CN104055786A

CN104055786A - 苜蓿酸-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、苜蓿酸及其盐在制备防治肿瘤药物中的应用

Info

Publication number: CN104055786A
Application number: CN201410314397.1A
Authority: CN
Inventors: 陈旅翼
Original assignee: South Central University for Nationalities
Current assignee: South Central Minzu University
Priority date: 2014-07-02
Filing date: 2014-07-02
Publication date: 2014-09-24
Anticipated expiration: 2034-07-02
Also published as: CN104055786B

Abstract

本发明涉及民族药物技术领域，具体公开了苜蓿酸-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷与其水解产物苜蓿酸，以及两者的盐的医药用途，即其具有抗肿瘤，特别是抗肝癌与抗结肠癌作用。本发明通过药物试验证实了这四种化合物的抑瘤作用好，毒副作用小，具备良好的成药性，具有巨大的开发前景。

Description

苜蓿酸-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、苜蓿酸及其盐在制备防治肿瘤药物中的应用

技术领域

本发明涉及民族药物技术领域，具体涉及苜蓿酸-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷与其水解产物苜蓿酸，以及苜蓿酸-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷与苜蓿酸两者的盐的医药用途，即其具有抗肿瘤，特别是抗肝癌与抗结肠癌的作用。

背景技术

肿瘤是机体在各种致癌因素作用下，局部组织的某一个或多个细胞在基因水平上失去对其生长的正常调控，导致其克隆性异常增生而形成的肿块，是目前危害人类健康最严重的疾病之一，据WHO统计，全球平均每年死于恶性肿瘤者高达700万人，新发病800万例，此数据在逐年增加，到2020年全世界每年将新发生2000万例患者，肿瘤已成为人类健康的头号杀手。传统的化学药物治疗和手术、放疗等结合，虽成功提高了多种恶性肿瘤的治愈率，但由于较强的副作用以及耐药性，使得寻找新的治疗肿瘤的研究刻不容缓。随着对癌症研究的深入，我国的医药专家根据各民族运用天然抗肿瘤药物的经验，从民族医药中研究和开发出了一批疗效确切、不良反应小的天然抗肿瘤药，为肿瘤的防治作出了应有的贡献。民族医药在治疗癌症中具有多方位、多靶点、低毒性、不易产生耐药性等优势，符合肿瘤多因素、多环节致病的机理，其抗肿瘤的有效部位、有效成分及作用机理研究已成为目前国内外研究的热点。因此，从民族药物中寻找低毒、高效的抗肿瘤药物显示了巨大的潜力。

发明人在前期研究中发现，苜蓿酸-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷与其水解产物苜蓿酸具有显著的抗癌作用，因此又分别制备了两个化合物的盐，并进行了相关的体外抗肿瘤实验，均显示出了良好药理作用。特别是苜蓿酸-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷与苜蓿酸在对H22荷瘤小鼠体内抗肿瘤及毒性研究上，显示出低毒，高效的特点，有非常好的成药性，具有巨大的开发前景。

发明内容

针对现有技术中存在的技术空白，本发明的目的在于公开了苜蓿酸-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、其水解产物苜蓿酸，以及两者的盐在制备预防或治疗肿瘤的药物中的应用，所述肿瘤优选肝癌与结肠癌。结果表明，这四种化合物的抗肿瘤效果与市场上一线抗肿瘤药物相比，具有同等的药效，且无明显的毒副作用，具有巨大的开发前景。

与现有技术相比，本发明的优点和有益效果如下：

1.本发明与现有抗肿瘤药相比，在疗效相当的情况下，无明显的毒副作用；

2.本发明的四种化合物制备方法简单，价格低廉，对环境友好；

3.本发明的化合物抗肿瘤机制独特，特别在抗肝癌与结肠癌方面，体现了明显的优势。总之，本发明疗效确切，性价比高，具有巨大的开发应用前景。

具体实施方式

下面申请人将结合具体的实施例对本发明技术方案做进一步详细说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明请求保护范围的限定。

以下实施例中所用苜蓿酸-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、苜蓿酸及两者的盐四种化合物纯度经HPLC归一化法大于99％。以下为各化合物的结构式通式：

苜蓿酸-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷：R₁＝H，R₂＝H，R₃＝β-D-吡喃葡萄糖(glucopyranoside)；

苜蓿酸-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷盐：R₁＝Na，R₂＝Na，R₃＝β-D-吡喃葡萄糖(glucopyranoside)；

苜蓿酸：R₁＝H，R₂＝H，R₃＝H；

苜蓿酸盐：R₁＝Na，R₂＝Na，R₃＝H。

四种化合物中，苜蓿酸-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(简称苜蓿酸苷)为本申请发明人按照中国专利CN102875615B(发明名称：大麻药苷A和大麻药总皂苷的提取方法及其应用)的说明书实施例6第0120段记载的方法合成，产物结构式如实施例6第0119段所示。

