CN102370977B

CN102370977B - 一种新型疫苗佐剂及应用

Info

Publication number: CN102370977B
Application number: CN201010247976.0A
Authority: CN
Inventors: 王希良; 刘春环; 唐冲; 罗德炎; 杨鹏辉; 赵忠鹏; 王铖; 邢丽; 刘永祥
Original assignee: Chifeng Boen Pharmaceutical Co ltd; Institute of Microbiology and Epidemiology of AMMS
Current assignee: Beijing Maidi Libang Biological Science & Technology Co., Ltd.
Priority date: 2010-08-06
Filing date: 2010-08-06
Publication date: 2014-02-26
Anticipated expiration: 2030-08-06
Also published as: CN102370977A

Abstract

本发明公开了一种新型疫苗佐剂(又称SPO1疫苗佐剂)及其制备方法，本发明疫苗佐剂主要由角鲨烯、聚氧乙烯蓖麻油和聚醚组成，可以通过注射或喷鼻、透皮非注射等途径免疫，且非注射接种疫苗具有成本低，给药方便，避免交叉感染，安全性高的特点；本发明SPO1疫苗佐剂可与灭活全病原体、裂解病原提取组分、细菌囊泡、荚膜多糖或多糖结合蛋白、重组蛋白、重组VLP、DNA或RNA核酸等不同类型抗原制备疫苗，可适用于不同年龄段人群、不同动物疫苗制备及免疫接种；并且没有复杂结构，工艺简单，便于制备和除菌，成本低，适宜大批量生产产业化。

Description

一种新型疫苗佐剂及应用

技术领域

本发明涉及一种疫苗佐剂及其制备方法，特别涉及一种新型的水包油疫苗佐剂及其制备方法，，又称一种SPO1佐剂，用于不同类型抗原的疫苗制备，用于不同年龄人群、动物免疫接种所需疫苗佐剂。

背景技术

随着现代生物技术的迅速发展，裂解疫苗、重组亚单位疫苗、抗独特型抗体疫苗、核酸疫苗及合成肽疫苗等得到开发。这些疫苗抗原纯度高，相对分子量小，疫苗的不良反应低，然而这些抗原的免疫原性和免疫保护性普遍较弱，为了提高抗原的有效性，必须在抗原中添加佐剂以增强它们诱导免疫反应的能力。

佐剂与抗原同时或预先应用，能增强机体针对抗原的免疫应答能力，或改变免疫反应类型。其功能主要有：使用部位招揽免疫细胞和免疫分子，增强免疫应答；增强疫苗抗原传递；增进免疫接触；增强弱抗原的免疫原性和免疫记忆，如高度纯化的抗原或重组抗原；减少抗原接种剂量和接种次数；促进疫苗在免疫应答能力弱的群体中的免疫效果；加快免疫应答的速度和延长持续时间；改变抗原的构型；改变体液抗体的种类、IgG亚类和抗体的亲和性，以及细胞免疫和黏膜免疫效应。理想的佐剂不仅没有免疫原性并能增强机体的免疫应答，更能使机体获得最佳的保护性免疫和免疫记忆。

铝佐剂是目前普遍被批准用于人类疫苗的主要佐剂，自1926年Glenny首先应用铝盐吸附白喉类毒素至今已广泛应用于疫苗，有磷酸铝和氢氧化铝两种铝盐佐剂。但是铝佐剂以体液免疫应答为主，不能诱导细胞免疫和黏膜免疫应答效应，特别是近几年发现多次使用出现免疫抑制和累积中毒而使用受限，并且对一些疫苗抗原无效，有些出现注射部位偶有严重的局部反应出现红斑皮下结节接触性过敏和肉芽肿性炎症，因此寻找新的疫苗佐剂成为疫苗学的重大现实问题。此后，1997年欧洲国家批准水包油MF59、virosomes佐剂上市，其产生的抗体效价比铝佐剂安全性高、效果好，而且兼顾产生一定细胞免疫效应，是铝盐被批准使用70年后第一个被允许用于人体的疫苗佐剂。随后2005年在Montanide W/O水包油佐剂中加入维生素E制备的AS03；2007年在MPL中加入铝盐制备的AS04佐剂，均在欧洲上市。这类佐剂通过注射接种增强疫苗抗原的免疫原性，诱导特异的抗体反应，激发Th1型细胞因子(IFN-γ、IL-2等)产生较强的CTL反应。除此以外，许多其他新型佐剂也层出不穷，比如MPL、PolyI:C、免疫刺激复合物、CPG-OPN疫苗佐剂等，均有各自的优势和不足。因此发展寻求新的安全的佐剂已成为迫求需求。特别是既用于注射又能用于黏膜、透皮免疫佐剂越来越为人们所重视，至今还没有，并成为今后佐剂发展的重要领域。

