CN105585638A - 茯苓多糖活性组分和成分、其制备方法及用途 - Google Patents

茯苓多糖活性组分和成分、其制备方法及用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及从茯苓中提取的多糖，具体涉及从中提取的多糖组分A和B及多糖成分Ⅰ和Ⅱ及其药用组合物；本发明还涉及多糖组分A和B及多糖成分Ⅰ和Ⅱ的制备方法；以及所述多糖组分或成分作为疫苗佐剂、疫苗辅料或免疫调节剂，或用于制备疫苗制剂、疫苗组合物或抗体的用途。活性实验结果表明茯苓多糖组分A和B、多糖成分Ⅰ和Ⅱ均具有免疫佐剂活性和免疫调节作用，为疫苗佐剂、免疫调节剂或疫苗辅料或制备疫苗制剂、疫苗组合物或抗体提供了新的选择。

Description

茯苓多糖活性组分和成分、其制备方法及用途
技术领域
本发明属于医药技术领域，涉及从茯苓中提取的多糖，具体涉及从中提取的多糖组分A和B及多糖成分Ⅰ和Ⅱ及其药用组合物，本发明还涉及多糖组分A和B及多糖成分Ⅰ和Ⅱ的制备方法，以及所述多糖组分或成分作为疫苗佐剂、疫苗辅料、免疫调节剂或用于制备疫苗制剂、疫苗组合物或抗体的用途。
背景技术
茯苓(Poria)为非褶菌目(Aphyllophorales)、多孔菌科(Polyporaceae)、茯苓属(Poria)、真菌茯苓(Poriacocos(Schw.)Wolf.)的干燥菌核，具有利水渗湿、健脾、宁心之功效(中国药典，2010版，p224)。
近年来与本发明领域相关的研究和报道归纳如下：
余建国等(余建国，等.中国兽医科技，2004，34(11)：70-74)给1日龄的雏鸡腹腔注射马立克氏病病毒(MDV)强毒株(0.2mL/只)，并从当日开始给试验组雏鸡以1、2和3mg/只的剂量连续肌肉注射茯苓多糖1周(未提及茯苓多糖的制备方法和理化性质)。结果表明3个剂量茯苓多糖均可显著提高雏鸡的淋巴细胞转化率、NK细胞活性及MΦ活性。
张志军等(张志军，等.中国免疫学杂志，2013，29：1213-1216)将含60％茯苓多糖混合物(还含有三萜类化合物、乙酰茯苓酸、茯苓酸、胆碱，3β-羟基羊毛甾三烯酸，葡萄糖、腺嘌呤、组氨酸等)按0.4、0.8和1.6mg/鼠的剂量灌胃给予小鼠一周。发现小鼠血清中IgA、IgG和IgM水平高于生理盐水对照组，且存在剂量-效应关系。
谢国秀等(谢国秀，等.生命科学研究，2009，13(3)：246-248)将不同剂量(200μg或1000μg)的茯苓多糖(未提及茯苓多糖的制备方法和理化性质)分别与低剂量(0.015μg)或高剂量(1.5μg)流感病毒(A/PR/8)灭活疫苗共同免疫小鼠。一次免疫后3周收集血清，检测血清中IgG、IgG1和IgG2a的抗体水平，并用致死量(40×LD50)流感病毒(A/PR/8)攻击小鼠。结果表明茯苓多糖能增加血清抗体水平，提高小鼠抗致死量流感病毒攻击的能力，其免疫增强效果与氢氧化铝相当。
王青等(王青，等.中国实验方剂学杂志，2011，17(13)：127-130)观察茯苓多糖(未提及茯苓多糖的制备方法和理化性质)对卵清白蛋白(OVA)诱导的小鼠肠道黏膜免疫应答的影响。茯苓多糖每天按200mg/kg剂量灌胃给药小鼠，1周后1次灌胃抗原OVA5mg，对小鼠进行免疫，分别于免疫后1，2，3周，收集小鼠粪便样本，ELISA检测小鼠粪便OVA特异性分泌型免疫球蛋白A(sIgA)。结果表明茯苓多糖对肠道sIgA分泌具有促进作用，这与其活化淋巴结B淋巴细胞有关。
Lee等(Lee等.和汉医药学杂志，1999，16(526)：175-182)在肺炎球菌gV型多糖类蛋白质结合抗原接种小鼠前，预先注射当归多糖和茯苓多糖混合物0.2-1.0mg。结果表明较未用多糖组gvPSIgG与lgM生成明显增加。中药多糖组小鼠用有毒力的19F型肺炎球菌攻击后，血中的细菌迅速清除。用gV型肺炎球菌多糖类蛋白质结合抗原免疫小鼠的脾细胞与中药多糖共育后，TNF-α的生成较对照组高4.0-5.5倍，IL-2高15-39倍，IL-4高4.6～64倍。茯苓多糖还诱导IFN-γ生成增加。小鼠灌胃给予1、2、4g/L的茯苓多糖(含糖60％混合物)7天，茯苓多糖组小鼠血清IgA、IgG和IgM水平高于生理盐水对照组，IgA、IgG和IgM水平与茯苓多糖剂量呈正相关(张志军，等.中国免疫学杂志，2013，29:1213-1215)。
多糖成分及其它生物活性的文献报道
Lee等(Lee,etal.InternationalImmunopharmacology,2004,4:1029-1038)采用1％碳酸钠提取茯苓，获得水提物。水提物经过乙醇沉淀、DEAE-纤维素和SephadexG-50柱层析，获得一个分子量为8000Da的糖肽(PCSC)，PCSC中糖与肽的百分比为78：22。糖部分含有甘露糖(92％)、半乳糖(6.2％)，阿拉伯糖(1.3％)。肽部分主要含有天冬氨酸、丝氨酸和缬氨酸。PCSC能显著活化RAW264.7巨噬细胞，活化NF-κB/Rel和NO的分泌。Chen等(Chen,etal.FoodandChemicalToxicology,2004,42:759-769)从茯苓中分离得到1个中性多糖组分(PC-PS)，分子量为160,000Da(未提及理化性质)。PC-PS能抑制人白血病U937细胞和HL-60的增殖和分化，能提高TNF-α和IFN-γ的分泌。
黄灿等(中华中医药学刊，2013，31(8)：1687-1689)采用热水煮沸提取茯苓多糖，然后脱蛋白和采用不同浓度乙醇醇沉得到3个不同分子量段的多糖组分(A、B、C)。A组分由岩藻糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖组成，其摩尔比为:1.4∶1.17∶1∶4.21；B组分由岩藻糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖组成，其摩尔比为:1∶2.36∶5.49∶2.34；C组分由岩藻糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖组成，其摩尔比为:6∶81∶25∶1。
Wang等(CarbohydrateResearch,2004,339:327-334)分别采用0.9％NaCl(PCS1)、水煎煮(PCS2)、0.5MNaOH(PCS3-I和PCS3-II)和88％甲酸(PCS4-I和PCS4-II)连续提取，制备了6个多糖成分。其分子量分别为11.6×104(PCS1)、20.8×104(PCS2)、17.1×104(PCS3-I)、9.1×104(PCS3-II)、12.3×104(PCS4-I)和21.1×104(PCS4-II)。单糖组成如表1所示：
表1
-：没有检测到；+：痕量。PCS3-II是线性(1→3)-β-D-葡聚糖，PCS4-I含β-(1→6)支链的(1→3)-β-D-葡聚糖。
Zhang等(ONCOLOGYREPORTS,2006,15:637-643)从茯苓菌丝体中分离得到一个多糖成分(PCM3-II)，是一种(1→3)和(1→4)β-葡聚糖。PCM3-II对肺癌细胞有明显抑制活性。
综合以上文献可以看出：(1)茯苓多糖具有疫苗佐剂作用，但文献均未明确阐明使用的茯苓多糖具体制备方法、理化性质及化学结构特征，而不同制备方法得到的茯苓多糖其理化性质可能差别很大。(2)仅有2篇文献报道了茯苓多糖成分，均为β-葡聚糖，然而其它从茯苓分离得到的杂多糖均无化学结构的研究。
本发明采用不同于现有技术的方法最终从茯苓药材中分离、纯化获得具有免疫佐剂活性的2个多糖组分和2个多糖成分，并对其进行理化性质、化学结构以及疫苗佐剂活性的研究。
发明内容
本发明提供了从中药材茯苓或茯苓菌丝体中分离得到的茯苓多糖组分A和B以及茯苓多糖成分Ⅰ和Ⅱ及其药用组合物、其制备方法；以及所述茯苓多糖组分或成分作为疫苗佐剂、疫苗辅料或免疫调节剂，或用于制备疫苗制剂、疫苗组合物或抗体中的用途。具体地，
本发明第一方面涉及茯苓多糖组分，其选自以下多糖组分中的一种或两种：
1)多糖组分A，其含糖的重量百分比为50-80％，例如为50-70％，例如为50-60％，例如为55-60％，其含有岩藻糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖，其中岩藻糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖的相对摩尔比为1.0：(1.0～3.0)：(0.1～1.5)：(3.0～9.0)；
2)多糖组分B，其含糖的重量百分比为50-80％，例如为50-70％，例如为55-65％，例如为57-62％，其含有岩藻糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖，其中岩藻糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖的相对摩尔比为1.0：(1.0～3.0)：(0.1～5.5)：(3.0～10.0)。
根据本发明第一方面任一项的茯苓多糖组分，其中多糖组分A含糖的重量百分比为56-59％。
