CN109453195A - 一种用于抑制肿瘤细胞的药物组合物 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种用于抑制肿瘤细胞的药物组合物，包括长春瑞滨、顺铂和茯苓多糖。本发明提供的茯苓多糖联合长春瑞滨+顺铂可显著提高荷瘤小鼠抗肿瘤作用，平均肿瘤体积及抑瘤率与长春瑞滨+顺铂组相较具有明显差异(P<0.05)；且合并用药疗效q>1，说明茯苓多糖能够增强长春瑞滨联合顺铂用药的治疗效果；茯苓多糖联合长春瑞滨和顺铂可明显改善化疗后造成的体质量严重减轻、免疫力低下等副作用，差异具有统计学意义(P<0.05)；茯苓多糖可提高化疗药所抑制的荷瘤小鼠外周血清IL‑2、TNF‑α含量，IL‑2差异显著。综上所述，茯苓多糖能够辅助增强长春瑞滨和顺铂联合用药对肺癌的治疗效果，同时显著减低放化疗引起的副作用。

Description

一种用于抑制肿瘤细胞的药物组合物

技术领域

本发明属于肿瘤用药领域，具体涉及一种用于抑制肿瘤细胞的药物组合物。

背景技术

非小细胞肺癌(Non-small-cell carcinoma，NSCLC)是全球最常见的肺部恶性肿瘤，其发病率及死亡率居于所有恶性肿瘤之首。有研究报道在我国肺癌发病率和死亡率均呈逐年上升趋势，是我国一个重大的公共卫生问题。由于大多肺癌患者被诊断时多为晚期，失去了手术机会，临床多以化疗为主，其中长春瑞滨联合顺铂是主要的一线治疗药物。

长春瑞滨化学名为3′，4′-二去氢-4′-去氧-8′-去甲长春花碱，分子式为C₄₅H₅₄N₄O₈，为半合成长春花生物碱，有广谱抗肿瘤活性，且毒性低。通过干扰细胞有丝分裂期微管的聚集而产生细胞毒作用。用于非小细胞肺癌、乳腺癌、卵巢癌、软组织及内脏转移癌和淋巴癌。顺铂分子式为Cl₂H₄N₂Pt，为橙黄色或黄色结晶性粉末，其微溶于水，易溶于二甲基甲酰胺，在水溶液中可逐渐转化成反式和水解。临床用于卵巢癌、前列腺癌、睾丸癌、肺癌、鼻咽癌、食道癌、恶性淋巴瘤、头颈部鳞癌、甲状腺癌及成骨肉瘤等多种实体肿瘤均能显示疗效。

专利申请CN201610378853.8提供了一种龙须菜多糖的应用以及含有龙须菜多糖的抗肿瘤药物，该抗肿瘤药物包含有龙须菜多糖增效剂、抗肿瘤活性成分以及药学上可接受的辅料。该发明首次发现海藻龙须菜多糖与化疗药紫杉醇、氟尿嘧啶、甲氨蝶呤和顺铂等联合使用可以增加化疗药治疗肿瘤的效果。专利CN201410569118.6公开了一种纯中药制剂罗勒多糖的新用途，即罗勒多糖用作抗肿瘤化疗药增效剂在制备抗肿瘤药物中的应用，所述化疗药为顺铂、盐酸吡柔比星或氟尿嘧啶。该发明试验研究表明，罗勒多糖可以增加多种化疗药对于多个不同组织来源的肿瘤细胞具有抑制肿瘤增殖和活性的作用，包括肺癌、喉癌、胃癌等，且罗勒多糖体外细胞实验中工作浓度未见毒性，罗勒多糖对化疗药的增效作用呈剂量依赖性，具有临床应用前景。专利CN201310085380.9涉及一种用于肺癌化疗增效减毒作用的化合物组合物、其制备方法及其在制备肺癌化疗增效减毒药物中的应用。该组合物原料药组成为：地黄5-20重量份；人参0.1-2重量份；茯苓0.5-4重量份；白蜜1-7重量份。该组合物由人参皂苷组合物、环烯醚萜苷组合物、5-羟甲基糠醛和多糖4个有效组分组成，其重量比为1.5-5.0:1.0-8.0:0.2-1.0:3000-15000。该发明所得组合物对实验性肺癌小鼠顺铂化疗具有显著的增效作用，并对顺铂化疗引起的骨髓抑制有显著的抑制作用。上述专利中均研究对顺铂化疗的增效作用，而申请人通过检索并未发现在现有技术中有对长春瑞滨联合顺铂使用时起增效和降毒作用的药物。

