CN101711778A - 用于抑制肿瘤和防治转移及复发的茯苓多糖组合物与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种从茯苓属植物中提取的用于治疗肿瘤和防治肿瘤转移及术后复发的茯苓多糖组合物。它含有茯苓属植物中通过分级醇沉方法得到的不同分子量的多糖，总醇沉物多糖含量大于50-80％，重均分子量道尔顿范围为0.2-3万。其中醇沉物3(60％醇沉茯苓多糖)和醇沉物4(80％醇沉茯苓多糖)具有明显的激活多形核白细胞，提高其杀伤肿瘤细胞的能力，从而发挥治疗肺癌、肝癌和结肠癌等肿瘤和防治其转移及术后复发的作用。药理实验证实：本发明的组合物疗效显著，安全有效且未出现任何毒副反应。本发明的中药组合物可以被制备成任何一种治疗肿瘤和抑制肿瘤转移及术后复发的制剂。

Description

用于抑制肿瘤和防治转移及复发的茯苓多糖组合物与应用

技术领域

本发明属于中药制药技术领域，涉及具有治疗肿瘤和抑制肿瘤转移及术后复发活性的茯苓多糖组合物及其制备方法以及在制备药物中应用。更具体的说是通过分级醇沉将不同分子量的茯苓多糖分开，制备具有激活多形核白细胞，提高其杀伤肿瘤细胞能力而发挥治疗肿瘤和防治肿瘤转移及术后复发作用的药物。

背景技术

茯苓多糖(Pachymaran)来源于多孔菌科真菌茯苓(Poriacocos Wolf)。茯苓是我国传统的中药材，被视为“中药八珍”之一，味甘、平，入心脾、胃、肾经，有健脾健肾、宁心安神等功效。现代药理学作用表明，茯苓多糖能增强人体免疫功能，提高人体抗病能力，起到防病、延缓衰老的作用。

以往研究表明，茯苓核中抗肿瘤作用的有效成分为β-茯苓聚糖(β-Pachyman)，约占茯苓核干重的93％，β-茯苓聚糖转化成为β-茯苓多糖(β-Pachymaran)才具有活性。茯苓聚糖(pachyman)是含有少量β-(1→6)葡聚糖支链的β-(1→3)-D-葡聚糖，无抗肿瘤活性。经化学修饰切去茯苓聚糖分子主链上的β-(1→6)葡聚糖支链后，得到β-(1→3)-D-葡聚糖称为茯苓多糖(pachymaran)，茯苓多糖经羧甲基化得到溶于水的羧甲基茯苓多糖，具有较强的抗肿瘤活性，能减轻癌症患者放、化疗的毒副反应，并使患者的免疫功能得到改善。

选择适合茯苓的提取方法，最大限度的提取茯苓的有效成分是研究茯苓药理作用的基础。现有两种最新的提取方法，能使水溶性多糖的提取率得到明显的提高，即采用微波技术提取法和复合酶热水浸提法提取法。前者与传统的萃取方法相比，具有选择性高、操作时间短、溶剂消耗量少、有效成分得率高、适合于热不稳定成分等优点，而且作为吸收微波最好介质的水也是中药提取的主要提取剂。后者由于酶的作用具有专一性，不会破坏茯苓多糖的结构，且蛋白酶可降解获荃中所含蛋白质，从而使杂质含量低，可以在较低的温度下提高多糖的提取率。

茯苓多糖抗肿瘤的作用是通过以下方式来体现的：

1.茯苓多糖对细胞膜磷脂酰肌醇(PI)转换具有明显抑制作用。近年来发现，某些肿瘤细胞的PI转换增强，癌基因编码产物如EGF、PDGF、TGF等能促进细胞的PI转换，许多癌基因在肿瘤形成早期，PI激酶活性也增加，抑制和干扰PI转换，则可影响肿瘤生长发育。因此，茯苓多糖通过对PI转换的影响可产生抑制肿瘤细胞的作用。

2.肿瘤细胞膜磷脂的脂肪酸组成明显改变，主要是花生四烯酸比例升高，花生四烯酸在自由基攻击下发生过氧化发应的产物具有促进肿瘤发生和生长的作用。茯苓多糖可以改变其磷脂的脂肪组成，降低花生四烯酸和豆蔻酸的含量，从而发挥抗肿瘤作用。茯苓多糖还可通过升高肿瘤细胞膜上的唾液酸量，影响细胞表面电荷特性，细胞膜的物质转运，抗原决定簇的暴露以及改变免疫细胞的活化膜表面受体的功能，从而发挥抑制肿瘤细胞增殖的作用。

3.茯苓多糖可通过抑制肿瘤细胞DNA、RNA的合成发挥直接杀伤肿瘤细胞的作用

4.激活机体的免疫监视系统也是茯苓多糖发挥抗肿瘤作用的主要机制  已有实验表明证明茯苓多糖可在体内外促进细胞因子的释放，对抗化疗药物对细胞因子的抑制作用。可诱导T淋巴细胞产生IL-2、IL-6、IFN-a、IFN-g、TNF、LT、LR等，并能提高某些因子的活性。IL-2能诱导TH细胞和TC细胞增殖，增强NK细胞及淋巴因子活化的杀伤细胞(LAK)的活性，茯苓多糖还能增强巨噬细胞识别功能，提高巨噬细胞的吞噬指数，并能通过增强TNF基因的转录而增强巨噬细胞释放TNF，并增强其活性。TNF不仅直接参与单核细胞对肿瘤细胞的杀伤，而且能通过抑制基因转录活性，特异地降低myc基因mRNA的表达水平，使人白细胞抗原(HLA)的mRNA表达水平升高，增强细胞免疫尤其是细胞毒性T淋巴细胞(CTL)活性，间接发挥杀伤肿瘤细胞的作用。

5.增强脾、胸腺功能，对抗肿瘤及化疗药物对胸腺、脾脏的抑制  脾、胸腺乃至骨髓都是人体重要的免疫器官，在肿瘤患者中多会出现脾及胸腺的功能低下，而放疗、化疗又对脾、胸腺及骨髓功能有不同程度的抑制。茯苓多糖在保护与提高脾、胸腺功能，增加脾、胸腺指数方面的作用已为多数体内外实验证实。

6.对体液免疫的作用：机体的免疫应答有赖于体液免疫与细胞免疫的综合作用，巨噬细胞，NK细胞发挥抗肿瘤作用的重要机制之一便是介导体液免疫的B细胞所参与的抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)，因此对B细胞及体液免疫的增强在抗肿瘤治疗中有积极意义。实验证明茯苓多糖可使血清免疫球蛋白的IgG和IgM水平提高，从而促进体液免疫。