根据本发明第一方面任一项的茯苓多糖组分，其中多糖组分B含糖的重量百分比为59-61％。
根据本发明第一方面任一项的茯苓多糖组分，其中多糖组分A中岩藻糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖的相对摩尔比为1.0：(1.5～2.5)：(0.2～0.8)：(4.0～8.0)，例如为1.0：(1.6～1.8)：(0.4～0.6)：(4.5～6.5)。
在本发明的实施方案中，所述多糖组分A中岩藻糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖的相对摩尔比为1.0：1.68:0.50:5.22。
根据本发明第一方面任一项的茯苓多糖组分，其中多糖组分B中岩藻糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖的相对摩尔比为1.0：(1.3～2.5)：(3.5～5.0)：(4.0～9.0)，例如为1.0：(2.1～2.3)：(4.3～4.7)：(7.0～7.5)。
在本发明的实施方案中，所述多糖组分B中岩藻糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖的相对摩尔比为1.0：2.20:4.48:7.20。
根据本发明第一方面任一项的茯苓多糖组分，其中多糖组分A的峰高分子量约为28210Da，其分子量范围为1.0×104～6.0×104Da，例如1.0×104～5.0×104Da，再例如2.0×104～4.5×104Da。多糖组分B的峰1的峰高分子量约为28582Da，其分子量范围为1.0×104～6.0×104Da，例如1.0×104～5.0×104Da，再例如2.0×104～5.0×104Da；峰2的峰高分子量644500Da，其分子量范围为2.0×105～10.0×105Da，例如4.0×105～8.0×105Da。
在本发明的一个具体实施方案中，所述多糖组分A为PCP-A。
在本发明的一个具体实施方案中，所述多糖组分B为PCP-B。
本发明第二方面涉及茯苓多糖成分，其选自以下多糖成分中的一种或两种：
(1)多糖成分Ⅰ，其含有岩藻糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖，其中岩藻糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖的相对摩尔比为1.0：(1.0～2.5)：(0.1～1.0)：(3.0～9.0)；
(2)多糖成分Ⅱ，其含有岩藻糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖，其中岩藻糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖的相对摩尔比为1.0：(0.5～3.0)：(0.05～1.0)：(3.0～10.0)。
根据本发明第二方面任一项的茯苓多糖成分，其中多糖成分Ⅰ中岩藻糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖的摩尔比为1.0：(1.0～2.5)：(0.1～1.0)：(3.0～9.0)，例如为1.0：(1.2～2.0)：(0.1～0.5)：(5.0～8.0)，例如为1.0：(1.7～1.9)：(0.2～0.3)：(7.0～7.5)。
在本发明的实施方案中，所述多糖成分Ⅰ中岩藻糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖的摩尔比为1.0：1.81：0.27：7.27。
根据本发明第二方面任一项的茯苓多糖成分，其中多糖成分Ⅱ中岩藻糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖的摩尔比为1.0：(1.0～3.0)：(0.05～0.8)：(3.0～9.0)，例如为1.0：(1.3～1.9)：(0.1～0.4)：(4.0～7.0)，例如为1.0：(1.5～1.7)：(0.1～0.2)：(5.5～6.5)。
在本发明的实施方案中，所述多糖成分Ⅱ中岩藻糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖的摩尔比为1.0：1.63：0.16：6.29。
根据本发明第二方面任一项的茯苓多糖成分，所述多糖成分Ⅰ和/或多糖成分Ⅱ中含糖量为90％以上，例如为95％以上，例如为98％，例如为99％，例如为100％。
在本发明的实施方案中，所述多糖成分Ⅰ和/或多糖成分Ⅱ为分子量均一的杂多糖，分子量成正态分布。
根据本发明第二方面任一项的茯苓多糖成分，其中多糖成分Ⅰ的峰高分子量约为27900Da，分子量范围为1.0×104～5.5×104Da，例如1.0×104～5.0×104Da，再例如2.0×104～4.0×104Da和/或多糖成分Ⅱ的峰高分子量约为29000Da，分子量范围为1.0×104～6.0×104Da，例如1.0×104～5.0×104Da，再例如2.0×104～4.5×104Da。
在本发明的一个具体实施方案中，所述多糖成分Ⅰ为PCP-Ⅰ。
在本发明的一个具体实施方案中，所述多糖成分Ⅱ为PCP-Ⅱ。
本发明第三方面涉及茯苓总多糖，其是通过如下方法获得的：
(1)取中药材茯苓，加入水浸泡，得到水提液；
(2)将步骤(1)得到的水提液减压浓缩，浓缩液进行乙醇沉淀，沉淀部分加入水溶解，取上清液进行水透析或膜过滤；
(3)取透析液或滤液进行浓缩和冷冻干燥得到茯苓总多糖。
根据本发明第三方面任一项所述的茯苓总多糖，其特征在于如下的(1)-(11)项中的任意一项或多项：
(1)步骤(1)中所述中药材茯苓为茯苓片、茯苓块或茯苓菌丝体粉末；
(2)步骤(1)中所用水为蒸馏水或去离子水；
(3)步骤(1)中，加入水浸提的温度为4～100℃，优选为20～60℃；
(4)步骤(1)中，将水提后得到的茯苓残渣按照相同条件进行一次或多次水提，合并水提液，例如进行两次浸提；
(5)步骤(1)中水的用量为茯苓药材的5-30倍量(L/Kg)，例如为10-20倍量(L/Kg)；
(6)步骤(2)中，将得到的水提液在50-55℃下进行减压浓缩，得到浓缩的水提液；
(7)步骤(2)中，乙醇沉淀的条件是：醇沉后乙醇的终浓度为60-80％，例如70-75％；醇沉的时间大于12小时，例如为48-72小时；
(8)步骤(2)中，乙醇沉淀后离心，得到的沉淀用水进行一次或多次溶解，离心，合并上清液；
(9)步骤(2)中，透析所用透析袋的截留分子量大于1000；或超滤去除分子量小于1000的小分子成分；
(10)步骤(2)中，用自来水和/或蒸馏水进行透析；
(11)步骤(3)中所述浓缩为在50-55℃下进行减压浓缩。
本发明第四方面涉及本发明第一方面任一项所述的茯苓多糖组分的制备方法，其包括如下步骤：
取本发明第三方面任一项所述的茯苓总多糖，溶解后进行DEAE-纤维素柱层析，依次用H2O和0.15-0.3mol/LNaHCO3(例如0.25mol/LNaHCO3)洗脱，检测糖峰(例如苯酚-硫酸法)，分别得到多糖组分A和多糖组分B。
在本发明的一个实施方案中，利用DEAE-纤维素柱分离所述茯苓总多糖中的中性多糖组分。
在本发明的一个实施方案中，所述DEAE-纤维素柱为DEAE-纤维素(HCO3-)柱。
在本发明的一个实施方案中，层析分离时洗脱液的流速为，流速为1ml/min,每管收集10ml。
本发明第五方面涉及本发明第二方面任一项的茯苓多糖成分的制备方法，其包括如下步骤：
取本发明第一方面任一项所述的茯苓多糖组分A，经凝胶柱层析，用水或0.05～0.2mol/LNaCl(例如0.1mol/LNaCl)洗脱，苯酚-硫酸法检测糖峰，分离纯化，则获得多糖成分Ⅰ。茯苓多糖组分B，经凝胶柱层析，用水或0.05～0.2mol/LNaCl(例如0.1mol/LNaCl)洗脱，检测糖峰(例如苯酚-硫酸法)，分离纯化，则获得多糖成分Ⅱ。
在本发明的实施方案中，其中所述凝胶柱包括葡聚糖凝胶柱(例如Sephadex柱)、聚丙烯酰胺凝胶柱(例如Bio-GelP柱)或琼脂糖凝胶柱(例如Sepharose柱和Bio-gelA柱)或丙烯葡聚糖凝胶(例如SephacrylS柱)。
在本发明的实施方案中，所述葡聚糖凝胶的得水值为5-20(例如为10)。
在本发明的实施方案中，其中所述葡聚糖凝胶柱包括SephadexG-100或SephadexG-75。
在本发明的实施方案中，层析分离时洗脱液的流速为0.2-0.4ml/min，例如为0.3ml/min，每管收集3ml。
本发明第六方面涉及茯苓多糖组分，其选自多糖组分A和多糖组分B中的一种或两种，其中，所述多糖组分A和多糖组分B是通过如下方法获得的：
取本发明第三方面任一项所述的茯苓总多糖，溶解后进行DEAE-纤维素柱层析，依次用H2O和0.15-0.3mol/LNaHCO3(例如0.25mol/LNaHCO3)洗脱，检测糖峰，分别得到多糖组分A和多糖组分B。
在本发明的实施方案中，利用DEAE-纤维素柱分离所述茯苓总多糖中的中性多糖组分。
在本发明的实施方案中，所述DEAE-纤维素柱为DEAE-纤维素(HCO3-)柱。