因长春瑞滨联合顺铂使用时，患者免疫功能抑制、胃肠系统毒副作用及骨髓抑制等毒副作用存在，且易产生耐药性，使得患者对化疗的耐受程度明显降低。因此，本领域需要一种新的能抑制非小细胞肺癌的方法或药物组合物。

发明内容

因此，本发明提供一种用于抑制肿瘤细胞的药物组合物，包括长春瑞滨、顺铂和茯苓多糖。

在一种具体的实施方式中，所述长春瑞滨和顺铂为注射剂，所述茯苓多糖为口服剂或注射剂。

在一种具体的实施方式中，所述药物组合物用于抑制肺癌细胞。

在一种具体的实施方式中，所述药物组合物为用于抑制非小细胞肺癌的药物组合物。

在一种具体的实施方式中，所述药物组合物中长春瑞滨、顺铂和茯苓多糖的质量比例为1：0.1～50：50～50000，优选1：0.5～30：100～10000。

在一种具体的实施方式中，所述药物组合物中长春瑞滨、顺铂和茯苓多糖的质量比例为1：1～5：500～5000。

本发明的有益效果：茯苓多糖联合长春瑞滨+顺铂可显著提高荷瘤小鼠抗肿瘤作用，平均肿瘤体积及抑瘤率与长春瑞滨+顺铂组相较具有明显差异(P<0.05)；且合并用药疗效q>1，说明茯苓多糖能够增强长春瑞滨联合顺铂用药的治疗效果；茯苓多糖联合长春瑞滨和顺铂可明显改善化疗后造成的体质量严重减轻、免疫力低下等副作用，差异具有统计学意义(P<0.05)；茯苓多糖可提高化疗药所抑制的荷瘤小鼠外周血清IL-2、TNF-α含量，IL-2差异显著。综上所述，茯苓多糖能够辅助增强长春瑞滨和顺铂联合用药对肺癌的治疗效果，同时显著减低放化疗引起的副作用，其作用机制可能与茯苓多糖增强机体免疫调节有关。

附图说明

图1为荷瘤小鼠给药期间体质量变化情况。

图2为荷瘤小鼠给药期间相对肿瘤体积变化情况。

图3为茯苓多糖联合长春瑞滨+顺铂对荷瘤鼠外周血中TNF-α和IL-2含量的影响情况。

具体实施方式

本发明研究将茯苓多糖及与化疗药物长春瑞滨和顺铂联用，分别作用于BALB/c小鼠肺癌模型，研究茯苓多糖对长春瑞滨和顺铂治疗肺癌的疗效及改善预后的影响，并初步探讨其机制。具体方法是：体外培养A549细胞于BALB/c小鼠接种皮下成瘤，建立肺癌小鼠模型。将成瘤小鼠随机分为4组：茯苓多糖组、长春瑞滨+顺铂组、茯苓多糖联合长春瑞滨+顺铂组、生理盐水组(对照组)；每组6只，成瘤后分别用茯苓多糖、长春瑞滨+顺铂、茯苓多糖联合长春瑞滨+顺铂、生理盐水给药，给药后观察记录21天。分别观察记录各组小鼠生长状态、体质量变化情况、移植瘤大小及抑瘤率、脾脏指数，并采用ELISA方法检测小鼠血清中IL-2、TNF-α含量。

实施例1和对比例1～3

本发明中，茯苓多糖联合长春瑞滨+顺铂组为实施例1内容，而其余三组分别为本发明中的对比例1～3内容。

具体试验内容包括：

1、材料与方法

1.1实验动物和细胞株

人肺腺癌细胞株A549购自中国科学院上中国科学院上海细胞生物研究所。BALB/cSPF级小鼠购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，雌性，体质量(20±2)g，鼠龄6～8周；饲养于湖南师范大学SPF级无菌饲养室，适应性饲养1周，自由摄食饮水。