在安全性方面，羧甲基茯苓多糖(CMP)无论是口服，还是腹腔注射或静脉注射，安全剂量都较大。小鼠静脉注射给药，LD50为3.13/kg。犬长期毒性实验的高剂量组为LD50为10/kg，低剂量组为20/kg，连续3个月，未出现毒性反应。CMP的人拟临床给药途径是静脉注射，最大剂量拟定为2mg/kg·d，可以推算人拟最大剂量的78～156倍是安全的。以细菌为指示生物的鼠伤寒沙门氏菌致突变实验的体外实验中，遗传学终点为基因突变。在每皿中加入CMP的剂量在0.5μg～5.0mg范围内，均能证明CMP为非致突变物。小鼠骨髓多染红细胞微核实验的结果表明，相当于人拟临床最大剂量的125倍(250mg/kg)无致突变的结果，提示CMP为非致突变物。大鼠致畸胎实验的结果表明，相当于人拟临床最大剂量的125倍(250mg/kg·d)，对妊娠大鼠无致畸胎的结果。

发明内容

本发明要解决的技术问题，是提供一种分级醇沉得到的茯苓多糖组合物(也可称为有效部位)，其可与常规的药用载体混合，制备具有治疗肿瘤和抑制肿瘤转移及术后复发活性的茯苓多糖药物组合物。为达到上述目的本发明提供了如下的技术方案：

一种用于抑制肿瘤生长和防治其转移及复发的茯苓多糖组合物，其特征在于含有茯苓属植物中通过分级醇沉方法得到的不同分子量的多糖，总醇沉多糖含量为50-80％；其重均分子量道尔顿范围为0.2-3万。

本发明优选的茯苓多糖组合物。它是通过分级醇沉将不同分子量分布的醇沉物1、醇沉物2、醇沉物3和醇沉物4茯苓多糖分开，得到不同分子量的多糖，也可以将醇沉物3与醇沉物4混合，得到醇沉物3与醇沉物4的组合物。其中总醇沉多糖含量为60-70％；其重均分子量道尔顿范围为0.2-2万。

本发明所述的茯苓多糖组合物，其中的茯苓多糖为含量大于60％的3、4醇沉物；其分子量范围为0.2-1.5万。它是通过分级醇沉，将醇沉物3(60％醇沉茯苓多糖)和醇沉物4(80％醇沉茯苓多糖)混合，其中醇沉物3、醇沉物4含量均大于60％；形成具有明显激活多形核白细胞，提高其杀伤肿瘤细胞能力的组合物，从而发挥防治肿瘤转移及术后复发的作用。

本发明所述茯苓多糖组合物可以按如下的方法制备：

(1)称取茯苓切片后粉碎，加入3-12倍重量份数的水，回流提取2-3次，合并提取液滤过，除去不溶性杂质；

(2)取提取液减压蒸馏浓缩，浓缩液边搅拌边加入乙醇，使含醇量达到80％，静置，过滤，收集沉淀；

(3)加水溶解沉淀并煮沸，趁热过滤除去不溶物，滤液边搅拌边加入乙醇，使含醇量达到80％，放置，析出沉淀后过滤，使沉淀物在40-70℃干燥，得茯苓总多糖粗品；

(4)将茯苓总多糖粗品按1：4加蒸馏水使其溶解，加入乙醇使含醇量达到20％，静置，过滤得沉淀物1；滤液再加乙醇使含醇量达到40％，静置，过滤得沉物2；滤液再加乙醇使含醇量达到60％，静置，过滤得沉物3；滤液再加乙醇使含醇量达到80％，静置，过滤得沉物4；

(5)采用酚-硫酸紫外分光光度法测定总茯苓多糖的含量为：56.2％；高效液相凝胶(HPGPC)色谱图计算平均相对分子质量的范围为0.2-3万。其中醇沉物3、4采用酚-硫酸紫外分光光度法测定多糖含量均大于60％；高效液相凝胶(HPGPC)色谱图计算平均相对分子质量的范围为0.2-1.5万。

在本发明的一个优选实施例中，茯苓多糖提取分离及精制的方法如下：

1：提取：

称取茯苓500g，切片后粉碎，加入2.5L的水，回流提取3次，每次提取2h；合并3次提取液滤过，除去不溶性杂质。取1000mL提取液减压蒸馏浓缩成100ml，浓缩液边搅拌边加入乙醇，使含醇量达到80％，静置12h，10000rpm离心，收集沉淀；加蒸馏水50ml溶解煮沸，趁热过滤除去不溶物，滤液在搅拌下再加入乙醇，使含醇量达到80％，放置，析出沉淀后，40-70℃干燥，得茯苓多糖粗品。

2：含量测定：

酚-硫酸紫外分光光度法测定茯苓多糖的含量。多糖在强酸作用下水解生成单糖，并迅速脱水生成糠醛，糠醛与酚性物质如苯酚缩合成有色化合物，有色物生成量与多糖浓度存在定量关系，用分光光度法在490nm处测定。以葡萄糖做为对照品。产品中多糖含量为：56.2％。

3：多糖的分子量段的筛选

通过分级醇沉可将不同分子量分布的多糖分开。将总多糖按1∶4加蒸馏水使其溶解，加入乙醇，使溶液含醇量达到20％，静置，过滤得沉淀物1，滤液再加醇达到40％，静置，过滤得沉物2，滤液再加醇达到60％，静置，过滤得沉物3，滤液再加醇达到80％，静置，过滤得沉物4。四种沉淀物分别作药效评价。

4：多糖的GPC分子量分布分析

根据在凝胶柱上不同分子量的多糖与洗脱保留时间(tR)成一定关系的特性，先用各种已知分子量的多糖制成标准曲线，然后由样品的保留时间(tR)从曲线中求得分子量分布范围。依据HPGPC校正曲线及茯苓多糖凝胶色谱图计算各组分的平均相对分子质量。选择Pullulan标样，计算茯苓多糖的各组分相对分子量及分子量分布。结果表明，沉物3合并沉物4相对分子量范围为0.2-1.5万。

本发明进一步公开了具有激活多形核白细胞，提高其杀伤肿瘤细胞能力而发挥防治肿瘤转移及术后复发作用的茯苓多糖组合物与一种或多种药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂制备成各种药物组合物，包括注射剂(粉针剂、水针剂、输液剂)、各种固体口服制剂、液体口服制剂等。

当非肠道给药时，本发明所述的具有抗肿瘤活性的茯苓多糖组合物可以被制成注射剂形式给药，给药剂量依治疗对象、给药方式、症状及其它因素而改变。本发明的茯苓多糖组合物在相当宽的剂量范围内是有效的。例如每天服用的剂量可在每公斤体重大约0.1mg-1000mg的范围内。在成人的治疗中，剂量范围最好是在1mg/kg-10mg/kg，一次或几次给予。实际注射茯苓多糖组合物的剂量应该由医生根据有关的情况来决定，这些情况包括被治疗者的身体状态、年龄、体重、患者对药物的个体反应、患者症状的严重程度等等，因此上述剂量范围并不是以任何方式限制本发明的范围。为制备注射用冻干粉针剂可采用甘露醇、氯化钠等材料作载体，保证粉针剂的形态及溶解性能。