在本发明的实施方案中，层析分离时洗脱液的流速为1.0ml/min，每管收集10ml。
根据本发明第六方面任一项的茯苓多糖组分，其中，
所述多糖组分A含糖的重量百分比为50-80％，例如为50-70％，例如为50-60％，例如为55-60％，其含有岩藻糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖，其中岩藻糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖的相对摩尔比为1.0：(1.0～3.0)：(0.1～1.5)：(3.0～9.0)；
所述多糖组分B含糖的重量百分比为50-80％，例如为例如为55-70％，55-65％，例如为57-62％，其含有岩藻糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖，其中岩藻糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖的相对摩尔比为1.0：(1.0～3.0)：(0.1～5.5)：(3.0～10.0)。
根据本发明第六方面任一项的茯苓多糖组分，其中多糖组分A含糖的重量百分比为56-59％。
根据本发明第六方面任一项的茯苓多糖组分，其中多糖组分B含糖的重量百分比为59-61％。
根据本发明第六方面任一项的茯苓多糖组分，其中多糖组分A中岩藻糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖的相对摩尔比为1.0：(1.5～2.5)：(0.2～0.8)：(4.0～8.0)，例如为1.0：(1.6～1.8)：(0.4～0.6)：(4.5～6.5)。
在本发明的实施方案中，所述多糖组分A中岩藻糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖的相对摩尔比为1.0：1.68:0.50:5.22。
根据本发明第六方面任一项的茯苓多糖组分，其中多糖组分B中岩藻糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖的相对摩尔比为1.0：(1.3～2.5)：(3.5～5.0)：(4.0～9.0)，例如为1.0：(2.1～2.3)：(4.3～4.7)：(7.0～7.5)。
在本发明的实施方案中，所述多糖组分B中岩藻糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖的摩尔比为1.0：2.20:4.48:7.20。
根据本发明第六方面任一项的茯苓多糖组分，其中多糖组分A的峰高分子量约为28210Da，其分子量范围为1.0×104～6.0×104Da，例如1.0×104～5.0×104Da，再例如2.0×104～4.5×104Da，和/或多糖组分B的峰1的峰高分子量约为28582Da，其分子量范围为1.0×104～6.0×104Da，例如1.0×104～5.0×104Da，再例如2.0×104～5.0×104Da，峰2的峰高分子量644500Da，其分子量范围为2.0×105～10.0×105Da，例如4.0×105～8.0×105Da。
在本发明的一个具体实施方案中，所述多糖组分A为PCP-A。
在本发明的一个具体实施方案中，所述多糖组分B为PCP-B。
本发明第七方面涉及茯苓多糖成分，其选自多糖成分Ⅰ和多糖成分Ⅱ中的一种或两种，其中，所述多糖成分Ⅰ和多糖成分Ⅱ是通过如下方法获得的：
取本发明第一方面或第六方面任一项所述的茯苓多糖组分中的多糖组分A或B，分别经凝胶柱层析，用水或0.05～0.2mol/LNaCl(例如0.1mol/LNaCl)洗脱，检测糖峰(例如苯酚-硫酸法)，分离纯化，则分别获得多糖成分Ⅰ或多糖成分Ⅱ。
在本发明第七方面任一项的茯苓多糖成分，其中所述凝胶柱包括葡聚糖凝胶柱(例如Sephadex柱)、聚丙烯酰胺凝胶柱(例如Bio-GelP柱)、琼脂糖凝胶柱(例如Sepharose柱和Bio-gelA柱)或丙烯葡聚糖凝胶柱(例如SephacrylS柱)。
在本发明的实施方案中，所述葡聚糖凝胶的得水值为5-20(例如为10)。
在本发明的实施方案中，其中所述葡聚糖凝胶柱包括SephadexG-100、SephadexG-75。
在本发明的实施方案中，层析分离时洗脱液的流速为0.2-0.4ml/min，例如为0.3ml/min，每管收集3ml。
根据本发明第七方面任一项的茯苓多糖成分，其中，
所述多糖成分Ⅰ含有岩藻糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖，其中岩藻糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖的摩尔比为1.0：(1.0～2.5)：(0.1～1.0)：(3.0～9.0)；
所述多糖成分Ⅱ含有岩藻糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖，其中岩藻糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖的相对摩尔比为1.0：(0.5～3.0)：(0.05～1.0)：(3.0～10.0)。
根据本发明第七方面任一项的茯苓多糖成分，其中多糖成分Ⅰ中岩藻糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖的相对摩尔比为1.0：(1.0～2.5)：(0.1～1.0)：(3.0～9.0)，例如为1.0：(1.2～2.0)：(0.1～0.5)：(5.0～8.0)，例如为1.0：(1.7～1.9)：(0.2～0.3)：(7.0～7.5)。
在本发明的实施方案中，所述多糖成分Ⅰ中岩藻糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖的相对摩尔比为1.0：1.81：0.27：7.27。
根据本发明第七方面任一项的茯苓多糖成分，其中多糖成分Ⅱ中岩藻糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖的摩尔比为1.0：(1.0～3.0)：(0.05～0.8)：(3.0～9.0)，例如为1.0：(1.3～1.9)：(0.1～0.4)：(4.0～7.0)，例如为1.0：(1.5～1.7)：(0.1～0.2)：(5.5～6.5)。
在本发明的实施方案中，所述多糖成分Ⅱ中岩藻糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖的相对摩尔比为1.0：1.63：0.16：6.29。
根据本发明第七方面任一项的茯苓多糖成分，其中多糖成分Ⅰ的峰高分子量约为27900Da，分子量范围为1.0×104～5.0×104Da，例如1.0×104～5.0×104Da，再例如2.0×104～4.0×104Da，和/或多糖成分Ⅱ的峰高分子量约为29000Da，分子量范围为1.0×104～6.0×104Da，例如1.0×104～5.0×104Da，再例如2.0×104～4.5×104Da。
根据本发明第七方面任一项的茯苓多糖成分，所述多糖成分Ⅰ和/或多糖成分Ⅱ中含糖量为90％以上，例如为95％以上，例如为98％，例如为99％，例如为100％。
在本发明的实施方案中，所述多糖成分Ⅰ和/或多糖成分Ⅱ为分子量均一的杂多糖，分子量成正态分布。
在本发明的一个具体实施方案中，所述多糖成分Ⅰ为PCP-Ⅰ。
在本发明的一个具体实施方案中，所述多糖成分Ⅱ为PCP-Ⅱ。
本发明第八方面涉及药用组合物，其包含本发明任一项所述的茯苓多糖组分或者本发明任一项所述的茯苓多糖成分，任选的，还包含药用辅料和/或其它疫苗辅料。
本发明第九方面涉及疫苗制剂或疫苗组合物，其包含本发明任一项所述的茯苓多糖组分、本发明任一项所述的茯苓多糖成分或本发明任一项所述的组合物。
本发明第十方面涉及疫苗佐剂，其包含本发明任一项所述的茯苓多糖组分或者本发明任一项所述的茯苓多糖成分。
本发明第十一方面涉及疫苗辅料，其包含本发明任一项所述的茯苓多糖组分或者本发明任一项所述的茯苓多糖成分。
本发明第十二方面涉及本发明任一项所述的茯苓多糖组分或者本发明任一项所述的茯苓多糖成分用于制备抗体(例如哺乳动物用抗体)、疫苗制剂或疫苗组合物的用途，或者作为疫苗辅料或疫苗佐剂的用途。
本发明第十三方面涉及本发明任一项所述的茯苓多糖组分或者本发明任一项所述的茯苓多糖成分作为免疫调节剂的用途。
本发明第十四方面涉及一种制备抗体的方法，其包括使用有效量的本发明任一项所述的茯苓多糖组分或者本发明任一项所述的茯苓多糖成分的步骤。
根据本发明任一项所述的方法或用途，其中，所述抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。
本发明还涉及一种免疫方法，其包括给有需要的受试者施用本发明任一项所述的茯苓多糖成分或者本发明任一项所述的茯苓多糖组分的步骤。
发明的有益效果
