分钟的血糖变化。用SPSS软件进行差异显著性分析，进行t检验，*p<0.05，与KK鼠+水组比较。

图4是以KK-A^y鼠为饲喂对象，佛手柑素对其ITT的影响，给药两周，试验结束前测定一次。给KK鼠腹腔注射1 U/kg BW胰岛素，测定其2小时内每隔30分钟的血糖变化。用SPSS软件进行差异显著性分析，进行t检验，*p<0.05，与KK鼠+水组比较。

具体实施方式

本发明结合附图和实施例作进一步的说明。

实施例1

HepG2细胞用含10 %胎牛血清的高糖型DMEM培养基于37 ℃、5 % CO₂细胞培养箱中孵育，隔天更换新鲜培养液，2～3天传代1次。实验时，HepG2细胞接种于96孔板，并设无细胞空白对照孔。待细胞生长至70～80 %融合，弃去原培养基，用PBS缓冲液洗2遍，换上含0.2 % BSA的无血清1640培养液，分组加药。设DMSO溶剂对照组，二甲双胍对照组（终浓度为1 mmol/L）和不同浓度佛手柑素组（终浓度分别为0.625 μg/mL、1.25 μg/mL、2.5 μg/mL和5 μg/mL）。作用24 小时后，用酶标仪检测各孔OD值（检测波长：505 nm），用葡萄糖氧化酶法测定每孔培养液的葡萄糖含量。每孔培养液葡萄糖消耗量=无细胞空白孔培养液葡萄糖含量－每孔培养液葡萄糖含量，每组设5个复孔。相同实验重复4次。

葡萄糖含量测定后，弃去板中培养基，细胞用含10 % CCK8的无血清DMEM培养基固定45分钟。待红色培养基变成橘红色，用酶标仪检测各孔OD值（检测波长：450 nm和620 nm），用于反映细胞增殖状况，以矫正细胞接种数目及化合物毒性等综合因素造成的实验误差。最后计算各组葡萄糖消耗量与溶剂对照组比较的增加百分率。

数据用平均值±标准误（）表示，使用SPSS软件进行数据分析，进行t检验。具体的佛手柑素葡萄糖消耗活性见附图1。

实施例2

KK小鼠购自北京华阜康生物科技股份有限公司，饲喂的专用饲料也购自该公司。所有小鼠在恒温恒湿环境下饲养，提供12小时光照12小时黑暗环境，并饲喂专用饲料1K65（粗脂肪%≧6.0，粗蛋白≧18.0）。背景组8只C57小鼠购自北京华阜康生物科技股份有限公司，饲喂的饲料也购自该公司。KK鼠试验设置KK鼠+水和KK鼠+佛手柑素两个组，每组8只小鼠，其中，BGM为佛手柑素，剂量为50 mg/kg BW。所有小鼠可以自由摄取食物和蒸馏水，处理组通过灌胃针灌胃的方式进行给药，KK鼠+水组灌胃蒸馏水。试验为期2周，1周连续给药6天，停药1天。每周第3天给药后禁食4小时，对小鼠尾静脉剪尾取血，用强生One Touch Ultra ZSJ 843ETT型血糖仪测定空腹血糖值。数据用平均值±标准误（）表示，使用SPSS软件进行数据分析，进行t检验。具体的第1周和第2周空腹血糖测定值见附图2-1和附图2-2。

试验结束前一天测定OGTT。测OGTT之前，小鼠禁食5小时，给药，1小时后测OGTT。采血作为0分钟血糖值，然后给予20%葡萄糖（2 g/kg BW,灌药体积为0.1 mL/10g BW)灌胃后，于30、60、90、120分钟四个时间点分别尾静脉采血，用强生One Touch Ultra ZSJ 843ETT型血糖仪测定血糖值，绘制糖耐量曲线。数据用平均值±标准误（）表示，使用SPSS软件进行数据分析，进行t检验。具体的KK小鼠糖耐量曲线见附图3。

试验结束前一天测定ITT。测ITT之前，小鼠禁食5小时，给药，1小时后测ITT。采血作为0分钟血糖值，然后腹腔注射胰岛素1 U/kg（灌药体积为0.1 mL/10g BW)，于30、60、90、120分钟四个时间点分别尾静脉采血，用强生One Touch Ultra ZSJ 843ETT型血糖仪测定血糖值，绘制胰岛素耐量曲线。C57小鼠胰岛素耐受力低，故不进行ITT测定。数据用平均值±标准误（）表示，使用SPSS软件进行数据分析，进行t检验。具体的KK小鼠胰岛素耐量曲线见附图4。   

Claims (2)

1.一种佛手柑素在制备防治糖尿病药物中的应用，所述佛手柑素的化学式为C₂₁H₂₂O₄，相对分子质量为338.4，结构式为：

                                                   。

2.一种佛手柑素在制备防治糖尿病的功能食品或保健品中的应用，所述佛手柑素的化学式为C₂₁H₂₂O₄，相对分子质量为338.4，结构式同权利要求1。