当口服给药时，组合物可配制成片剂、分散片、糖衣剂、颗粒剂、干粉剂、溶液剂或胶囊。为制备口服药物组合物可采用乳糖或淀粉做载体，明胶，羧甲基纤维素钠，甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等是合适的粘合剂。作为崩解剂可选用淀粉或微晶纤维素，常以滑石粉，胶体硅胶，硬脂酸甘油酯，硬脂酸钙或镁，聚乙二醇-4000，聚乙二醇-6000，焦亚硫酸钠等；作为合适的抗粘合剂和润滑剂。例如，可通过压制湿颗粒来制备片剂。活性成分与载体以及选择性的与一份崩解添加剂组成混合物，该混合物与粘合剂的含水溶液，醇性或含水醇性溶液在合适的设备中进行颗粒化，干燥颗粒随后加入其它的崩解剂，润滑剂和抗粘剂将此混合物压片。

本发明更进一步公开了茯苓多糖组合物在制备促进多形核白细胞杀伤肿瘤细胞药物方面的应用。药物作用于白细胞后，激活了多形核白细胞，提高了多形核白细胞杀伤肿瘤细胞的能力，从而达到治疗肿瘤和防治肿瘤转移与术后复发的目的，为治疗肿瘤和防治肿瘤患者术后复发及肿瘤细胞转移提供了新的治疗方法及组合药物。

本发明通过在体、离体实验相结合，发现了茯苓多糖组合物，包括茯苓总多糖(醇沉物1、醇沉物2、醇沉物3和醇沉物4或醇沉物3与醇沉物4的组合)在激活多形核白细胞，治疗肿瘤和防治肿瘤患者术后复发及肿瘤细胞转移等方面的应用。具体包括：

茯苓总多糖组合物在制备治疗肝癌药物方面的应用。

茯苓总多糖组合物在制备治疗肺腺癌药物方面的应用。

茯苓总多糖组合物在制备治疗结肠癌药物方面的应用。

茯苓总多糖组合物在制备治疗黑色素瘤细胞杀伤作用方面的应用。

进一步还包括：茯苓总多糖对小鼠移植性肺腺癌和肝癌生长及转移的抑制作用方面的应用。茯苓多糖醇沉物3、醇沉物4对移植性肺腺癌和肝癌小鼠实体瘤质量减少，肺脏和肝脏组织瘤栓和转移灶明显减少，显示其具有治疗肿瘤和抑制肿瘤转移的作用。

实验具体内容如下：

一、离体实验：

茯苓多糖促进多形核白细胞杀伤体外培养肿瘤细胞的作用

1、大鼠多形核白细胞分离

取12月龄大鼠一只，乙醚麻醉，心脏取血3mL，加入肝素抗凝的试管中，再加入到等量Ficoll(有市售)上层，1800rpm离心20分钟后取PMN(多形核白细胞层)，台盼兰计数活细胞数占总细胞数95％以上，调整多形核白细胞数至1×10⁴个/mL，备用。

2、肿瘤细胞培养

选取肺腺癌细胞株(人肺腺癌A549细胞和小鼠肺腺癌LA795细胞，有市售)、肝癌细胞株(人肝癌HepG-2细胞和人肝癌7402细胞，有市售)、结肠癌细胞株(有市售)和黑色素瘤细胞株A-375(有市售)，将传代的肿瘤细胞1×10³/孔，种于24孔板，培养24小时备用。

3、茯苓总多糖激活多形核白细胞对培养肿瘤细胞杀伤作用的影响

将分离出的多形核白细胞以1×10⁴个/mL/孔接种于24孔板，加入茯苓总多糖(采用实施例1方法获得)，使其终浓度分别为250ug/mL，125ug/mL，并作空白对照(只接种多形核白细胞，加入等量培养基)。作用2小时后，平板离心机离心，弃上清，用1mL全培养基重悬后加入预先培养有癌细胞的24孔板，即将经过药物作用的多形核白细胞与未经药物作用的癌细胞共培养，4小时后，倒置显微镜下观察，每孔随机取5个10*10倍视野，照像并计数多形核白细胞在肿瘤细胞周围形成玫瑰花环样结构的比例。弃培养基，台盼兰染色，每孔随机取5个10*10倍视野，照像，观察并计数癌细胞死亡比例。

结果如下：

(1)茯苓总多糖激活多形核白细胞对肺腺癌细胞(A549)杀伤作用的影响

药物(ug/mL)	花环形成率(％)	癌细胞死亡率(％)
			茯苓总多糖250	32.77±17.99*	23.12±3.01*
茯苓总多糖125	25.99±6.02*	18.51±2.88*
			空白	10.67±4.33	3.16±3.05

(2)茯苓总多糖激活多形核白细胞对肺腺癌细胞(LA795)杀伤作用的影响

药物(ug/mL)	花环形成率(％)	癌细胞死亡率(％)
			茯苓总多糖250	35.52±7.86*	29.21±5.23*
茯苓总多糖125	25.89±7.45*	17.45±5.67*
			空白	14.45±3.23	4.25±2.51

(3)茯苓总多糖激活多形核白细胞对肝癌细胞(HepG-2)杀伤作用的影响

药物(ug/mL)	花环形成率(％)	癌细胞死亡率(％)
			茯苓总多糖250	44.34±16.72*	29.06±5.21*
茯苓总多糖125	29.57±11.82*	19.35±3.67*
			空白	12.02±3.44	5.73±2.49

(4)茯苓总多糖激活多形核白细胞对肝癌细胞(7402)杀伤作用的影响

药物(ug/mL)	花环形成率(％)	癌细胞死亡率(％)
			茯苓总多糖250	38.43±7.68*	22.08±6.78*
茯苓总多糖125	32.72±9.76*	15.33±3.78*
			空白	13.33±5.86	6.36±3.54

(5)茯苓总多糖激活多形核白细胞对结肠癌细胞杀伤作用的影响

药物(ug/mL)	花环形成率(％)	癌细胞死亡率(％)
			茯苓总多糖250	36.35±9.79*	35.04±9.33*
茯苓总多糖125	33.22±10.09*	31.25±5.63*
			空白	17.51±9.88	6.40±3.01

(6)茯苓总多糖激活多形核白细胞对黑色素瘤细胞杀伤作用的影响

药物(ug/mL)	花环形成率(％)	癌细胞死亡率(％)
			茯苓总多糖250	38.97±10.24*	30.07±2.69*
茯苓总多糖125	35.37±12.68*	21.30±3.08*
			空白	15.40±9.30	6.51±2.76