本发明从茯苓中分离得到了茯苓总多糖(Poriacocospolysaccharides)，并进一步从总多糖得到两种多糖组分A和B，以及从多糖组分A中得到多糖成分I，从多糖组分B中得到多糖成分II。对这几种多糖组分或多糖成分的理化性质和化学结构进行分析，并评价其疫苗佐剂和免疫调节活性。活性实验结果表明，茯苓多糖组分A和B、多糖成分I和II均具有良好的免疫佐剂活性和免疫调节作用，为疫苗佐剂、疫苗辅料和免疫调节剂以及疫苗组合物、疫苗制剂和抗体的制备等提供了新的选择。
本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义，提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。
在本发明中，所述茯苓多糖组分是指在本发明所得茯苓总多糖的基础上进一步提取得到的含糖量为50％以上(例如50－80％)的茯苓提取物，其还可能含有洗脱和透析后残留的盐、残留的小分子以及蛋白、鞣质等成分。
在本发明中，所述茯苓多糖成分是指在本发明所得茯苓多糖组分的基础上进一步提取得到的分子量均一的茯苓多糖，其中含糖量为90％以上，例如为95％以上，例如为98％，例如为99％，例如为100％。。
在本发明中，所述疫苗为减毒疫苗、灭活疫苗、蛋白质亚单位疫苗、嵌合载体疫苗、DNA疫苗、RNA疫苗、多肽疫苗或小分子-蛋白偶合物疫苗。在本发明的一个实施方案中，所述疫苗为H1N1流感病毒灭活疫苗；在本发明的第二个实施方案中，所述疫苗为乙肝病毒蛋白亚单位疫苗。在本发明的第三个实施方案中，所述疫苗为小分子-蛋白偶合物疫苗。
在本发明中，免疫佐剂也称为佐剂，是指能非特异性地增强对抗原免疫应答的物质，其先于抗原或与抗原一起注入机体，可增强机体对抗原的免疫应答或改变免疫应答类型。
在本发明中，疫苗佐剂是指能够用于疫苗的佐剂，其它疫苗佐剂例如氢氧化铝或磷酸铝或白油等佐剂。
在本发明中，疫苗与疫苗制剂含义相同，是指所有用减毒或杀死的病原生物(细菌、病毒、立克次体等)或其它抗原性物质所制成，可使机体产生特异性免疫，用于预防接种或治疗的生物制剂。
在本发明中，疫苗辅料是指所有能提高疫苗制剂稳定性、溶解性及增强免疫效果等多功效的物质。
在本发明中，免疫调节剂是指能调节、增强并恢复机体免疫功能的一类制剂，常用的免疫调节剂有免疫促进剂、免疫抑制剂和免疫双向调节剂三大类。
附图说明
图1为茯苓总多糖(PCP)在DEAE-纤维素柱层析的流出图；
图2为PCP-A在SephadexG-100柱层析的流出图；
图3为PCP-B在SephadexG-100柱层析的流出图；
图4为茯苓多糖组分PCP-A的HPGPC图谱；
图5为茯苓多糖组分PCP-B的HPGPC图谱；
图6为茯苓多糖组分PCP-A和PCP-B的单糖CE图谱
图7为茯苓多糖成分PCP-I的HPGPC图谱；
图8为茯苓多糖成分PCP-Ⅱ的HPGPC谱图；
图9为茯苓多糖成分PCP-I的单糖CE图谱
图10为茯苓多糖成分PCP-II的单糖CE图谱
图11为PCP-I的IR图谱；
图12为PCP-I的1H-NMR图谱；
图13为PCP-I的13C-NMR图谱；
图14为PCP-I甲基化产物的GC图谱；
图15-1～15-18为PCP-I甲基化产物主要的离子碎片图谱
图16为PCP-II的IR图谱；
图17为PCP-II的1H-NMR图谱；
图18为PCP-II的13C-NMR图谱；
图19为PCP-II甲基化产物的GC图谱；
图20-1～20-11为PCP-II甲基化产物主要的离子碎片图谱
图21为PCP-A和PCP-B对乙肝抗原初次免疫小鼠抗体滴度的影响：与生理盐水组(control)相比，*P<0.05，**P<0.01；与单独乙肝抗原组(HBsAg)相比，#P<0.05，##P<0.01；与铝佐剂组(Al(OH)3)相比，$P<0.05，$$P<0.01；
图22为PCP-A和PCP-B对乙肝抗原二次免疫小鼠抗体滴度的影响：与生理盐水组(control)相比，*P<0.05，**P<0.01；与单独乙肝抗原组(HBsAg)相比，#P<0.05，##P<0.01；与铝佐剂组(Al(OH)3)相比，$P<0.05，$$P<0.01；
图23为多糖成分PCP-I对乙肝抗原初次免疫小鼠抗体滴度影响：与生理盐水组(control)相比，*P<0.05，**P<0.01；与单独乙肝抗原组(HBsAg)相比，#P<0.05，##P<0.01；与铝佐剂组(Al(OH)3)相比，$P<0.05，$$P<0.01。
图24为多糖成分PCP-I对乙肝抗原初次免疫小鼠亚类抗体滴度影响：与生理盐水组(control)相比，*P<0.05，**P<0.01；与单独乙肝抗原组(HBsAg)相比，#P<0.05，##P<0.01；与铝佐剂组(Al(OH)3)相比，$P<0.05，$$P<0.01；
图25为多糖成分PCP-II对乙肝抗原初次免疫小鼠抗体滴度影响：与生理盐水组(control)相比，*P<0.05，**P<0.01；与单独乙肝抗原组(HBsAg)相比，#P<0.05，##P<0.01；与铝佐剂组(Al(OH)3)相比，$P<0.05，$$P<0.01。
图26为多糖成分PCP-II对乙肝抗原初次免疫小鼠亚类抗体滴度影响：与生理盐水组(control)相比，*P<0.05，**P<0.01；与单独乙肝抗原组(HBsAg)相比，#P<0.05，##P<0.01；与铝佐剂组(Al(OH)3)相比，$P<0.05，$$P<0.01；
图27为多糖成分PCP-I对乙肝抗原二次免疫小鼠抗体滴度影响：与生理盐水组(control)相比，*P<0.05，**P<0.01；与单独乙肝抗原组(HBsAg)相比，#P<0.05，##P<0.01；与铝佐剂组(Al(OH)3)相比，$P<0.05，$$P<0.01；
图28为多糖成分PCP-I对乙肝抗原二次免疫小鼠亚类抗体滴度影响：与生理盐水组(control)相比，*P<0.05，**P<0.01；与单独乙肝抗原组(HBsAg)相比，#P<0.05，##P<0.01；与铝佐剂组(Al(OH)3)相比，$P<0.05，$$P<0.01；
图29为多糖成分PCP-II对乙肝抗原二次免疫小鼠抗体滴度影响：与生理盐水组(control)相比，*P<0.05，**P<0.01；与单独乙肝抗原组(HBsAg)相比，#P<0.05，##P<0.01；与铝佐剂组(Al(OH)3)相比，$P<0.05，$$P<0.01；
图30为多糖成分PCP-II对乙肝抗原二次免疫小鼠亚类抗体滴度影响：与生理盐水组(control)相比，*P<0.05，**P<0.01；与单独乙肝抗原组(HBsAg)相比，#P<0.05，##P<0.01；与铝佐剂组(Al(OH)3)相比，$P<0.05，$$P<0.01。
图31为多糖成分PCP-I和PCP-II对H1N1流感抗原初次免疫小鼠抗体滴度影响：与生理盐水组(control)相比，*P<0.05，**P<0.01，与单独H1N1流感抗原组(H1N1)相比，#P<0.05，##P<0.01；与铝佐剂组(Alum)相比，$P<0.05，$$P<0.01。
图32为多糖成分PCP-I和PCP-II对H1N1流感抗原二次免疫小鼠抗体滴度影响：与生理盐水组(control)相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.01；与单独H1N1抗原组(H1N1)相比，#P<0.05，##P<0.01；与铝佐剂组(Alum)相比，$P<0.05，$$P<0.01。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
茯苓药材(块)：安徽产，购于北京同仁堂药店
雌性Balb/c小鼠：军事医学科学院实验动物中心提供
实施例1茯苓总多糖的制备
取中药材茯苓块1kg，粉碎，向其中加入蒸馏水15L，50℃条件下浸泡5小时，期间不时搅拌；然后二层纱布过滤，滤液离心(3000r/min×20min)，浸提后的茯苓残渣在同样条件下进行第二次提取。合并两次提取的水提液，减压浓缩获得水提浓缩液。然后加入浓缩液的3倍体积95％乙醇进行醇沉48小时(上清液乙醇浓度70％)。离心分离醇沉部分，向沉淀部分中加入水搅拌溶解，离心，再将沉淀同样操作三次；合并溶解的上清液，装入透析袋，截留分子量>1000，用水透析；将得到的袋内透析液减压浓缩后，进行冷冻干燥，获得所述茯苓总多糖PCP。
实施例2茯苓多糖组分PCP-A和PCP-B的制备
称取实施例1得到的茯苓总多糖PCP1g，加入20mL水溶解后上样于DEAE-纤维素层析柱(Φ7.0cm×50cm)(DEAE-纤维素,上海试剂二厂)，依次用H2O和0.25mol/LNaHCO3洗脱，洗脱速度1mL/min，每只试管收集10mL，硫酸-苯酚法检测流出的糖吸收峰(OD490nm)，OD280nm检测非糖成分。分别获得PCP-A(H2O洗脱)和PCP-B(0.25mol/LNaHCO3洗脱)二个多糖组分，洗脱曲线见图1。PCP-A和PCP-B两个流分分别用水透析除盐，再冷冻干燥制得。
实施例3茯苓多糖成分PCP-I和PCP-II的制备