1.2实验试剂和药物

茯苓多糖提取物粉末购自湖南补天药业有限公司，批号20131101；长春瑞滨(NVB)购自萨恩化学技术(上海)有限公司，编号：E100527，批号：GA060070；顺铂(DDP)购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司，批号：MKCD4531；茯苓多糖用无菌PBS溶于所需浓度，NVB、DDP用无菌生理盐水稀释至所需浓度。DMEM培养液(美国Gibco公司)，10％胎牛血清(美国Hyclone公司)；TNF-α、IL-2ELISA试剂盒购自欣博盛公司。

1.3细胞培养

用含10％胎牛血清和100U/mL青霉素和链霉素的DMEM培养液，在37℃、5％CO₂的培养箱内培养A549细胞。将对数生长期的A549细胞，经PBS冲洗和0.25％胰酶消化，最终制备成浓度为1×10⁷的细胞悬液，用于小鼠皮下接种。

1.4肺癌小鼠模型的建立

24只BALB/c小鼠适应性喂养2周，取对数生长期的A549细胞，密度用DMEM培养基调整至5×10⁶/mL，按每只0.2mL A549细胞悬液皮下注射于消毒后的小鼠右前肢腋窝靠背部0.3-0.5cm处。自接种之日起隔天观察各组小鼠生长状态及成瘤时间。

1.5动物分组与处理

接种后第15天，全部动物接种部位均可触及肿块，且肿块稳定增长，约4mm×4mm大小。照随机数字表法分为4组，各组间肿瘤大小无差异：a.长春瑞滨+顺铂组：长春瑞滨腹腔注射2.1mg/kg/次，顺铂腹腔注射5mg/kg/次，同时灌胃灭菌蒸馏水2mL/只；b.茯苓多糖组：40mg/mL茯苓多糖灌胃，2mL/只，同时腹腔注射等量0.9％生理盐水；c.茯苓多糖联合长春瑞滨+顺铂组：40mg/mL茯苓多糖灌胃，2mL/只，长春瑞滨腹腔注射2.1mg/kg/次，顺铂腹腔注射5mg/kg/次；d.生理盐水组(对照组)：腹腔注射等量0.9％生理盐水，同时灌胃灭菌蒸馏水2mL/只；腹腔注射D1，隔天灌胃1次。用药后21天，眼眶静脉丛取血，后脱颈椎处死小鼠并解剖，取各组瘤体、脾标本，检测相关指标。

1.6检测指标及方法

1.6.1体质量检测

自用药起观察各组小鼠的进食及一般状况，如饮食、活动、精神状态等；每两天测量小鼠体重变化情况，计算体质量减轻百分率：体质量减轻百分率＝(用药前体质量-用药后体质量)/用药前体质量×100％。

1.6.2肿瘤生长情况检测

自用药起每两天用游标卡尺测量皮下肿瘤的最长径(a)、最短径(b)，肿瘤体积V＝ab²/2。将测得的肿瘤体积与第1天的进行比较，得到相对肿瘤体积，测量21天后绘制相对肿瘤体积变化曲线，并计算肿瘤抑制率：肿瘤抑制率＝(对照组平均瘤体积一给药组平均瘤体积)/对照组平均瘤体积×100％；合并用药疗效根据Webb氏分数乘积法计算：(fa)₁和(fa)₂分别为两药的抑瘤率，(fa)_1，2为药物联合的抑瘤率；如果q>1则表示两药有协同作用。