*，与空白组比较差异有显著性。

小结：茯苓总多糖作用多形核白细胞2小时，可明显提高多形核白细胞对人肺腺癌A549细胞、小鼠肺腺癌LA795细胞、人肝癌HepG-2细胞、人肝癌7402细胞、结肠癌细胞株和黑色素瘤细胞株A-375细胞玫瑰花环形成率及对肿瘤细胞的杀伤力。

4、不同分子量段茯苓多糖对多形核白细胞对培养肿瘤细胞杀伤作用的影响

我们通过将茯苓总多糖以20％，40％，60％，80％醇沉，得醇沉物1，2，3，4。鉴于茯苓总多糖有提高多形核白细胞杀伤肿瘤细胞的能力，且由于其激活多形核白细胞的特定抗肿瘤作用机理，使其对各肿瘤细胞均有很明显的杀伤作用，因此我们以肺腺癌、肝癌、结肠癌等细胞为代表，进一步考察并筛选了不同分子量段茯苓多糖激活多形核白细胞对培养肿瘤细胞杀伤作用的影响，方法同前。

结果如下：

(1)茯苓多糖醇沉物激活多形核白细胞对肺腺癌细胞(A549)杀伤作用的影响

药物	花环形成率(％)	癌细胞死亡率(％)
			醇沉物1--250ug/mL	18.23±7.63	10.12±4.18
醇沉物1--125ug/mL	15.26±5.79	8.56±3.33
			醇沉物2--250ug/mL	26.26±3.14	11.42±4.67
醇沉物2--125ug/mL	22.28±5.25	9.52±3.16
			醇沉物3--250ug/mL	44.89±6.77*	35.18±5.27*
醇沉物3--125ug/mL	40.18±7.52*	31.21±7.68*
			醇沉物4--250ug/mL	50.29±6.83*	36.28±6.92*
醇沉物4--125ug/mL	41.64±9.03*	34.27±7.99*
			空白	16.57±7.32	7.22±2.56

(2)茯苓多糖各醇沉物激活多形核白细胞对肺腺癌细胞(LA795)杀伤作用的影响

药物	花环形成率(％)	癌细胞死亡率(％)
			醇沉物1--250ug/mL	17.36±7.28	6.23±2.18
醇沉物1--125ug/mL	15.35±7.89	9.28±3.45
			醇沉物2--250ug/mL	25.26±3.16	8.43±3.59
醇沉物2--125ug/mL	22.28±5.17	9.56±4.12
			醇沉物3--250ug/mL	45.98±7.79*	35.22±5.47*
醇沉物3--125ug/mL	38.64±5.52*	30.61±7.46*

药物	花环形成率(％)	癌细胞死亡率(％)
			醇沉物4--250ug/mL	48.29±7.83*	35.28±5.92*
醇沉物4--125ug/mL	40.14±9.12*	35.97±8.99*
			空白	16.68±9.23	7.12±3.56

(3)茯苓多糖各醇沉物激活多形核白细胞对肝癌细胞(HepG-2)杀伤作用的影响

药物	花环形成率(％)	癌细胞死亡率(％)
			醇沉物1--250ug/mL	19.36±5.97	10.21±4.18
醇沉物1--125ug/mL	18.26±6.79	9.56±3.45
			醇沉物2--250ug/mL	22.26±5.14	8.42±4.68
醇沉物2--125ug/mL	16.17±3.16	9.56±4.12
			醇沉物3--250ug/mL	44.96±4.77*	35.22±6.57*
醇沉物3--125ug/mL	44.78±6.59*	32.51±3.76*
			醇沉物4--250ug/mL	45.29±7.83*	38.26±5.89*
醇沉物4--125ug/mL	38.64±5.12*	31.47±7.79*
			空白	18.77±5.43	8.17±4.56

(4)茯苓多糖各醇沉物激活多形核白细胞对肝癌细胞(7402)杀伤作用的影响

药物	花环形成率(％)	癌细胞死亡率(％)
			醇沉物1--250ug/mL	15.28±5.97	8.24±3.28
醇沉物1--125ug/mL	17.55±6.89	9.68±4.36
			醇沉物2--250ug/mL	25.34±6.73	9.46±4.29
醇沉物2--125ug/mL	24.28±7.25	10.51±4.12
			醇沉物3--250ug/mL	54.98±9.77*	40.22±5.47*
醇沉物3--125ug/mL	47.69±8.52*	38.42±5.76*

醇沉物4--250ug/mL	49.29±7.23*	32.28±6.92*
			醇沉物4--125ug/mL	42.74±8.12*	33.34±3.87*
空白	16.77±6.43	9.12±4.58

(5)茯苓多糖各醇沉物激活多形核白细胞对结肠癌细胞杀伤作用的影响

药物	花环形成率(％)	癌细胞死亡率(％)
			醇沉物1--250ug/mL	15.26±6.98	8.72±4.18
醇沉物1--125ug/mL	16.55±7.91	9.68±4.25
			醇沉物2--250ug/mL	25.14±9.23	10.42±4.39
醇沉物2--125ug/mL	28.28±7.85	8.53±4.77
			醇沉物3--250ug/mL	54.69±9.66*	45.22±6.47*
醇沉物3--125ug/mL	38.69±8.52*	30.42±7.68*
			醇沉物4--250ug/mL	45.19±7.93*	38.28±6.92*
醇沉物4--125ug/mL	32.54±6.72*	30.67±6.99*
			空白	14.67±6.32	8.22±3.62

小结：通过以上实验，证明茯苓多糖分段提取后，不同分子量段茯苓多糖成分对多形核白细胞杀伤肿瘤细胞的作用影响不同，其中醇沉物3(60％醇沉茯苓多糖)和醇沉物4(80％醇沉茯苓多糖)作用明显。

二、动物实验：

1、茯苓总多糖对小鼠移植性肺腺癌生长及转移的抑制作用

体外实验显示茯苓总多糖能明显提高多形核白细胞对杀伤肿瘤细胞作用，为了进一步探讨其体内是否能抗移植性肿瘤生长及转移，我们采用LA795转移性肺腺癌模型小鼠进行体内抗肿瘤活性实验。

1、实验方法

1.1药物

本发明制备的茯苓总多糖。阳性对照药：注射用环磷酰胺粉针剂。

1.2动物及细胞株

实验动物采用SPF级近交T739小鼠，雌雄各半，体重(18.0±2.0)g，由中国医学科学院肿瘤医院实验动物中心提供，实验动物合格证号为SCXK11-00-0005；瘤株为LA795小鼠肺腺癌瘤株，由中国协和医科大学基础医学研究所提供。