称取实施例2得到的茯苓多糖组分PCP-A200mg，加入5mL水溶解，然后上样于SephadexG-100层析柱(Φ2.0cm×120cm)(SephadexG-100，法玛西亚公司生产)，用0.1mol/LNaCl洗脱，流速0.3ml/min，每管收集3mL，硫酸-苯酚法检测流出的糖吸收峰(OD490nm)，收集，用水透析除盐，再冷冻干燥获得分子量均一多糖PCP-I。PCP-A的洗脱曲线见图2。
称取实施例2得到的茯苓多糖组分PCP-B200mg，加入5mL水溶解，然后上样于SephadexG-100层析柱(Φ2.0cm×120cm)，用0.1mol/LNaCl洗脱，流速0.3ml/min，每管收集3mL，硫酸-苯酚法检测流出的糖吸收峰(OD490nm)，收集，用水透析除盐，再冷冻干燥获得分子量均一多糖PCP-II。PCP-B的洗脱曲线见图3。
实施例4茯苓多糖组分PCP-A和PCP-B的的理化性质
1.供试品：
实施例2方法制备得到的茯苓多糖组分PCP-A和PCP-B。
2.茯苓多糖PCP-A和PCP-B的含糖量测定(硫酸-苯酚法)
采用硫酸－苯酚法测定糖含量(以葡萄糖计算)，结果表明PCP-A含糖量为57.6％，PCP-B的含糖量为60.1％。
3.茯苓多糖PCP-A和PCP-B分子量分布测定(HPGPC法)
仪器：HPLC，Waters公司
色谱柱：TSKsw3000
流动相：0.1MNa2SO4
流速：0.6mL/min
检测器：示差
PCP-A和PCP-B的HPGPC的图谱见图4和图5，分子量测定结果表明PCP-A的峰高分子量约为28210Da，其分子量范围为1.0×104～5.0×104Da；多糖组分PCP-B的峰1的峰高分子量约为28582Da，其分子量范围为1.0×104～5.0×104Da，峰2的峰高分子量644500Da，其分子量范围为2.0×105～10.0×105Da。
4.茯苓多糖PCP-A和PCP-B中单糖相对摩尔比测定(毛细管电泳法)
采用PMP衍生化，测定单糖的相对摩尔比。
4.1标准单糖的衍生化反应
称取氨基葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、葡萄糖、鼠李糖、岩藻糖、半乳糖、甘露糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸各10mg，加入5ml超纯水溶解，混合。移取40μl标准单糖混合溶液于试管中，然后加入600μl0.3mol/LNaOH溶液和600μl0.5mol/LPMP溶液(甲醇配制)，充分混合，置于70℃水浴中反应30min。取出自然冷却至室温，慢慢加入600μl0.3mol/L盐酸溶液至中性。加入1ml氯仿进行萃取，水层再加入氯仿重复萃取2次。水层溶液经0.22μm过滤，待进样。
4.2待测样品的衍生化反应
称取5mg待测样品置于水解管中，加入3ml2mol/L三氟乙酸溶解，密封，置于120℃烘箱中加热水解2h。取出放置冷至室温后，转移至25ml圆底烧瓶中。45℃减压条件下反复加入少量甲醇，去除残余的三氟乙酸。然后加入600μl0.3mol/LNaOH溶液和600μl0.5mol/LPMP溶液(甲醇配制)，充分混合，置于70℃水浴中反应30min。取出自然冷却至室温，慢慢加入600μl0.3mol/L盐酸溶液至中性。加入1ml氯仿进行萃取，水层再加入氯仿重复萃取2次。水层溶液经0.22μm过滤，待进样。
4.3毛细管电泳条件
缓冲盐溶液：50mmol/L硼砂溶液(pH＝10.57)；毛细管柱：Φ50μm×60cm；分离电压：15kV；检测波长：245nm；进样压力：0.5psi；进样时间：10s；柱温：25℃。依据每种单糖质量和相应峰面积，计算每种单糖校正因子fi，再与待测样品所含单糖的峰面积相乘，然后计算不同单糖之间的相对摩尔比。
4.4实验结果
PCP-A和PCP-B均由岩藻糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖组成，单糖相对摩尔比分别为：
PCP-A：岩藻糖：甘露糖：葡萄糖：半乳糖＝1:1.68:0.50:5.22；
PCP-B：岩藻糖：甘露糖：葡萄糖：半乳糖＝1:2.20:4.48:7.20(图6)。
实施例5茯苓多糖成分PCP-I和PCP-II的的理化性质
1.供试品：
实施例3方法制备得到的茯苓均一多糖成分PCP-I和PCP-II。
2.茯苓多糖PCP-I和PCP-II分子量分布测定(HPGPC法)
仪器：HPLC，Waters公司色谱柱：TSKsw3000
流动相：0.1MNa2SO4
流速：0.6mL/min
检测器：示差
实验结果如图7和图8所示：PCP-I和PCP-II均为分子量均一的杂多糖，呈正态分布。PCP-I的峰高分子量约为27912Da，分子量范围为1.0×104～5.0×104Da；PCP-Ⅱ的峰高分子量约为29000Da，分子量范围为1.0×104～5.0×104Da。
3.茯苓多糖PCP-I和PCP-II中单糖摩尔比的测定(毛细管电泳法)
实验方法同实施例4，采用PMP衍生化、毛细管电泳方法测定单糖的相对摩尔比，实验结果表明见图9和图10。
(1)PCP-I和PCP-II均由岩藻糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖组成，单糖摩尔比分别为：
PCP-I：岩藻糖：甘露糖：葡萄糖：半乳糖＝1.00：1.81：0.27：7.27；
PCP-II：岩藻糖：甘露糖：葡萄糖：半乳糖＝1.00:1.63:0.16:6.29。
实施例6茯苓多糖组分PCP-I和PCP-II的结构分析
1.PCP-I的结构特点
由实施例5可知PCP-I为分子量均一的杂多糖，由岩藻糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖组成，单糖摩尔比为：岩藻糖：甘露糖：葡萄糖：半乳糖＝1.00：1.81：0.27：7.27。
PCP-I的红外图谱(IR)如图11所示。
PCP-I的1H-NMR图谱如图12所示。
PCP-I的13C-NMR图谱如图13所示。
PCP-I甲基化产物的GC-MS分析：
PCP-I经过完全甲基化、酸水解、乙酰化反应后，生成部分甲基化和乙酰化单糖，然后进行气相色谱-质谱(GC-MS)分析，GC图谱见图14，甲基化单糖碎片见图15-1～18，分析结果见表2。
表2PCP-I甲基化产物GC-MS分析结果
甲基化糖基 质谱碎片(m/z) 连接方式
2,3,4-Me3-Fuc 43,45,71,87,99,101,117,142,153 Fuc-(1→
2.4-Me2-Fuc 43,58,85,89,101,117,141,159,173,201,233 →3)Fuc(1→
2,3,4,6-Me3-Glc 43,45,71,87,101,117,129,145,161,205 Glc(1→
2,3,4,6-Me4-Gal 43,45,71,87,99,101,117,129,145,161,205 Gal(1→
3,4,6-Me3-Man 43,45,71,87,99,101,117,129,161,189,233 →2)Man(1→
2,3,6-Me3-Gal 43,45,87,99,101,117,129,149,161,233 →4)Gal(1→
3,4,6-Me3-Man 43,45,87,99,101,129,145,161,189,233 →2)Man(1→
2,3,4-Me3-Glc 43,71,87,99,101,117,129,161,189,233 →6)Glc(1→
2,3,6-Me3-Gal 43,71,87,99,101,117,129,161,189,233 →4)Gal(1→
2,4-Me2-Man 43,87,101,117,129,159,189,233 →3,6)Man(1→
3,6-Me2-Gal 43,87,99,117,129,189,233 →2,4)Gal(1→
2.PCP-II的结构特点
PCP-II为分子量均一的杂多糖，由岩藻糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖组成，单糖摩尔比为：岩藻糖：甘露糖：葡萄糖：半乳糖＝1.00:1.63:0.16:6.29。
PCP-II的红外光谱(IR)如图16所示。
PCP-II的1H-NMR图谱如图17所示。
PCP-II的13C-NMR图谱如图18所示。
PCP-II甲基化产物的GC-MS分析：
PCP-II经过完全甲基化、酸水解、乙酰化反应后，生成部分甲基化和乙酰化单糖，然后进行气相色谱-质谱(GC-MS)分析，GC图谱见图19，甲基化单糖碎片见图20-1～11，分析结果见表3。
表3PCP-II甲基化产物GC-MS分析结果
甲基化糖基 质谱碎片(m/z) 连接方式
2,3,4-Me2-Fuc 43,45,74,88,116,129,157 Fuc(1→
2,4-Me2-Fuc 43,75,87,101,117,127,159,173,233 →3)Fuc(1→
2,3,4,6-Me4-Gal 43,45,71,87,101,117,129,145,161,205 Gal(1→