非注射免疫疫苗在抵御气溶胶感染多种重大传染病病预防方面发挥了重要作用，具有巨大的发展潜力和应用前景，这已是不争的事实。然而，在发展黏膜、透皮非注射免疫疫苗过程中最大的障碍是寻找安全、高效的疫苗佐剂系统。佐剂是疫苗产品的主要成分，在新型疫苗设计中具有重要作用，它通过与抗原同时或预先应用，能够增强机体针对抗原的免疫应答能力，或改变免疫反应类型。佐剂作用的确切机制未明，据报道与下列因素有关，延长抗原滞留时间；减少抗原接种剂量和接种次数；促进疫苗在免疫应答能力弱的群体中的免疫效果；加快免疫应答的速度和延长持续时间；增强免疫细胞激活所需要的协同刺激信号；诱生肉芽肿(富含巨噬细胞)的形成促进T细胞激活；刺激淋巴细胞非日特异性增殖等。因此，针对新发、突发重大传染病黏膜疫苗及疫苗通用技术平台急需开发新型的通用型黏膜免疫佐剂，以增强黏膜疫苗的免疫应答和免疫保护效果，同时减少疫苗的接种剂量和接种次数。

非注射免疫疫苗在抵御气溶胶感染多种重大传染病病预防方面发挥了重要作用。鼻免疫系统广泛而复杂，它是呼吸道的开始，处于中耳、眼、口腔抵抗抗原物质的枢纽位置，有保护下呼吸道的作用；它可对远处黏膜如泌尿生殖道、胃肠道免疫反应也能起到免疫应答保护。黏膜免疫系统区别于全身系统免疫的特征是天然防护的形成机制，一定数量独特淋巴细胞集群的存在，起源于黏膜组织的细胞对黏膜和外分泌腺的聚集以及对非危险抗原反应抑制的优先诱导。同样皮肤是疫苗免疫的一个理想部位，表皮中富含郎格罕斯细胞及皮下、肌肉中富含树突状抗原提呈细胞，形成独特强有力的免疫识别、应答和效应网络。通过皮肤机体能有效接触外来抗原产生系统免疫应答和粘膜免疫应答的双重效应，从而达到全面免疫保护效果，并且抗原与提呈细胞直接接触大大降低抗原用量，以及微针矩阵(microneedle arrays)、透皮(pacth)贴剂非注射免疫使得抗原大面积散布在黏膜、皮肤免疫组织中有更多机会被抗原细胞利用，诱发产生系统免疫与黏膜免疫及细胞免疫应答，从而提高免疫保护效果的优势，这是有针注射免疫不能并寐的。

因此需要提高疫苗的安全性、耐受性、免疫原性和免疫保护性就要在靶向局部和系统同时提高全面免疫应答和效应反应。目前，越来越多的纯化的具有良好特性的疫苗与佐剂结合，并试图提高成人、儿童及老年人特殊人群，以及动物的免疫原性。所以，筛选制备具有体液免疫与细胞免疫、黏膜免疫与系统免疫以及天然免疫与获得性免疫应答的疫苗佐剂是很有必要。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新型疫苗佐剂，另一个目的在于提供其制备方法及应用。