1.3动物造模

取接种后第6-8天肿瘤生长良好的荷瘤鼠，拉断颈椎处死小鼠，在无菌条件下剥离肿瘤，选择新鲜无坏死的瘤组织剪碎置玻璃研磨器中，加适量生理盐水轻轻研磨制备成瘤细胞悬液，细胞筛过滤后加生理盐水稀释、计数，调配成细胞浓度为1×10⁷/mL的细胞悬液，在冰浴条件下每只0.2mL接种于健康小鼠右前肢腋窝皮下，接种浓度为2×10⁶/mL。

1.4动物分组及给药

接种5天后的小鼠按瘤大小分为：

(1)模型组：每只腹腔注射0.2mL生理盐水；

(2)环磷酰胺组：按20mg/kg，腹腔注射给药；

(3)茯苓总多糖高剂量组：按200mg/kg，腹腔注射给药；

(4)茯苓总多糖低剂量组：按100mg/kg，腹腔注射给药；

实验前将药物用蒸馏水配制成所需的浓度。环磷酰胺性质不稳定，于给药前用无菌生理盐水配制，振荡完全溶解后使用。每日给药1次。给药两周，于给药结束后次日颈部脱臼处死小鼠。

1.2检测指标

1.2.1茯苓总多糖对小鼠移植性肺腺癌体瘤质量大小及抑瘤率的影响

于给药后第15天处死，解剖取其肺脏、肝脏、其中瘤组织称重，分别按下列公式计算抑瘤率：抑瘤率(％)＝[(1-给药组平均瘤质量/对照组平均瘤质量)×100％]。将各组织于10％中性福尔马林保存。

1.2.2茯苓总多糖对小鼠移植性肺腺癌肿瘤转移的影响

将福尔马林中保存的肺、肝脏和做石蜡切片，常规HE染色，光学显微镜下观察各组肺、肝脏内瘤栓与转移灶情况。

1.3统计学处理

各组数据均采用SPSS10.0统计软件进行分析，组间比较使用方差分析。两两比较采用t检验。P＜0.05被认为有显著性差异。

1.4实验结果

1.4.1茯苓总多糖对荷瘤小鼠抑瘤率的影响

环磷酰胺组的瘤重与模型组相比具有显著性差异，茯苓总多糖对肿瘤生长具有不同程度的抑制作用，结果见表1：

表1茯苓总多糖对LA795转移性肺腺癌小鼠瘤重和抑瘤率的影响

组别	剂量(mg/kg/d)	瘤重(g)	抑瘤率(％)
				模型组	--	8.36±2.55	--
环磷酰胺组	20	3.08±1.35*	63.16±8.66
				茯苓总多糖高剂量组	200	4.68±1.25*	44.02±5.35
茯苓总多糖低剂量组	100	5.25±2.01*	37.20±6.32

与模型组比较：*p＜0.05

1.4.2茯苓总多糖对荷瘤小鼠肺脏，肝脏转移病理形态学观察结果

1.4.2.1肺组织病理形态变化

模型组和环磷酰胺组都有较多瘤栓与转移灶，但环磷酰胺组中数量更多面积更大。茯苓总多糖瘤栓与转移灶数量最少且单个面积小，瘤栓极少，只发现散在的小转移灶，其中高剂量组少于低剂量组。

1.4.2.2肝脏病理形态变化

模型组肝脏中瘤栓与转移灶数量多面积大，而环磷酰胺组数量最少，只发现极少量瘤栓。茯苓总多糖组肝脏中瘤栓与转移灶数量最少，其中低剂量组少于高剂量组。

1.5小结

环磷酰胺组实体瘤重量显著减少，但肺中瘤栓与转移灶与模型组比较明显增加。茯苓总多糖组实体瘤质量显著减少，且肺脏组织和肝脏组织瘤栓和转移灶都与模型组比较显著减少，显示其具有治疗肿瘤和抑制肿瘤转移的作用。

2、茯苓多糖醇沉物3，醇沉物4对小鼠lewis肺癌生长及转移的抑制作用

茯苓总多糖对移植性小鼠肺腺癌具有明显抑制实体瘤生长和转移的作用，且体外实验表明茯苓多糖醇沉物3，醇沉物4具有更强的抗肿瘤作用，为了进一步探讨活性茯苓多糖部位及分子量分布，我们采用小鼠lewis肺腺癌模型，对茯苓多糖醇沉物3，醇沉物4进行了进一步的体内抗肿瘤活性实验。

2.1实验方法

2.1.1药物

本发明制备的醇沉物3，醇沉物4。阳性对照药为注射用顺铂。

2.1.2动物及细胞株

实验动物采用SPF级近交传C57BL/6小鼠，雌雄各半，体重(18.0±2.0)g，由中国医学科学院肿瘤医院实验动物中心提供，实验动物合格证号为SCXK11-00-0005；瘤株为lewis小鼠肺腺癌瘤株，由中国协和医科大学基础医学研究所提供。

2.1.3动物造模

取接种后第6-8天肿瘤生长良好的荷瘤鼠，拉断颈椎处死小鼠，在无菌条件下剥离肿瘤，选择新鲜无坏死的瘤组织剪碎置玻璃研磨器中，加适量生理盐水轻轻研磨制备成瘤细胞悬液，细胞筛过滤后加生理盐水稀释、计数，调配成细胞浓度为1×10⁷/mL的细胞悬液，在冰浴条件下每只0.2mL接种于健康小鼠右前肢腋窝皮下，接种浓度为2×10⁶/mL。

2.1.4动物分组及给药

接种7天后的小鼠按瘤大小分为：

(1)模型组：尾静脉注射生理盐水0.2mL/只；

(2)顺铂组：按0.5mg/kg，尾静脉注射给药；

(3)多糖醇沉物3高剂量组：按40mg/kg，尾静脉注射给药；

(4)多糖醇沉物3低剂量组：按20mg/kg，尾静脉注射给药；

(5)多糖醇沉物4高剂量组：按40mg/kg，尾静脉注射给药；

(6)多糖醇沉物4低剂量组：按20mg/kg，尾静脉注射给药；

实验前将药物用蒸馏水配制成所需的浓度。顺铂性质不稳定，于给药前用无菌生理盐水配制，振荡完全溶解后使用。隔天给药1次。给药7次，于给药结束后次日颈部脱臼处死小鼠。

2.2检测指标

2.2.1茯苓多糖醇沉物3，醇沉物4对小鼠lewis肺癌抑瘤率的影响

于给药后第17天处死，解剖取其肺脏、肝脏、肾脏，其中瘤组织称重，分别按下列公式计算抑瘤率：抑瘤率(％)＝[(1-给药组平均瘤质量/对照组平均瘤质量)×100％]。将各组织于10％中性福尔马林保存。