2,3,4,6-Me4-Glc 43,45,71,87,101,117,129,145,161,205 Glc(→
3,4,6-Me3-Man 45,87,101,129,161,189,205,253 →2)Man(1→
2,3,4,-Me3-Man 43,45,87,99,101,129,145,161,189,205,233 →6)Man(1→
2,3,4-Me3-Glc 43,87,99,101,117,129,161,189,233 →6)Glc(1→
2,3,4-Me3-Gal 43,87,99,101,117,129,161,189,233 →6)Gal(1→
2,4-Me2-Man 43,87,117,129,159,189,233 →3,6)Man(1→
3,6-Me2-Gal 43,71,87,99,129,159,173,189,233 →2,4)Gal(1→
3-Me-Glc 43,87,99,129,189,201,233 →2,4,6)Glc(1→
实施例7多糖组分PCP-A和PCP-B对乙肝疫苗的佐剂活性
1.供试品
茯苓多糖组分PCP-A和PCP-B依据实施例2方法制备。
2.试剂
乙肝抗原：重组乙型蛋白亚单位，大连汉信生物医药有限公司生产(汉逊酵母表达HBsAg,不含铝佐剂，蛋白浓度0.221mg/ml)
铝佐剂：氢氧化铝，Thermofisher(赛默飞)公司生产。
3.动物
雌性Balb/c小鼠，6-8周龄；
4.实验分组
实验分为7组(每组6只小鼠)：生理盐水组(control)、乙肝抗原组(HBsAg)、HBsAg+PCP-A低剂量组、HBsAg+PCP-A高剂量组、HBsAg+PCP-B低剂量组、HBsAg+PCP-B高剂量组和HBsAg+铝佐剂组。
5.给药剂量和途径
乙肝抗原：2μg/鼠；PCP-A和PCP-B各按0.2mg/鼠和1.0mg/鼠低、高剂量给药；铝佐剂0.1mg/鼠。肌肉注射进行免疫。
6.免疫方案
小鼠初次免疫2周后ELISA方法测定小鼠血清特异性抗体滴度。初次免疫4周后进行第2次免疫。第2次免疫2周后测定特异性抗体滴度。
7.结果
(1)初次免疫
初次免疫后14天测定小鼠血清抗原特异性抗体滴度，结果见图21。实验结果显示初次免疫后14天，与单独抗原组相比，联用PCP-A、PCP-B小鼠血清抗体滴度均明显升高，效果优于铝佐剂。
(2)二次免疫
二次免疫后14天，测定小鼠血清抗原特异性抗体滴度，结果见图22。单独抗原组小鼠血清抗体滴度水平进一步升高，但联用PCP-A和高剂量PCP-B组小鼠的抗体滴度水平仍高于抗原组，表明茯苓多糖组分PCP-A和PCP-B对乙肝抗原具有明显的佐剂效应。
实施例8多糖成分PCP-I和PCP-II对乙肝疫苗的佐剂活性
1.供试品
茯苓多糖组分PCP-I和PCP-II依据实施例3方法制备。
2.试剂
乙肝抗原：重组乙型蛋白亚单位，大连汉信生物医药有限公司生产(汉逊酵母表达HBsAg,不含铝佐剂，蛋白浓度0.221mg/ml)
铝佐剂：氢氧化铝，Thermofisher(赛默飞)公司生产。
3.动物
雌性Balb/c小鼠，6-8周龄。
4.实验分组和给药途径
实验分为7组(每组6只小鼠)：生理盐水组(control，肌肉注射，im)、乙肝抗原组(HBsAg，肌肉注射)、HBsAg+PCP-I组(肌肉注射，im)、HBsAg+PCP-I组(皮下注射，sc)、HBsAg+PCP-II组(肌肉注射，im)、HBsAg+PCP-II组(皮下注射，sc)和HBsAg+铝佐剂组(肌肉注射，im)。
5.给药剂量
乙肝抗原：2μg/鼠；PCP-I和PCP-II各按0.2mg/鼠给药；铝佐剂0.1mg/鼠。
6.免疫方案
小鼠初次免疫2周后ELISA方法测定小鼠血清特异性抗体及亚类抗体滴度。初次免疫4周后进行第2次免疫。第2次免疫2周后测定血清特异性抗体及亚类抗体滴度。
7.结果
(1)初次免疫
茯苓多糖成分PCP-I和PCP-II与乙肝抗原联用，分别采用肌肉注射和皮下注射途径进行免疫两次。初次免疫后14天小鼠血清特异性抗体滴度及亚类抗体滴度水平见图23-26。结果可以看出，初次免疫生理盐水组、单独抗原组及铝佐剂组小鼠血清抗体滴度水平均较低，之间无明显差异，产生的亚类抗体主要为IgM。联用PCP-I或PCP-II肌肉注射免疫后，多糖组小鼠的抗体滴度明显升高，联用PCP-I产生的亚类抗体主要IgM和IgG1，而联用PCP-II产生的亚类抗体主要IgM、IgG1和IgG2a。PCP-I或PCP-II与乙肝抗原皮下注射免疫也显示良好佐剂作用，但佐剂效果不及肌肉注射方式更强。
(2)二次免疫
二次免疫后14天小鼠血清特异性抗体及亚类抗体滴度水平见图27-30。从图中可以看出，二次免疫后单独抗原组和联用铝佐剂组小鼠血清抗体及亚类抗体滴度均明显升高，而联用多糖PCP-I或PCP-II的肌肉注射和皮下注射组小鼠抗体滴度以及亚类抗体IgG2a、IgG2b、IgG3和IgA滴度均显著高于单独抗原组，注射免疫方式仍优于皮下注射。结果表明PCP-I和PCP-II对乙肝抗原具有优良的佐剂作用。
实施例9PCP-I和PCP-II对H1N1流感疫苗的佐剂活性
1.供试品：
茯苓多糖组分PCP-I和PCP-II依据实施例3方法制备。
2.试剂：
H1N1流感抗原：H1N1流感病毒裂解液，30μg/ml，
北京科兴生物制品有限公司生产；
铝佐剂：氢氧化铝，Thermofisher(赛默飞)公司生产。
3.动物：
雌性Balb/c小鼠，6-8周龄。
4.分组：
小鼠分为正常盐水组、单独H1N1抗原组、H1N1+PCP-I组、H1N1+PCP-II组和H1N1+铝佐剂组。
5.免疫方案
将实施例3制备茯苓多糖成分PCP-I和PCP-II作为疫苗佐剂(剂量均为0.2mg/鼠)，铝佐剂剂量为(0.2mg/鼠)。分别与H1N1流感疫苗(3μg/鼠)混和，肌肉注射免疫小鼠，免疫2周后采用ELISA方法测定抗体和亚类抗体滴度。初次免疫后4周进行二次免疫，二次免疫后2周测定抗体和亚类抗体滴度。
6.实验结果
(1)初次免疫
茯苓多糖成分PCP-I和PCP-II与H1N1流感抗原联用，采用肌肉注射途径进行免疫两次。初次免疫后14天小鼠血清特异性抗体滴度水平见图31。结果可以看出，初次免疫生理盐水组、单独抗原组及铝佐剂组小鼠血清抗体滴度水平均较低，之间无明显差异，而联用PCP-I多糖组小鼠的抗体滴度水平明显升高(p<0.01)，佐剂效果优于铝佐剂。
(2)二次免疫
茯苓多糖成分PCP-I和PCP-II与H1N1流感抗原联用二次免疫后14天小鼠血清特异性抗体滴度水平见图32。从图中可以看出，二次免疫后单独H1N1流感抗原组明显升高，而联用多糖PCP-I或PCP-II的小鼠抗体滴度水平更加显著升高(p<0.01)。铝佐剂对H1N1流感抗原无佐剂活性。
实施例10PCP-A和PCP-B对免疫细胞的作用
1.供试品：
按照实施例2制备的茯苓多糖组分PCP-A和PCP-B进行以下实验。
2.对巨噬细胞增殖和吞噬功能的作用
PCP-A和PCP-B分别按终浓度为2，10和50μg/ml与MHS小鼠肺泡巨噬细胞培养48小时，MTT法测定对细胞增殖活性的影响，LPS按30μg/ml做阳性对照组。结果见表4。
取Balb/C小鼠腹腔巨噬细胞，调细胞浓度至5×105个/ml，接种96孔细胞培养板，分别加入脂多糖(LPS)、PCP-A和PCP-B，37℃孵育培养3小时后，加入0.1％中性红溶液，继续培养1小时。弃去培养板中液体，10mMPBS洗涤未被吞噬的中性红，然后加入细胞裂解液，静止过夜，酶标仪测定OD570nm光密度值，比较吞噬中性红染料的能力，结果见表5。结果表明PCP-A和PCP-B对巨噬细胞增殖和吞噬功能有促进作用。
表4PCP-A和PCP-B对巨噬细胞增殖的影响
表5PCP-A和PCP-B对巨噬细胞吞噬功能的影响
注：与溶剂对照组相比，***P<0.001。
3.对小鼠脾脏T细胞和B细胞的增殖作用
无菌取Balb/C小鼠脾脏，制备5×106个/ml浓度脾脏细胞悬液。将脾细胞悬液加入96孔细胞培养板中，100μl/孔，再加入100μl40μg/ml刀豆球蛋白A(ConA)或100μg/mlLPS，5％CO2培养箱37℃孵育48小时。每孔取出100μl上清弃去，加入5g/L噻唑蓝(MTT)溶液20μl，37℃，5％CO2培养箱中孵育4小时。取出96孔培养板向每孔中加入150μl二甲基亚砜(DMSO)，甲瓒颗粒完全溶解后，用酶标仪检测570nm波长光密度值(OD570nm)，数据见表6。结果表明PCP-A和PCP-B对小鼠脾脏T细胞和B细胞有促增殖活性。
表6PCP-A和PCP-B对小鼠脾脏T细胞和B细胞增殖的影响
注：与溶剂对照组相比，**P<0.01；与ConA或LPS组相比，#P<0.05，##P<0.01。
实施例11PCP-I和PCP-II对免疫细胞的作用
1.供试品：
按照实施例3制备茯苓多糖成分PCP-I和PCP-II，进行以下实验。
2.对巨噬细胞吞噬功能的影响
实验方法见实施例9，实验结果见表7。结果表明PCP-I和PCP-II能显著提高小鼠巨噬细胞吞噬功能。
表7PCP-I和PCP-II对小鼠巨噬细胞吞噬功能的影响
注：与溶剂对照组相比，*P<0.05；与LPS组相比，#P<0.05，##P<0.01.