1.6.3脾脏质量的测量及脾指数的计算

解剖小鼠，取脾脏，剥去脾脏上的脂肪，称取脾脏质量并记录。以脾脏质量计算脾指数：脾指数(mg/g)＝脾脏质量(mg)/小鼠体重(g)×10。

1.6.4外周血通过ELISA检测TNF-α，IL-2

经小鼠眼眶静脉采血，离心取上清，按ELISA试剂盒的说明书检测血清中TNF-α，IL-2含量。

1.7统计学方法

采用SPSS22.0统计软件；检验水平以P<0.05为差异有显著性。各组数据采用表示，进行正态性检验和方差齐性检验，当数据服从正态分布和方差齐性时，采用用单因素方差分析法；当数据不服从正态分布活方差齐性时，采用用Kruskal-Wall检验。

2、结果

2.1小鼠生长状况变化情况

单用茯苓多糖组和生理盐水组情况尚可，饮食、饮水、大便正常。长春瑞滨+顺铂组、茯苓多糖联合长春瑞滨+顺铂组均有部分小鼠出现消瘦、精神差、大便含较多黏液的状况，其中前者状况更明显。但整个实验过程中，小鼠均能耐受，未发生小鼠死亡事件。

2.2小鼠体质量变化情况

与给药前第0天相比，各组体质量均出现不同程度下降的状况。各组小鼠体质量在1周内无显著差异，随着用药时间的延长，生理盐水组和茯苓多糖组体质量变化不明显，而长春瑞滨+顺铂组下降最快，茯苓多糖联合长春瑞滨+顺铂组次之。在连续给药21天后，各组小鼠体质量由重到轻依次为茯苓多糖组、生理盐水组、长春瑞滨+顺铂组、茯苓多糖联合长春瑞滨+顺铂组。给药前各组体质量比较差异无统计学意义(P>0.05)；给药后长春瑞滨+顺铂组小鼠体质量减轻20.77％，较生理盐水组组明显减轻(P<0.05)；茯苓多糖联合长春瑞滨+顺铂组小鼠体质量减轻12.90％，与长春瑞滨+顺铂组相较下降减少，其差异具有统计学意义(P<0.05)，说明茯苓多糖能降低长春瑞滨+顺铂对小鼠体质量的影响。见图1和表1。

表1各组荷瘤小鼠用药前后体质量比较

注：与生理盐水组相较，*P<0.05；与长春瑞滨+顺铂组相较，#P<0.05。

2.3小鼠肿瘤生长情况

A549细胞接种于小鼠皮下后第3天，在接种部位可见约3mm×3mm大小的小结节，但随后结节逐渐缩小，至第9天起结节逐渐稳定增长。至接种后第15天24只小鼠全部成瘤，大小约为4mm×4mm。

根据相对肿瘤体积变化曲线可知，生理盐水组肿瘤生长明显比其他用药组更快(P<0.05)；而茯苓多糖联合长春瑞滨+顺铂组肿瘤生长速度较长春瑞滨+顺铂组和茯苓多糖组慢(P<0.05)。生理盐水组的平均肿瘤体积及抑瘤率与其他用药组比较，P<0.05，差异具有统计学意义；茯苓多糖联合长春瑞滨+顺铂组的平均肿瘤体积及抑瘤率与长春瑞滨+顺铂组相较，P<0.05，差异具有统计学意义。根据Webb氏分数乘积法计算q>1，说明茯苓多糖和长春瑞滨+顺铂有协同作用。见图2和表2。

表2各组荷瘤小鼠移植瘤体积及抑瘤率

注：与生理盐水组相较，*P<0.05；与长春瑞滨+顺铂组相较，#P<0.05.

2.4药物对脾脏指数的影响

长春瑞滨+顺铂组脾指数与生理盐水组相较明显降低，P<0.05，差异具有高度统计学意义；茯苓多糖联合长春瑞滨+顺铂组较长春瑞滨+顺铂组脾指数明显增高，P<0.05，差异具有统计学意义。

表3各组荷瘤小鼠脾脏指数比较

注：与生理盐水组相较，*P<0.05；与长春瑞滨+顺铂组相较，#P<0.05.