2.2.2茯苓多糖醇沉物3，醇沉物4对小鼠lewis肺癌肿瘤转移的影响

将福尔马林中保存的肺、肝脏、肾脏和做石蜡切片，常规HE染色，光学显微镜下观察各组肺、肝脏、肾脏内瘤栓与转移灶情况。

2.3统计学处理

各组数据均采用SPSS10.0统计软件进行分析，组间比较使用方差分析。两两比较采用t检验。P＜0.05被认为有显著性差异。

2.4实验结果

2.4.1茯苓多糖醇沉物3，醇沉物4对荷瘤lewis小鼠抑瘤率的影响

顺铂组的瘤重与模型组相比具有显著性差异，实体瘤质量显著减少，抑瘤率可达60.19％；茯苓多糖醇沉物3，醇沉物4均可不同程度的减少实体瘤质量，结果见表2：

表2茯苓多糖醇沉物3，醇沉物4对Lewis肺癌瘤重和抑瘤率的影响

组别	剂量(mg/kg)	瘤重(g)	抑瘤率(％)
				模型组	--	7.25±1.20	--
顺铂组	0.5	2.88±0.68*	60.19±4.65
				多糖醇沉物3高剂量	40	3.71±0.89*	45.73±2.38
多糖醇沉物3低剂量	20	5.20±1.20*	30.73±3.22
				多糖醇沉物4高剂量	40	5.19±1.02*	28.39±2.76
多糖醇沉物4低剂量	20	5.85±0.98*	19.32±2.93

与模型组比较：*p＜0.05

2.4.2茯苓多糖醇沉物3，醇沉物4对荷瘤lewis小鼠肺脏，肝脏、肾脏肿瘤转移病理形态学观察结果

2.4.2.1肺组织病理形态变化

各组都有不同程度肺淤血和炎性浸润，模型组有较多瘤栓与转移灶，顺铂组中转移灶较少。茯苓多糖醇沉物3组瘤栓与转移灶数量最少且单个面积小，瘤栓极少，只发现散在的小转移灶，其中高剂量组少于低剂量组。茯苓多糖醇沉物4组有少量瘤栓与转移灶，其中高剂量组少于低剂量组。

2.4.2.2肾脏病理形态变化

顺铂组中部分小鼠的肾脏毛细管存在坏死的情况，其余各组肾脏结构未见明显异常。肾小球、肾小管、毛细血管及间质结构基本正常，管腔均匀，管壁可见内皮细胞分部完整。

2.5小结

顺铂组肺组织中瘤栓与转移灶与模型组比较显著减少，但具有较强的肾脏毒性。茯苓多糖醇沉物3组、4组肺脏组织瘤栓和转移灶都与模型组比较显著减少，显示其具有抑制肿瘤生长及转移的作用，且毒副作用小。

3、茯苓多糖醇沉物3，醇沉物4对转移性肝癌小鼠的影响

鉴于茯苓多糖有提高多形核白细胞杀伤肿瘤细胞的能力，且由于其激活多形核白细胞的特定抗肿瘤作用机理，使其对各肿瘤细胞均有很明显的杀伤作用，在明确茯苓多糖醇沉物3，醇沉物4对肺腺癌生长及转移的影响实验基础上，我们进一步考察了茯苓多糖醇沉物3，醇沉物4对转移性肝癌小鼠模型的影响。

3.1实验方法

3.1.1药物

本发明制备的醇沉物3，醇沉物4。阳性对照药：注射用环磷酰胺粉针剂。

3.1.2动物及细胞株

实验动物采用SPF级昆明小鼠，雌雄各半，体重(18.0±2.0)g，由中国医学科学院肿瘤医院实验动物中心提供，实验动物合格证号为SCXK11-00-0005；瘤株为小鼠肝癌H22细胞株，由中国协和医科大学基础医学研究所提供。

3.1.3动物造模

取小鼠H22肝癌细胞接种于小鼠腹腔内，8天后无菌条件下抽取腹水，0.4％台盼蓝染色，低倍显微镜下计数活细胞率＞90％，用0.9％生理盐水稀释调整浓度，以1×10⁷个/ml，接种于小鼠右腋皮下0.2ml。

3.1.4动物分组及给药

接种5天后的小鼠分为以下几组：

(1)模型组，生理盐水，每只0.2mL，腹腔注射给药；

(2)环磷酰胺组，按20mg/kg，腹腔注射给药；

(3)多糖醇沉物3组，按40mg/kg，腹腔注射给药；

(4)多糖醇沉物3组，按20mg/kg，腹腔注射给药

(5)多糖醇沉物4组，按40mg/kg，腹腔注射给药

(6)多糖醇沉物4组，按20mg/kg，腹腔注射给药

实验前将药物用蒸馏水配制成所需的浓度。环磷酰胺性质不稳定，于给药前用无菌生理盐水配制，振荡完全溶解后使用。每日给药1次。给药两周，于给药结束后次日颈部脱臼处死小鼠。

3.2检测指标

3.2.1茯苓多糖醇沉物3，醇沉物4对转移性肝癌小鼠抑瘤率的影响

于给药后第15天处死，解剖取其肝脏、肺脏，其中瘤组织称重，分别按下列公式计算抑瘤率：抑瘤率(％)＝[(1-给药组平均瘤质量/对照组平均瘤质量)×100％]。将各组织于10％中性福尔马林保存。

3.2.2茯苓多糖醇沉物3，醇沉物4对转移性肝癌小鼠肿瘤转移的影响

将福尔马林中保存的肝脏、肺脏做石蜡切片，常规HE染色，光学显微镜下观察各组肺、肝脏内瘤栓与转移灶情况。

3.3统计学处理

各组数据均采用SPSS10.0统计软件进行分析，组间比较使用方差分析。两两比较采用t检验。P＜0.05被认为有显著性差异。

3.4实验结果

3.4.1茯苓多糖醇沉物3，醇沉物4对荷瘤小鼠瘤重及抑瘤率的影响

环磷酰胺组实体瘤质量显著减少，抑瘤率与模型组相比显著降低；茯苓多糖醇沉物3高剂量组，醇沉物4高剂量组对肿瘤生长均有明显抑制作用，结果见表4：

表4给药组对转移性肝癌小鼠瘤重及抑瘤率的影响

组别	剂量(mg/kg/d)	瘤重(g)	抑瘤率(％)
				模型组	--	2.17±0.85
环磷酰胺组	20	0.96±0.77*	55.76±5.85
				多糖醇沉物3高剂量组	40	1.06±0.85*	51.15±4.83
多糖醇沉物3低剂量组	20	1.56±0.45*	28.11±3.25
				多糖醇沉物4高剂量组	40	1.15±0.48*	47.00±2.68
多糖醇沉物4低剂量组	20	1.34±0.36*	38.24±2.32

与模型组比较：*p＜0.05

3.4.2茯苓多糖醇沉物3，醇沉物4对荷瘤小鼠肝脏、肺脏肿瘤转移病理形态学观察结果

3.4.2.1肝组织病理形态变化

各组都有不同程度炎性浸润，模型组有较多瘤栓与转移灶，茯苓多糖醇沉物3组瘤栓与转移灶数量最少，且单个面积小，瘤栓极少，只发现散在的小转移灶，其中高剂量组少于低剂量组。茯苓多糖醇沉物4组有少量瘤栓与转移灶，其中高剂量组少于低剂量组。