苜蓿酸-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷盐的制备方法：将苜蓿酸-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷加入NaOH溶液中反应，获得的主要产物即为苜蓿酸-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷钠盐，过硅胶柱分离，得到高纯度的苜蓿酸-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷钠盐。

苜蓿酸为从市场采购；

苜蓿酸钠盐的制备方法：将苜蓿酸加入NaOH溶液中反应，获得的主要产物即为苜蓿酸钠盐，过硅胶柱分离，得到高纯度的苜蓿酸钠盐。

实施例1和2中，所用顺铂(Cisplatin,CDDP)为注射粉针剂(昆明贵研药业有限公司，批号120615GE)。

实施例1 各化合物对多种瘤株的抑制作用

实验方法：取对数生长期的肿瘤细胞，接种96孔板中，细胞密度为1×10⁵cell/ml，每孔100μl。将96孔板按列分组，每组6个复孔。分为对照组(顺铂)；药物组(每种药物设6个浓度梯度，终浓度为：0.1，1，5，25，100，200μmol/L)。在细胞贴壁并生长融合至80％左右时，细胞内加入上述不同浓度的药物，一起孵化培养48h，去除上清液，每孔加入MTT(1g/L)10μl，平面混合后，置于培养箱中继续孵育4h后，弃去各孔上清液，加入150μl DMSO，平面震荡混匀5min，待其各孔中的紫色结晶完全溶解后，置于酶标仪下测定各孔中的OD值(λ570nm)。按下面公式计算细胞增殖抑制率(IR)：IR(％)＝(对照组OD值－给药组OD值)/对照组OD值×100％，并计算其IC₅₀值。

表1评价了苜蓿酸-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷与其水解产物苜蓿酸以及两者的盐，分别对体外培养的6种肿瘤细胞SMMC-7721(肝癌)、H22(肝癌)、HepG2(肝癌)、EC109(食管癌)、SW480(结肠癌)、Hela(宫颈癌)的抑制活性。采用MTT法，细胞内加入上述不同浓度的药物，一起孵化培养48h，根据抑制进行线性回归，求得药物的半数抑制浓度(IC₅₀)。实验结果见表1。

表14种化合物对各瘤株的IC₅₀(48h)

从表1得出，苜蓿酸、苜蓿酸苷及两者的钠盐对肝癌细胞株(SMMC-7721，H22及HepG2)与结肠癌细胞株(SW480)均有较好的抑制效果，且苷的效果要优于苷元。另外，两者对其它瘤株也有呈现出一定的抑制作用。

实施例2

实施例1表明苜蓿酸及苜蓿酸苷具有较强的肝癌细胞抑制作用，因此进一步研究了其对H22荷瘤小鼠体内抗肿瘤及毒性，实验方法与结果如下：

1材料

1.1实验材料

四种化合物及顺铂的来源前文已描述。

1.2实验动物及瘤株

昆明种小鼠，雌雄各半，体重18～22克，由湖北省疾病预防控制中心提供，H22肝癌腹水瘤细胞购自中国上海典型培养物保藏中心。

1.3实验仪器

超净工作台，电子天平，酶标仪，手术剪等。

2方法

2.1药液的配制

药物的配制：分别称取苜蓿酸及苜蓿酸苷30、60mg，加入生理盐水并用0.1mol/L的NaOH调pH为8～9，配成30ml的溶液，得苜蓿酸与苜蓿酸苷的低、高剂量4种药液。

空白组与模型组药液的配制：取生理盐水50ml，用0.1mol/L的NaOH调pH在8～9，即得。

顺铂组药液的配制：15mg CDDP溶于30ml生理盐水中，用0.1mol/L的NaOH调pH在8～9，即得。

2.2H22肝癌腹水瘤细胞悬液的制备

无菌条件下操作，取接种6d的H22荷瘤小鼠，处死，将其浸泡于75％酒精中1min，用5ml一次性无菌注射器穿入腹腔，吸取肿瘤细胞生长良好的腹水6ml，用灭菌生理盐水溶液按1:4的比例稀释。

2.3昆明种小鼠移植H22瘤模型的建立

取体重20g左右的昆明种小鼠，随机分成7组，每组10只，分别为空白组、模型组、顺铂组、苜蓿酸与苜蓿酸苷低、高剂量组。其中模型组、顺铂组、药物低、高剂量组每只0.2ml悬液接种于右前肢腋窝皮下，空白组不做任何处理。

2.4给药方法

空白组与模型组：灌胃给予0.2ml/10g的生理盐水；顺铂组腹腔注射0.2ml/10g的顺铂；苜蓿酸与苜蓿酸苷低、高剂量组分别口服给予0.2ml/10g剂量的4种药液，各组每日给药1次，连续10d。

2.5指标检测

给药10d后停止给药，在末次给药24h后，先眼眶取血1ml，放入抗凝EP管中保存。再将小鼠颈椎脱臼处死，迅速解剖剥取瘤块、脾脏和胸腺并称重。血样标本进行血常规及肝肾功能检测。抑瘤率、脾脏指数、胸腺指数按下式计算：