本发明目的是通过如下技术方案实现：

本发明疫苗佐剂的原料组成为：

角鲨烯 2.0％-12.5％

聚氧乙烯蓖麻油 0.05％-10％

聚醚 0.05％-10％

缓冲液加至100％

本发明疫苗佐剂的原料组成优选为：

角鲨烯 2.5％-10％

聚氧乙烯蓖麻油 0.1％-5％

聚醚 0.1％-5％

缓冲液加至100％

本发明疫苗佐剂的原料组成优选为：

角鲨烯 5.0％

聚氧乙烯蓖麻油 0.25％-0.5％

聚醚 0.25％-0.5％

缓冲液加至100％

其中所述的原料百分比是w/v的关系；

其中所述的缓冲液是去离子水、生理盐水、磷酸盐缓冲液、柠檬酸钠缓冲液中的一种。

其中所述的角鲨烯(Squalene)属开链三萜，又称鱼肝油萜，其中文的化学名称是角鲨烯或(全E)-2，6，10，15，19，23-六甲基-2，6，10，14，18，22-二十四碳己烯，其英文名称是Squalene或6，10，14，18，22-Tetracosahexaene，2，6，10，15，19，23-hexamethyl-，(all-E)-2或(e，e，e，e)-squalene或14，18，22-tetracosahexaene，2，6，10，15，19，23-hexamethyl-(all-e)-10或spinacen。其CAS：111-02-4，分子式：C₃₀H₅₀，分子质量：410.72，沸点：285℃，熔点：-75-286℃，来源于动物、植物提取或化学合成。

其中所述的聚氧乙烯蓖麻油(polyoxyethylenated castor oil)是非离子型表面活性剂，主要起乳化作用。HLB值：13，浊点：85℃，商品名称是乳化剂EL。

其中所述的聚醚(poly ethylene glycol block-poly propylene glycol block-polyethylene glycol)又称聚乙二醇醚，关于聚醚的配方是：以环氧乙烷、环氧丙烷、环氧丁烷和四氢呋喃等为原料，在催化剂作用下开环均聚或共聚制得的线型聚合物。

本发明疫苗佐剂简称为SPO1佐剂。

取上述原料，按照常规工艺制成疫苗佐剂。

本发明疫苗佐剂的制备方法为：

取原料使用匀浆机制备初乳，匀浆条件为：转速5000rpm-15000rpm，时间1-10min；或者使用超声波来制备初乳，超声5-10次，45s/次，初乳的粒径为x₁₀＝1612.39±10nm，x₅₀＝1969.24±10nm，x₉₀＝2401.49±10nm，SMD＝1946.88±10nm，VMD＝1992.92±10nm(见图1)；均质初乳：均质条件为压力5000-8000psi，5-8个循环，测量其粒径为x₁₀＝197.10±10nm，x₅₀＝240.37±10nm，x₉₀＝292.69±10nm，SMD＝237.53±10nm，VMD＝243.16±10nm，(见图2)，再次均质，均质条件：压力8000-15000psi，5-8个循环，测量其粒径为x₁₀＝125.12±10nm，x₅₀＝155.54±10nm，x₉₀＝193.14±10nm，SMD＝153.30±10nm，VMD＝157.78±10nm(见图3)，制备成乳白色的疫苗佐剂制剂后，缓冲液选择去离子水、生理盐水、磷酸盐缓冲液、柠檬酸钠缓冲液中的一种，采用0.22μm滤器过滤除菌，即得。佐剂电镜图片(见图4、图5)。

其中所述的匀浆条件优选为转速6000rpm，时间2-5min，或者用超声波来制备初乳时优选超声6-8次。

其中制备初乳、均质初乳以及再次均质时粒径的测量方法为常规测量方法。

本发明疫苗佐剂可以是溶液所形成胶体或微球，颗粒大小均匀，粒径在90nm-200nm之间，平均粒径150nm左右；本发明水包油疫苗佐剂，可与各种抗原如灭活全病原体、裂解病原提取组分、细菌囊泡、荚膜多糖或多糖结合蛋白、重组蛋白、重组VLP、DNA或RNA核酸等混匀，制备不同类型的疫苗，其中所述疫苗按照常规工艺，加入常规辅料，制成药学上可接受的注射剂、微针矩阵剂、喷鼻剂、透皮贴剂等各种剂型，其中所述疫苗适用于不同年龄人群、不同动物的免疫接种。