3.4.2.2肺病理形态变化

模型组肝脏中瘤栓与转移灶数量多，面积大。茯苓多糖醇沉物3、醇沉物4各组肝脏中瘤栓与转移灶数量均较少，均明显少于模型组，其中茯苓多糖醇沉物3低剂量组最少。

3.5小结

茯苓多糖醇沉物3、醇沉物4作用于转移性肝癌小鼠模型后，肝中瘤栓与转移灶与模型组比较显著减少，表明其对肝脏肿瘤的转移有明显抑制作用。茯苓多糖醇沉物3组、4组肺脏组织和肝脏组织瘤栓和转移灶都与模型组比较显著减少，显示其具有抑制肿瘤肝转移的作用。

总结

1.茯苓总多糖作用多形核白细胞2小时，可明显提高多形核白细胞在体外培养的肿瘤细胞周围形成玫瑰花环的比例及对肿瘤细胞的杀伤力。

2.茯苓多糖分段提取后，其中醇沉物3(60％醇沉茯苓多糖)和醇沉物4(80％醇沉茯苓多糖)可明显提高多形核白细胞在体外培养的肿瘤细胞周围形成玫瑰花环的比例及对肿瘤细胞的杀伤力。

3.茯苓总多糖及茯苓多糖醇沉物3和醇沉物4能使移植性肺腺癌小鼠实体瘤质量显著减少，肺脏组织和肝脏组织瘤栓和转移灶明显减少，显示其具有治疗肿瘤和抑制肿瘤转移的作用。

4.茯苓多糖醇沉物3和醇沉物4能使移植性肝癌小鼠实体瘤质量显著减少，肺脏组织和肝脏组织瘤栓和转移灶明显减少，显示其具有治疗肿瘤和抑制肿瘤转移的作用。

具体实施方式

为了更充分的解释本发明的实施，提供下述制备方法、制剂的实施实例。这些实施实例仅仅是解释、而不是限制本发明的范围。制剂可以采用本发明中的任意一批的茯苓多糖醇沉物活性成分。其中的茯苓有市售。

实施例1

(1)称取茯苓切片后粉碎，加入10倍重量份数的水，回流提取2次，合并提取液滤过，除去不溶性杂质；

(2)取提取液减压蒸馏浓缩，浓缩液边搅拌边加入乙醇，使含醇量达到80％，静置，过滤，收集沉淀；

(3)加水溶解沉淀并煮沸，趁热过滤除去不溶物，滤液边搅拌边加入乙醇，使含醇量达到80％，放置，析出沉淀后过滤，使沉淀物在60℃干燥，得茯苓总多糖粗品；

(4)将茯苓总多糖粗品按1∶4加蒸馏水使其溶解，加入乙醇使含醇量达到20％，静置，过滤得沉淀物1；滤液再加乙醇使含醇量达到40％，静置，过滤得沉物2；滤液再加乙醇使含醇量达到60％，静置，过滤得沉物3；滤液再加乙醇使含醇量达到80％，静置，过滤得沉物4；

(5)采用酚-硫酸紫外分光光度法测定总茯苓多糖的含量为：56.2％；高效液相凝胶(HPGPC)色谱图计算平均相对分子质量的范围为0.2-3万。其中醇沉物3、4采用酚-硫酸紫外分光光度法测定多糖含量均大于60％；高效液相凝胶(HPGPC)色谱图计算平均相对分子质量的范围为0.2-1.5万。

实施例2

1、提取：

称取茯苓500g，切片后粉碎，加入2.5L的水，回流提取3次，每次提取2h；合并3次提取液滤过，除去不溶性杂质。取1000mL提取液减压蒸馏浓缩成100ml，边搅拌边加入乙醇，使含醇量达到80％，静置12h，10000rpm离心，收集沉淀；加蒸馏水50ml溶解煮沸，趁热过滤除去不溶物，滤液在搅拌下再加入乙醇，使含醇量达到80％，放置，析出沉淀后，低温干燥，得茯苓多糖粗品50g。产品中多糖含量为：56.2％。

2、多糖的分子量段的筛选

通过分级醇沉可将不同分子量分布的多糖分开。将总多糖按1∶4加蒸馏水使其溶解，加入乙醇，使溶液含醇量达到20％，得沉淀物1，0.8g，过滤，滤液再加醇达到40％，得沉物2，1.6g，过滤，滤液再加醇达到60％，得沉物3，22.5g，过滤，滤液再加醇达到80％，得沉物4，10.2g。采用酚-硫酸紫外分光光度法测定总茯苓多糖的含量为：58.9％；高效液相凝胶(HPGPC)色谱图计算平均相对分子质量的范围为1.8万。其中醇沉物3、4采用酚-硫酸紫外分光光度法测定多糖含量均为70％；高效液相凝胶(HPGPC)色谱图计算平均相对分子质量的范围为0.8万。

实施例3：

取沉淀物3，5g，沉淀物4，5g，甘油100ml，葡萄糖50g，注射用水补足至1000ml。制备方法：取处方量的沉淀物3，4，室温下溶于处方量的乙醇和甘油中，搅拌溶解后，加入部分注射用水，搅匀后，加入葡萄糖，搅拌溶解，再补注射用水至1000ml，过滤，灌封，灭菌，即得5ml规格茯苓多糖注射液。采用酚-硫酸紫外分光光度法测定总茯苓多糖的含量为：56.6％；高效液相凝胶(HPGPC)色谱图计算平均相对分子质量的范围为2万。

实施例4：

取沉淀物3，5g，沉淀物4，5g，甘露醇100g，氯化钠90g，注射用水补足至1000ml。制备方法：取处方量的沉淀物3，4，室温下溶于适量的注射用水中，搅拌溶解后，加入甘露醇，搅拌溶解，再补注射用水至1000ml，经6号垂熔滤器除菌滤过，将滤液立即在无菌条件下灌装，每支5ml，冷冻干燥后封口，即得茯苓多糖冻干粉针注射液。采用酚-硫酸紫外分光光度法测定总茯苓多糖的含量为：56.0％；高效液相凝胶(HPGPC)色谱图计算平均相对分子质量的范围为1万。

实施例5：

取沉淀物3，15g，沉淀物4，18g，加入蒸馏水，搅拌溶解，蔗糖适量，再加蒸馏水至1000ml，搅拌均匀，过滤，将滤液在无菌条件下灌装，每支5ml、封口即得茯苓多糖口服液。采用酚-硫酸紫外分光光度法测定总茯苓多糖的含量为：58.4％；高效液相凝胶(HPGPC)色谱图计算平均相对分子质量的范围为0.6万。