抑瘤率(％)＝(模型组平均瘤重-给药组平均瘤重)/模型组平均瘤重(g)×100％

脾脏指数(％)＝10×脾脏重(mg)/小鼠体重(g)

胸腺指数(％)＝10×胸腺重(mg)/小鼠体重(g)

2.6统计学方法

各组数据以表示，组间差异用t检验。

3结果

3.1小鼠的一般状况

苜蓿酸与苜蓿酸苷的各剂量组小鼠饮食、活动、毛发、粪便均正常，未见药物引起的病变和中毒现象，与模型组比较，苜蓿酸与苜蓿酸苷各剂量组小鼠体重无显著变化。但顺铂组体重明显减轻，与模型组相比有显著性差异(P<0.01)，结果见表2。

表2苜蓿酸与苜蓿酸苷对H22荷瘤小鼠的体重的影响

体重：*P<0.05，**P<0.01vs模型组。

3.2不同剂量苜蓿酸与苜蓿酸苷对H22荷瘤小鼠抑瘤率的影响

小鼠和瘤体的外观变化：各组小鼠接种后3d内，外观无明显变化，活动饮食正常。随后4、5天可在右侧腋下触及如米粒样肿块，以后肿瘤逐日增大，模型组肿瘤生长较快，其它各组肿瘤生长相对缓慢，顺铂组小鼠生长活动状况最差，并出现2只小鼠死亡。

对荷瘤小鼠的肿瘤抑制作用：接种后，小鼠成瘤率100％。且整个实验过程中小鼠无一例死亡。模型组小鼠肿瘤重量基本上在0.8g左右，说明H22荷瘤小鼠模型成功。实验显示苜蓿酸与苜蓿酸苷低、高剂量组对荷瘤小鼠的肿瘤生长具有明显的抑制作用，抑制率分别为44.7％、50.6％、55.3％与62.3％。与顺铂组相比，无显著性差异。结果见表3。.

3.3不同剂量苜蓿酸与苜蓿酸苷对H22荷瘤小鼠免疫器官的影响

对荷瘤小鼠免疫器官指数的影响：顺铂组胸腺与脾脏指数与模型组相比有极显著性差异(***P<0.001)；而苜蓿酸与苜蓿酸苷高、低剂量组与模型组相比无显著性差异，与顺铂组比较有非常显著性差异(^##P<0.01)，结果如表3。

表3苜蓿酸与苜蓿酸苷对H22荷瘤小鼠肿瘤抑制作用及对免疫器官的影响

瘤重、脾脏、胸腺指数***P<0.001VS模型组，^##P<0.01VS顺铂组

3.4不同剂量苜蓿酸与苜蓿酸苷对H22荷瘤小鼠血常规的影响

15mg/kg的顺铂可明显降低H22荷瘤小鼠的白细胞数，而苜蓿酸与苜蓿酸苷低、高剂量对H22荷瘤小鼠反而有明显的促进骨髓造血功能而使白细胞增加(*P<0.05，**P<0.01)。对于血小板指标，苜蓿酸与苜蓿酸苷高剂量时，有显著降低血小板数的作用，说明苜蓿酸与苜蓿酸苷有活血化瘀的作用，结果见表4。

表4苜蓿酸与苜蓿酸苷对H22荷瘤小鼠血常规的影响

*P<0.05，**P<0.01VS模型组

3.5苜蓿酸与苜蓿酸苷对H22荷瘤小鼠肝肾功能的影响

肝功能方面，苜蓿酸与苜蓿酸苷各剂量组ALT/AST水平与模型组相比基本上无显著性差异(P>0.05)，说明苜蓿酸与苜蓿酸苷对小鼠没有造成明显的肝功能损伤；肾功能方面，顺铂组LDH，BUN，UA与模型组相比，具有显著性差异(**P<0.01)，苜蓿酸与苜蓿酸苷低剂量组的LDH，BUN，UA，CRE水平与空白组相比无显著性差异，表明苜蓿酸与苜蓿酸苷对肾功能无明显的损伤，结果见表5。

表5苜蓿酸与苜蓿酸苷对H22荷瘤小鼠肝肾功能的影响

*P<0.05，**P<0.01VS模型组

综述所述，苜蓿酸与苜蓿酸苷及其盐具有显著的抗肿瘤活性与良好的安全性，有望成为拥有我国自主知识产权的一类抗肿瘤新药。

Claims

1.结构式如下的化合物在制备预防或治疗肿瘤的药物中的应用：

式中，R₁＝H，R₂＝H，R₃＝β-D-吡喃葡萄糖；

或者，R₁＝Na，R₂＝Na，R₃＝β-D-吡喃葡萄糖；

或者，R₁＝H，R₂＝H，R₃＝H；

或者，R₁＝Na，R₂＝Na，R₃＝H。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述肿瘤为肝癌或者结肠癌。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述肿瘤为肝癌。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述肿瘤为结肠癌。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述肝癌为SMMC-7721、H22或者HepG2。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述肝癌为H22。

7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述结肠癌为SW480。