本发明是一种安全有效且稳定的SPO1疫苗佐剂，能够招揽抗原注射部位或黏膜部位免疫细胞和免疫分子聚集，增强特异性细胞免疫和体液免疫应答效应，可调节抗体对抗原的亲和性与专一性；同时可以通过注射或黏膜等途径免疫，且黏膜途径免疫与注射疫苗免疫相比，黏膜接种疫苗具有成本低，给药方便，避免交叉感染，安全性高的特点；本发明的SPO1疫苗佐剂可适用于儿童、老年人、孕妇等特殊群体，以及各种动物的免疫接种；并且没有复杂结构，工艺简单，适宜大批量生产产业化。

附图说明

图1：制备初乳的粒径：x₁₀＝1612.39nm，x₅₀＝1969.24nm，x₉₀＝2401.49nm，SMD＝1946.88nm，VMD＝1992.92nmm；

图2：均质初乳的粒径：x₁₀＝197.10nm，x₅₀＝240.37nm，x₉₀＝292.69nm，SMD＝237.53nm，VMD＝243.16nm；

图3：再次均质初乳的粒径：x₁₀＝125.12nm，x₅₀＝155.54nm，x₉₀＝193.14nm，SMD＝153.30nm，VMD＝157.78nm；

图4、图5：佐剂电镜图片

下述实验例和实施例用于进一步证明但不限于本发明。

实验例1 SPO1佐剂的安全性实验

1、无菌、支原体试验

将实施例1制备的SPO1佐剂接种硫乙醇酸盐培养基、营养琼脂斜面培养基和改良马丁培养基培养14d，并以无菌生理盐水做阴性对照，培养温度为25℃、35℃。结果显示，SPO1疫苗佐剂未见细菌生长。将SPO1佐剂分别用半流体和肉汤培养基，37℃初代培养21天，次代培养21天，无菌生理盐水做阴性对照，结果显示SPO1佐剂无支原体生长；用DNA染色法将毒种接种Vero细胞后培养3天，传代一次，用二苯甲酰胺荧光染料染色，结果显示疫苗佐剂无支原体生长。

2、溶血性试验

选取体重为350g左右的豚鼠，采集新鲜豚鼠血1ml，用PBS洗涤3次，再将血细胞体积恢复并稀释10倍。PBS稀释SPO1佐剂(SPO1佐剂由实施例1制备)，分别为2倍、4倍、8倍，将豚鼠血细胞加入到稀释的待检佐剂中，8小时后，评价血球溶解以目测或者上清浓度检测为准，并在570nm处检测吸光度。结果显示，没有发生血球破裂，无溶血现象。说明SPO1佐剂中的成分不能使红细胞裂解。因此，SPO1疫苗佐剂无溶血反应。

3、急性毒性试验

取实施例1制备的SPO1佐剂0.5ml腹腔注射体重为12～18g Balb/C小鼠，每组10只，同时设PBS阴性对照组，连续2周观察小鼠的活动状态、体重变化和存活率。结果表明，实验小鼠全部存活，没有出现竖毛、精神萎靡、行动迟缓等不良症状，而体重呈现增加，由此证明新型佐剂在试验的浓度下对动物是安全的，且14天后处死进行大体解剖检查，未见脏器有病理改变。

在体重为8～10kg的Beagle狗体内的急性毒性结果：取实施例1制备的SPO1佐剂肌肉或腹腔注射15ML，每组10只，同时设PBS阴性对照组，连续2周观察行为、体重和存活率变化。结果可见，Beagle狗未见毒性反应，行为正常，没有死亡，与对照组狗比较无差异，各狗体重有所增加，并处死大体解剖未见脏器有明显的病理改变。

根据此结果换算成人用剂量，例：一个50公斤的成年人，可使用SPO1的最大安全剂量是50ml-100ml。因此，SPO1疫苗佐剂在动物、人体体内无急性毒性反应，使用是安全的。

4、最大致死量试验

分别取实施例1制备的SPO1佐剂200ul、500ul、1000ul、1500ul腹腔注射体重为12～18g Balb/C小鼠，每剂量组5只，连续2周观察小鼠的死亡情况。由试验可得出：200ul、500ul组小鼠没有出现任何异常状态，饮食睡眠行动均很正常，体重增加；1000ul组小鼠在注射后两天内体重平均下降1-2g左右，5天后体重开始上升，没有其它异常现象。取小鼠肺、脾、肾、肝等内脏制备病理切片，发现1000ul组小鼠肺部和肝部有散在出血点。1500ul组小鼠在腹腔注射24小时内陆续死亡。结果：1500ul佐剂是小鼠的最大致死剂量。