2.5药物对外周血TNF-α，IL-2的影响

与生理盐水组比较，长春瑞滨+顺铂组外周血TNF-α、IL-2均减少，其差异具有统计学意义(P<0.05)；与生理盐水组比较，茯苓多糖组外周血TNF-α、IL-2均增加，差异具有统计学意义(P<0.05)；与长春瑞滨+顺铂组比较，茯苓多糖联合长春瑞滨+顺铂组外周血TNF-α、IL-2均增加，差异显著具有统计学意义(P<0.05)。见图3和表4。

表4各组荷瘤小鼠外周血TNF-α，IL-2比较

3、讨论

目前对NSCLC的早期诊断存在一定困难，确诊时多为晚期，给NSCLC的治疗提供了较大难度，临床上治疗多采用化疗，其中长春瑞滨联合顺铂是临床一线治疗的主要方案之一。有研究表明，长春瑞滨联合顺铂对晚期NSCLC有较好的疗效，然而由于其免疫功能抑制、胃肠系统毒副作用及骨髓抑制等毒副作用的存在且易产生耐药性，使得患者对化疗的耐受程度明显降低。因此，在对NSCLC化疗过程中，寻找一种有效、安全、低毒同时能提高机体免疫功能、协同增强机体抗肿瘤能力的综合治疗方案具有重要意义。

关于诱发肿瘤的因素虽然有很多，但基于机体免疫功能下降，致使肿瘤前体细胞逃脱免疫监视而发生肿瘤已是普遍认识。茯苓多糖，是中药“四君八珍之一”茯苓的活性提取物，具有免疫调节和抗肿瘤的作用。研究表明，茯苓多糖可对免疫器官具有保护作用，同时能够激活巨噬细胞系统和T、B淋巴细胞并可诱导TNF-α和IL-2的产生，增强机体免疫力，进而增强机体抗肿瘤能力。

因而本发明中结合使用茯苓多糖、长春瑞滨和顺铂，解决了长春瑞滨联合顺铂使用时患者免疫功能抑制、胃肠系统毒副作用及骨髓抑制等毒副作用存在，且易产生耐药性，使得患者对化疗的耐受程度明显降低的问题。且本发明与长春瑞滨联合顺铂使用相比，还显著提升了药物对非小细胞肺癌的肿瘤抑制效果，取得了意料之外的技术效果。

4、结论

本研究结果表明，茯苓多糖联合长春瑞滨+顺铂对人非小细胞癌A549的生长具有很强的抑制作用，抑瘤率明显高于茯苓多糖、长春瑞滨+顺铂单独给药，与化疗药具有一定的协同作用。此外，长春瑞滨+顺铂组体质量、脾指数明显下降，而茯苓多糖联合长春瑞滨+顺铂组体质量、脾指数明显高于长春瑞滨+顺铂组，表明茯苓多糖具有健脾胃稳定体质量的作用，从而减低化疗对胃肠道和免疫器官的毒副作用。同时茯苓多糖联合长春瑞滨+顺铂组和茯苓多糖组IL-2较其他组含量明显增高，差异明显，TNF-α也有增高趋势，但由于样本含量低，其差异不明显，这些细胞因子均是强免疫增强剂，其水平上调可抑制肿瘤生长并诱导肿瘤细胞死亡。由此提示茯苓多糖联合长春瑞滨+顺铂可减轻化疗所致的毒副作用并协同增强疗效，其机制可能与茯苓多糖具有免疫调节作用有关。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演和替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种用于抑制肿瘤细胞的药物组合物，包括长春瑞滨、顺铂和茯苓多糖。

2.根据权利要求1所述药物组合物，其特征在于，所述长春瑞滨和顺铂为注射剂，所述茯苓多糖为口服剂或注射剂。

3.根据权利要求1所述药物组合物，其特征在于，所述药物组合物用于抑制肺癌细胞。

4.根据权利要求3所述药物组合物，其特征在于，所述药物组合物为用于抑制非小细胞肺癌的药物组合物。

5.根据权利要求1～4中任意一项所述药物组合物，其特征在于，所述药物组合物中长春瑞滨、顺铂和茯苓多糖的质量比例为1：0.1～50：50～50000，优选1：0.5～30：100～10000。

6.根据权利要求5所述药物组合物，其特征在于，所述药物组合物中长春瑞滨、顺铂和茯苓多糖的质量比例为1：1～5：500～5000。