3.对脾脏树突细胞分泌白细胞介素12(IL-12)的影响
Balb/C小鼠，处死，无菌取出脾脏，制备脾脏细胞悬液，计数活细胞数，调整细胞浓度为2.5×105个/ml备用。24孔平底培养板中每孔加入2.5×105个/ml细胞悬液100μl，再各加入100μlLPS(30μg/ml)、PCP-I或PCP-II(终浓度为1、10和50μg/ml)，每组受试药物浓度设3复孔，同时设溶剂对照孔。然后置于5％CO2、37℃饱和湿度的培养箱中培养48小时。离心，收集上清。采用ELISA试剂盒测定细胞上清液中的IL-12含量，数据见表8。结果表明PCP-I和PCP-II均能激活小鼠脾脏树突细胞，促进IL-12的分泌。
表8PCP-I和PCP-II对小鼠脾脏树突细胞分泌IL-12的影响
注：与溶剂对照组相比，*P<0.05,**P<0.01；与LPS组相比，#P<0.05。
4.对乙肝疫苗免疫小鼠脾脏T细胞和B细胞增殖的影响
无菌取实施例8中乙肝疫苗免疫小鼠脾脏，制备脾细胞悬浮液。用2mlTris-NH4Cl缓冲液裂解红细胞，离心洗涤2次，重悬细胞，台盼蓝染色计数，用20％胎牛血清(FBS)的RPMI1640培养基配制细胞数为5×106个/ml的浓度备用。将脾细胞悬液加入无菌96孔细胞培养板中，100μl/孔，再加入100μl4mg/L的ConA或40μg/ml的LPS，5％CO2培养箱37℃孵育48小时。每孔取出100μl上清弃去，加入5g/L的MTT溶液20μl，37℃，5％CO2培养箱中孵育4小时。取出培养板向每孔中加DMSO150μl，甲瓒颗粒完全溶解后，用酶标仪检测570nm吸光度(A570)，结果见表9。数据显示单独乙肝抗原免疫组小鼠脾脏T细胞和B细胞增殖与盐水组无明显差异。与单独抗原组相比，联用多糖PCP-I和PCP-II肌肉注射和皮下注射免疫均能显著促进T细胞和B细胞增殖，皮下注射效果优于肌肉注射，而且也均明显优于铝佐剂组。
表9PCP-I和PCP-II对乙肝抗原免疫小鼠脾脏淋巴细胞增殖的影响
注：与生理盐水组相比，**P<0.01；与乙肝抗原(HBsAg)组相比，#P<0.05，##P<0.01；与铝佐剂(Al(OH)3)组相比，$P<0.05，$$P<0.01.n＝5。
5.对乙肝抗原免疫小鼠脾脏淋巴细胞亚群的影响
无菌取实施例8中免疫小鼠脾脏，制备脾细胞悬浮液。将各组脾细胞悬液细胞浓度调整为1×107个/ml备用。取流式检测管5支各加入4℃存放的1％FBS的PBS(洗液)1.0ml，分别标记为1、2、3、4、5。再加入1×107/ml备用的正常对照组脾淋巴细胞0.1ml，混匀，1000r/min，4℃离心10min，弃掉上清，向管1加入洗液0.1ml，向管2-5依次加入2.5mg/L的PerCP仓鼠抗小鼠CD3e、5mg/L的APC大鼠抗小鼠CD19、1.25mg/L的PE大鼠抗小鼠CD4和5μg/ml的FITC大鼠抗小鼠CD8a的单标抗体溶液0.1ml，轻轻混匀。然后每组取平行3支流式检测管，加入4℃存放的洗液1.0ml，再加入各自实验组备用的1×107个/ml的脾淋巴细胞悬液0.1ml，混匀，1000r/min，4℃离心10min，并弃去上清，加入混标抗体(用洗液配成每毫升溶液中含有PerCP-CD3e2.5μg、APC-CD195μg、PE-CD41.25μg、FITC-CD8a5μg的混合体)溶液0.1ml，轻轻混匀。于室温下避光孵育25min，加入洗液1.5ml混匀，1000r/min，4℃离心10min，并弃去上清，各管加洗液500μl，将已标记的细胞样本充分摇匀，在FACScaliber流式细胞分析仪上，计数CD3+和CD19+细胞的百分率及CD3+/CD19+比值、CD4+和CD8+细胞的百分率及CD4+/CD8+比值，数据见表10和表11。从表10和表11中可以看出肌肉注射免疫乙肝抗原能提高脾脏CD3+细胞百分率，减少CD19+细胞百分率，联用PCP-I和PCP-II(肌肉注射方式)以及铝佐剂组小鼠脾脏CD3+和CD19+细胞百分率与单独抗原组无明显差异，表明有利于向T细胞分化。而联用PCP-II皮下注射组小鼠脾脏CD3+和CD19+细胞的百分率均显著降低。但对脾脏CD4+和CD8+细胞亚群的影响与CD3+和CD19+细胞不同，乙肝抗原联用PCP-I和PCP-II(肌肉注射方式)以及铝佐剂组均能同时明显提高CD4+和CD8+细胞百分率，但联用PCP-II皮下注射组小鼠脾脏CD4+和CD8+细胞的百分率均显著降低。
表10PCP-I和PCP-II对乙肝免疫小鼠脾脏CD3+和CD19+细胞亚群的影响
注：与生理盐水组相比，**P<0.01；与乙肝抗原(HBsAg)组相比，#P<0.05，##P<0.01；与铝佐剂(Al(OH)3)组相比，$P<0.05，$$P<0.01.n＝5.
表11PCP-I和PCP-II对乙肝免疫小鼠脾脏CD4+和CD8+T细胞亚群的影响
注：与生理盐水组相比，**P<0.01；与乙肝抗原(HBsAg)组相比，#P<0.05，##P<0.01；与铝佐剂(Al(OH)3)组相比，$P<0.05，$$P<0.01.n＝5。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims (30)

1.茯苓多糖组分，其选自以下多糖组分中的一种或两种：
1)多糖组分A，其含糖的重量百分比为50-80％，例如为50-70％，例如为50-60％，例如为55-60％，其含有岩藻糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖，其中岩藻糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖的相对摩尔比为1.0：(1.0～3.0)：(0.1～1.5)：(3.0～9.0)；
2)多糖组分B，其含糖的重量百分比为50-80％，例如为50-70％，例如为55-65％，例如为57-62％，其含有岩藻糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖，其中岩藻糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖的相对摩尔比为1.0：(1.0～3.0)：(0.1～5.5)：(3.0～10.0)。
2.权利要求1的茯苓多糖组分，其中多糖组分A的峰高分子量约为28210Da，其分子量范围为1.0×104～6.0×104Da。
3.权利要求1的茯苓多糖组分，其中多糖组分B的峰1的峰高分子量约为28582Da，其分子量范围为1.0×104～6.0×104Da，峰2的峰高分子量644500Da，其分子量范围为2.0×105～10.0×105Da。
4.茯苓多糖成分，其选自以下多糖成分中的一种或两种：
1)多糖成分Ⅰ，其含有岩藻糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖，其中岩藻糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖的相对摩尔比1.0：(1.0～2.5)：(0.1～1.0)：(3.0～9.0)。
2)多糖成分Ⅱ，其含有岩藻糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖，其中岩藻糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖的摩尔比为1.0：(0.5～3.0)：(0.05～1.0)：(3.0～10.0)。
5.权利要求4所述的茯苓多糖成分，其中，所述多糖成分Ⅰ的峰高分子量约为27900Da，分子量范围为1.0×104～5.5×104Da。
6.权利要求4所述的茯苓多糖成分，其中，所述多糖成分Ⅱ的峰高分子量约为29000Da，分子量范围为1.0×104～6.0×104Da。
7.茯苓总多糖，其是通过如下方法获得的：
(1)取中药材茯苓，加入水浸泡，得到水提液；
(2)将步骤(1)得到的水提液减压浓缩，浓缩液进行乙醇沉淀，沉淀部分加入水溶解，取上清液进行水透析或膜过滤；
(3)取透析液或滤液进行浓缩和冷冻干燥得到茯苓总多糖。
8.权利要求7所述的茯苓总多糖，其特征在于如下的(1)-(11)项中的任意一项或多项：
(1)步骤(1)中所述中药材茯苓为茯苓片、茯苓块或茯苓菌丝体粉末；
(2)步骤(1)中所用水为蒸馏水或去离子水；
(3)步骤(1)中，加入水浸提的温度为4～100℃，优选为20～60℃；
(4)步骤(1)中，将水提后得到的茯苓残渣按照相同条件进行一次或多次水提，合并水提液，例如进行两次浸提；
(5)步骤(1)中水的用量为茯苓药材的5-30倍量(L/Kg)，例如为10-20倍量(L/Kg)；
(6)步骤(2)中，将得到的水提液在50-55℃下进行减压浓缩，得到浓缩的水提液；
(7)步骤(2)中，乙醇沉淀的条件是：醇沉后乙醇的终浓度为60-80％，例如70-75％；醇沉的时间大于12小时，例如为48-72小时；
(8)步骤(2)中，乙醇沉淀后离心，得到的沉淀用水进行一次或多次溶解，离心，合并上清液；
(9)步骤(2)中，透析所用透析袋的截留分子量大于1000；或超滤去除分子量小于1000的小分子成分；
(10)步骤(2)中，用自来水和/或蒸馏水进行透析；
(11)步骤(3)中所述浓缩为在50-55℃下进行减压浓缩。
9.权利要求1-3任一项所述的茯苓多糖组分的制备方法，其包括如下步骤：
取权利要求7或8所述的茯苓总多糖，溶解后进行DEAE-纤维素柱层析，依次用H2O和0.15-0.3mol/LNaHCO3洗脱，检测糖峰，分别得到多糖组分A和多糖组分B。
10.权利要求4-6任一项的茯苓多糖成分的制备方法，其包括如下步骤：
取权利要求1-3任一项所述的茯苓多糖组分A或B，分别经凝胶柱层析，用水或0.05～0.2mol/LNaCl洗脱，检测糖峰，分离纯化，则分别获得多糖成分Ⅰ或多糖成分Ⅱ。
11.权利要求10的制备方法，其中所述凝胶柱包括葡聚糖凝胶柱(例如Sephadex柱)、聚丙烯酰胺凝胶柱(例如Bio-GelP柱)或琼脂糖凝胶柱(例如Sepharose柱和Bio-gelA柱)。
12.权利要求11的制备方法，其中所述葡聚糖凝胶柱包括SephadexG-100或SephadexG-75。
13.茯苓多糖组分，其选自多糖组分A和多糖组分B中的一种或两种，其中多糖组分A或多糖组分B是通过如下方法获得的：