5、过敏试验研究

取实施例1制备的SPO1佐剂皮下接种体重为250～350g Hartley豚鼠，每个样品接种豚鼠5只，每只接种0.5ml，隔日一次，共3次。第3次注射后21天，耳静脉给予相同SPO1佐剂0.5ml，并用人血白蛋白和生理盐水以同样的方法分别接种3只豚鼠作为阳性、阴性对照。注射后30分钟及3天观察动物，阳性、阴性对照均成立，SPO1佐剂组豚鼠无死亡，且无鼻痒、喷嚏、烦躁不安、呼吸困难、休克、痉挛等过敏症状。因此，SPO1疫苗佐剂在动物体内无过敏反应。

6、兔热源质试验

取预检合格的体重为2～3kg家兔3只固定，30分钟后测量体温，共测2次，间隔30分钟，要求2次温差不大于0.2℃，各家兔2次平均温度在38.6-39.5℃。将实施例1制备的SPO1疫苗佐剂预热至38℃，于第2次测温后15分钟内，自家兔耳边静脉缓缓注入0.5ml/只。注射后每隔30分钟测量体温1次，连测6次。结果显示：SPO1佐剂给予家兔个体升温未超过0.2℃，3只家兔升温总和未超过0.4℃，没有引起家兔的发热反应。因此，制备的SPO1佐剂无热源质。

7、血管刺激性研究

取实施例1制备的SPO1佐剂通过肌肉注射或喷鼻给体重为18g Balb/C小鼠、2～3.5kg恒河猴、50Kg人体，每次500ul，每日2次，连续5日，结果：鼻腔或肌肉注射Balb/C小鼠、恒河猴、人体表现正常，没有不适等反应，与给生理盐水组无明显变化；Balb/C小鼠、恒河猴鼻腔、气管和肺脏，以及注射部位病理切片显微镜检未见有炎性浸润、血管周围组织出血及坏死等刺激现象。因此，制备的SPO1佐剂无明显血管刺激性、黏膜刺激性。

8、长期毒性研究

分别将低(0.5ml)、中(1ml)、高(2ml)剂量的SPO1佐剂肌肉注射体重为250～300g的成年大鼠和8～10kg的Beagle犬，每天注射一次，连续给药1个月，观察其体重和体表变化、精神状态、食欲、睡眠情况及血液中细胞变化情况，连续观察三个月。结果显示：是反复给药后高剂量组的大鼠体重在停药给药21天两周内出现下降，精神不振，食欲不佳，体重下降，并停止注射SPO1佐剂后很快恢复正常；其余低中剂量两组连续注射30天体重没有出现明显的波动，精神状态良好，食欲和睡眠情况没有明显变化。由此，SPO1佐剂中、低剂量给与Beagle犬没有长期毒性。

9、代谢降解性研究

采用放射性¹³¹I-标记结合分子排阻高效液相(SHPLC)和TCA酸沉淀放射性测定研究I-标记物在体重为3.5～5kg猕猴血清中浓度、代谢降解变化及时间过程；及总放射性在尿、粪排泄物中的排泄量和时间过程，研究SPO1佐剂在体外与血浆蛋白结合的情况。其中SPO1佐剂由实施例1方法制备；

(1)选取健康猕猴3只，皮下注射¹²⁵I-SPO1佐剂0.2ml，收集给药前以及给药后0.5、1、2、4、8、12、24、48、72、96、120h静脉血，血清加入等量20％TCA沉淀蛋白，测定总γ放射性，结果见表1。

(2)选取健康猕猴3只，皮下注射¹²⁵I-SPO1佐剂0.2ml，喂其标准饲料，自由饮水，注射后12、48、72、120、168和192h分别收集尿和粪，测定γ放射性，计算排出放射性占注入放射性量的百分数，结果见表2。