实施例6：

取沉淀物3，10g，沉物4，15g。药用淀粉50.0g，50％乙醇适量，制粒，整粒，烘干，装2#胶囊，每粒含茯苓多糖0.1g。采用酚-硫酸紫外分光光度法测定总茯苓多糖的含量为：56.4％；高效液相凝胶(HPGPC)色谱图计算平均相对分子质量的范围为1.2万。

实施例7：

取沉淀物3，8g，沉物4，12g，药用淀粉30.0g，糊精30.0g，50％乙醇适量，将上述原料充分搅拌混合制成颗粒，在60～70℃干燥2～4小时，制成100片，每片含茯苓多糖0.2g。采用酚-硫酸紫外分光光度法测定总茯苓多糖的含量为：57.0％；高效液相凝胶(HPGPC)色谱图计算平均相对分子质量的范围为1.3万。

实施例8：

取沉淀物3，10g，甘油100ml，葡萄糖50g，注射用水补足至1000ml。制备方法：取处方量的沉淀物3，10g，室温下溶于处方量的乙醇和甘油中，搅拌溶解后，加入部分注射用水，搅匀后，加入葡萄糖，搅拌溶解，再补注射用水至1000ml，过滤，灌封，灭菌，即得5ml规格茯苓多糖注射液。采用酚-硫酸紫外分光光度法测定总茯苓多糖的含量为：55.9％；高效液相凝胶(HPGPC)色谱图计算平均相对分子质量的范围为1.5万。

实施例9：

取沉淀物4，25g，加入蒸馏水，搅拌溶解，蔗糖适量，再加蒸馏水至1000ml，搅拌均匀，过滤，将滤液在无菌条件下灌装，每支5ml、封口即得茯苓多糖口服液。采用酚-硫酸紫外分光光度法测定总茯苓多糖的含量为：58.9％；高效液相凝胶(HPGPC)色谱图计算平均相对分子质量的范围为0.3万。

实施例10：

取醇沉物1，2g，醇沉物2，3g，醇沉物3，1.5g，和醇沉物4，3g，甘油100ml，葡萄糖50g，注射用水补足至1000ml。制备方法：取处方量的沉淀物3，4，室温下溶于处方量的乙醇和甘油中，搅拌溶解后，加入部分注射用水，搅匀后，加入葡萄糖，搅拌溶解，再补注射用水至1000ml，过滤，灌封，灭菌，即得5ml规格茯苓多糖注射液。采用酚-硫酸紫外分光光度法测定总茯苓多糖的含量为：56.2％；高效液相凝胶(HPGPC)色谱图计算平均相对分子质量的范围为3万。

实施例11：

取醇沉物1、3g，醇沉物2、5g，醇沉物3，5g，和醇沉物4，7g，药用淀粉30.0g，糊精30.0g，50％乙醇适量，将上述原料充分搅拌混合制成颗粒，在60～70℃干燥2～4小时，制成100片，每片含茯苓多糖0.2g。采用酚-硫酸紫外分光光度法测定总茯苓多糖的含量为：56.0％；高效液相凝胶(HPGPC)色谱图计算平均相对分子质量的范围为2.8万。

实施例12：

取醇沉物1、6g，醇沉物2、4g，醇沉物3，8g，和醇沉物4，7g，药用淀粉50.0g，50％乙醇适量，制粒，整粒，烘干，装2#胶囊，每粒含茯苓多糖0.1g。采用酚-硫酸紫外分光光度法测定总茯苓多糖的含量为：58.9％；高效液相凝胶(HPGPC)色谱图计算平均相对分子质量的范围为2.9万。

在详细说明的较佳实施例之后，熟悉该项技术人士可清楚地了解，在不脱离上述申请专利范围与精神下可进行各种变化与修改，凡依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围。且本发明亦不受限于说明书中所举实例的实施方式。

Claims (10)

1.一种用于抑制肿瘤生长和防治其转移及复发的茯苓多糖组合物，其特征在于含有茯苓属植物中通过分级醇沉方法得到的不同分子量的多糖，总醇沉多糖含量为50-80％；其重均分子量道尔顿范围为0.2-3万。

2.如权利要求1所述的茯苓多糖组合物，其特征在于所述的总醇沉多糖包括：醇沉物1、醇沉物2、醇沉物3和醇沉物4或醇沉物3与醇沉物4的组合。

3.如权利要求1或2所述的茯苓多糖组合物，其中总醇沉多糖含量为60-70％；其分子量范围为0.2-2万。

4.如权利要求2所述的组合物，其中的总醇沉多糖为含量大于60％的3、4醇沉物；其分子量范围为0.2-1.5万。

5.一种制备权利要求1-4任一项所述茯苓多糖组合物的方法，其特征在于，总醇沉多糖以如下的方法制备：

(1)称取茯苓切片后粉碎，加入3-12倍重量份数的水，回流提取2-3次，合并提取液滤过，除去不溶性杂质；

(2)取提取液减压蒸馏浓缩，浓缩液边搅拌边加入乙醇，使含醇量达到80％，静置，过滤，收集沉淀；

(3)加水溶解沉淀并煮沸，趁热过滤除去不溶物，滤液边搅拌边加入乙醇，使含醇量达到80％，放置，析出沉淀后过滤，使沉淀物在40-70℃干燥，得茯苓总多糖粗品；

(4)将茯苓总多糖粗品按1∶4加蒸馏水使其溶解，加入乙醇使含醇量达到20％，静置，过滤得沉淀物1；滤液再加乙醇使含醇量达到40％，静置，过滤得沉淀物2；滤液再加乙醇使含醇量达到60％，静置，过滤得沉淀物3；滤液再加乙醇使含醇量达到80％，静置，过滤得沉淀物4；

(5)采用酚-硫酸紫外分光光度法测定总茯苓多糖的含量为：56.2％；高效液相凝胶(HPGPC)色谱图计算平均相对分子质量的范围为0.2-3万。

6.如权利要求5所述的制备方法，其中醇沉物3、4采用酚-硫酸紫外分光光度法测定多糖含量均大于60％；高效液相凝胶(HPGPC)色谱图计算平均相对分子质量的范围为0.2-1.5万。

7.权利要求1-4任一项所述的茯苓多糖组合物，其中总醇沉多糖与药学上可接受的载体混合制成口服制剂或注射剂。

8.如权利要求7所述的茯苓多糖组合物，其特征在于所述的口服制剂为片剂、颗粒剂、胶囊或口服液；注射剂为静脉注射。

9.权利要求1-4任一项所述的茯苓多糖组合物在制备激活多形核白细胞，提高杀伤肿瘤细胞能力药物方面的应用。

10.权利要求1-4任一项所述的茯苓多糖组合物在制备治疗肺癌、肝癌、结肠癌肿瘤和抑制其转移及术后复发药物方面的应用。