取权利要求7或8所述的茯苓总多糖，溶解后进行DEAE-纤维素柱层析，依次用H2O和0.15-0.3mol/LNaHCO3洗脱，检测糖峰，分别得到多糖组分A和多糖组分B。
14.权利要求13的茯苓多糖组分，其中，
所述多糖组分A含糖的重量百分比为50-80％，例如为50-70％，例如为50-60％，例如为55-60％，其含有岩藻糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖，其中岩藻糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖的摩尔比为1.0：(1.0～3.0)：(0.1～1.5)：(3.0～9.0)；
所述多糖组分B含糖的重量百分比为50-80％，例如为50-70％，例如为55-65％，例如为57-62％，其含有岩藻糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖，其中岩藻糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖的摩尔比为1.0：(1.0～3.0)：(0.1～5.5)：(3.0～10.0)。
15.权利要求13或14的茯苓多糖组分，其中，多糖组分A的峰高分子量约为28210Da，其分子量范围为1.0×104～6.0×104Da。
16.权利要求13或14所述的茯苓多糖组分，其中，多糖组分B的峰1的峰高分子量约为28582Da，其分子量范围为1.0×104～6.0×104Da，峰2的峰高分子量644500Da，其分子量范围为2.0×105～10.0×105Da。
17.茯苓多糖成分，其选自多糖成分Ⅰ和多糖成分Ⅱ中的一种或两种，其中所述多糖成分Ⅰ和多糖成分Ⅱ是通过如下方法获得的：
取权利要求1-3或权利要求13-16任一项所述的茯苓多糖组分中的多糖组分A或B，分别经凝胶柱层析，用0.05～0.2mol/LNaCl(例如0.1mol/LNaCl)洗脱，检测糖峰，分离纯化，则分别获得多糖成分Ⅰ或多糖成分Ⅱ。
18.权利要求17所述的茯苓多糖成分，其中所述凝胶柱包括葡聚糖凝胶柱(例如Sephadex柱)、聚丙烯酰胺凝胶柱(例如Bio-GelP柱)或琼脂糖凝胶柱(例如Sepharose柱和Bio-gelA柱)。
19.权利要求18所述的茯苓多糖成分，其中所述葡聚糖凝胶柱包括SephadexG-100或SephadexG-75。
20.权利要求17-19任一项所述的茯苓多糖成分，其中，
所述多糖成分Ⅰ含有岩藻糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖，其中岩藻糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖的摩尔比为1.0：(1.0～2.5)：(0.1～1.0)：(3.0～9.0)；
所述多糖成分Ⅱ含有岩藻糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖，其中岩藻糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖的摩尔比为1.0：(0.5～3.0)：(0.05～1.0)：(3.0～10.0)。
21.权利要求17-20任一项所述的茯苓多糖成分，其中多糖成分Ⅰ的峰高分子量约为27900Da，分子量范围为1.0×104～5.5×104Da。
22.权利要求17-21任一项的茯苓多糖成分，其中多糖成分Ⅱ的峰高分子量约为29000Da，分子量范围为1.0×104～6.0×104Da。
23.药用组合物，其包含权利要求1-3任一项或13-16任一项所述的茯苓多糖组分或者权利要求4-6、17-22任一项所述的茯苓多糖成分，任选的，还包含药用成分和/或其它药用辅料。
24.疫苗制剂或疫苗组合物，其包含权利要求1-3任一项或13-16任一项所述的茯苓多糖组分或者权利要求4-6、17-22任一项所述的茯苓多糖成分或权利要求23所述的组合物。
25.疫苗佐剂，其包含权利要求1-3任一项或13-16任一项所述的茯苓多糖组分或者权利要求4-6、17-22任一项所述的茯苓多糖成分。
26.疫苗辅料，其包含权利要求1-3任一项或13-16任一项所述的茯苓多糖组分或者权利要求4-6、17-22任一项所述的茯苓多糖成分。
27.权利要求1-3任一项或13-16任一项所述的茯苓多糖组分或者权利要求4-6、17-22任一项所述的茯苓多糖成分用于制备抗体(例如哺乳动物用抗体)、疫苗制剂或疫苗组合物的用途，或者作为疫苗辅料或疫苗佐剂的用途。
28.权利要求1-3任一项或13-16任一项所述的茯苓多糖组分或者权利要求4-6、17-22任一项所述的茯苓多糖成分作为免疫调节剂的用途。
29.一种制备抗体的方法，其包括使用有效量的权利要求1-3任一项或13-16任一项所述的茯苓多糖组分或者权利要求4-6、17-22任一项所述的茯苓多糖成分的步骤。
30.权利要求29所述的方法，其中，所述抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107801981A (zh) * 2017-10-19 2018-03-16 广州泽力医药科技有限公司 凝胶型茯苓产品及其制备方法和应用
CN112225831A (zh) * 2020-11-03 2021-01-15 华中农业大学 一种活性茯苓多糖、其制备方法及应用
CN115611993A (zh) * 2022-10-27 2023-01-17 常熟理工学院 一种枸杞多糖的提取方法

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109232768A (zh) * 2018-08-31 2019-01-18 华南理工大学 一种具有抗炎症性肠病活性的羧甲基茯苓多糖及其制备与应用
CN112089834B (zh) * 2020-10-26 2022-11-18 北京工业大学 基于氧化石墨烯的茯苓多糖纳米佐剂及佐剂/抗原共递送疫苗的制备与应用
CN113912751A (zh) * 2021-12-01 2022-01-11 上海市农业科学院 一种富含半乳糖的灵芝孢子粉多糖及其制备方法
CN115232221B (zh) * 2022-05-31 2023-11-17 海南医学院 具有防治肺部感染的薜荔多糖及其制备方法与应用
CN115028752B (zh) * 2022-06-24 2023-04-07 黑龙江葵花药业股份有限公司 一种均一的水溶性多糖及其制备方法和应用
CN115176890A (zh) * 2022-06-29 2022-10-14 瑞普高科(天津)生物技术有限公司 茯苓β-1,3-D-葡聚糖在制备提高生长性能的饲料添加剂中的用途

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1483827A (zh) * 2002-09-16 2004-03-24 上海大杨保健品科技发展有限公司 一种活性茯苓多糖的制备方法
CN101711778A (zh) * 2008-10-07 2010-05-26 天津中医药大学 用于抑制肿瘤和防治转移及复发的茯苓多糖组合物与应用
CN105237649A (zh) * 2014-07-11 2016-01-13 中国人民解放军军事医学科学院毒物药物研究所 一种茯苓多糖、其制备方法及用途

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1205231C (zh) * 2003-01-06 2005-06-08 武汉大学 一种具有抗肿瘤活性的水溶性杂多糖及其制备方法和用途
CN1205230C (zh) * 2003-01-06 2005-06-08 武汉大学 一种水溶性杂多糖及其制备方法和用途
CN102399299B (zh) * 2011-12-05 2013-05-22 湖北泱盛生物科技有限公司 一种茯苓酸性多糖提取物的制备方法及应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1483827A (zh) * 2002-09-16 2004-03-24 上海大杨保健品科技发展有限公司 一种活性茯苓多糖的制备方法
CN101711778A (zh) * 2008-10-07 2010-05-26 天津中医药大学 用于抑制肿瘤和防治转移及复发的茯苓多糖组合物与应用
CN105237649A (zh) * 2014-07-11 2016-01-13 中国人民解放军军事医学科学院毒物药物研究所 一种茯苓多糖、其制备方法及用途

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
YIFENG WANG ET AL: ""Chemical components and molecular mass of six polysaccharides isolated from the sclerotium of Poria cocos"", 《CARBOHYDRATE RESEARCH》 *
陈莉: "茯苓多糖提取工艺的优化及开发利用研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 工程科技Ⅰ辑》 *
黄灿等: ""三种不同分子量段茯苓多糖的制备以及其组成分析"", 《中华中医药学刊》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107801981A (zh) * 2017-10-19 2018-03-16 广州泽力医药科技有限公司 凝胶型茯苓产品及其制备方法和应用
CN107801981B (zh) * 2017-10-19 2020-09-29 广州泽力医药科技有限公司 凝胶型茯苓产品及其制备方法和应用
CN112225831A (zh) * 2020-11-03 2021-01-15 华中农业大学 一种活性茯苓多糖、其制备方法及应用
CN115611993A (zh) * 2022-10-27 2023-01-17 常熟理工学院 一种枸杞多糖的提取方法

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