表1 给药后不同时间检测静脉血中总γ放射性

注：SPO1佐剂中角鲨烯的含量为5g/100ml，猕猴皮下注射角鲨烯量为10mg。总γ放射性通过静脉血中血药浓度来检测。表中的血药浓度为3只猕猴的检测平均值。

表2 注射后猕猴排泄物中放射性占总放射性量的百分数

(3)取体重为250～300g正常大鼠的血浆，每管200μL，分别加入¹²⁵I-SPO1佐剂，使血浆药物浓度分别为100ng.mL^-1、500ng.mL^-1和2500ng.mL^-1。4℃过夜或37℃水浴5min，取血浆直接上分子筛凝胶柱，用分子筛排阻HPLC法检测¹²⁵I-SPO1佐剂与血浆蛋白结合情况，计算血浆蛋白结合率分别为68％、75％、80％。

结果显示，注射后12h猕猴排除放射性占总注入的28％左右，直到192h猕猴的排泄物放射性占注入放射性总量的达到0.5％，总回收率能达到79.5％。SPO1佐剂在体内最长时间2周左右，最快7天代谢完全，具有良好的代谢分解，不停留累积的效果。

10、致畸、致瘤研究

SPO1佐剂(由实施例1方法制备)对动物致畸、致瘤的影响：分别以10.0ML/kg剂量连续肌肉注射、滴鼻给药对体重为14-18g BALB/C小鼠、体重为3-5kg恒河猴14天，通过大体解剖、微观病理观察。结果表明SPO1佐剂无致畸、致瘤，证明SPO1佐剂的使用具有安全性。

11、一般药物学观察

SPO1佐剂(由实施例1方法制备)对动物中枢神经系统、心血管系统、呼吸系统的影响：分别以0.1ML/kg、1.0ML/kg、5.0ML/kg剂量肌肉注射、滴鼻给药对12～16gBALB/C小鼠自主活动未见有明显的影响；分别以0.1ML/kg、1.0ML/kg、5.0ML/kg剂量给体重为3～4.5kg猫注射、滴鼻给药给药，记录给药前及给药后5分钟、10分钟、20分钟、30分钟、60分钟猫的血压、呼吸、心率、心电，与给药前比较均未见明显改变。试验结果表明：SPO1佐剂给药对小鼠自主活动未见有明显的影响，且给药对猫的心率、血压、心电、呼吸的影响与给药前比较均未见明显改变。同时按0.1ML/kg、1.0ML/kg、5.0ML/kg剂量肌肉注射、滴鼻给药对人体的血压、呼吸、心率、心电，与给药前比较均未见明显改变，证明SPO1佐剂具有安全性。

实验例2 SPO1佐剂的稳定性

分装SPO1佐剂(SPO1佐剂由实施例1制备)分别置于2-8℃、室温(20-25℃)、37℃1周、2周、1个月、3个月、6个月、12个月、18个月和24个月，取样观察外观、PH值、无菌、电镜观察粒径、免疫动物观察安全性。结果显示：SPO1佐剂放置2-8℃24个月内均无变色分层等现象，PH值在5.5-6之间无变化，电镜观察粒径大小保持一致，且注射或滴鼻Balb/c小鼠表现正常；SPO1佐剂放置室温2-8℃10个月内均有好的稳定性和佐剂效果；SPO1佐剂放置室温37℃6个月内均有好的稳定性和佐剂效果。由结果说明，SPO1疫苗佐剂放置2-8℃理化性质、生物学性能稳定，有效期至少24个月。

实验例3 SPO1佐剂效应及有效性

1、SPO1佐剂滞留及效应

以SPO1佐剂(SPO1佐剂由实施例1制备)通过荧光素标记后皮下、肌肉注射、滴鼻给体重为16-18g Balb/c小鼠、350～500g的豚鼠、3～5kg的恒河猴动物，观察荧光标记SPO1佐剂注射部位免疫细胞和免疫分子变化，评价该佐剂的效应。结果可见，注射60分钟就在局部有中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、巨噬细胞、DC细胞等免疫细胞的侵润，及IL-1、IL-4、IL-6等炎性因子和趋化因子的召集参与佐剂的免疫应答，注射2天后到达淋巴结组织产生免疫效应。约在注射部位持续3天后SPO1佐剂被代谢吸收，天然免疫细胞及效应分子随之减少，而获得性免疫主要以体液免疫的抗体效应出现，及滴鼻途径的黏膜免疫应答出现。并随之上升，达到一定程度注射可维持4个月，而黏膜可维持7个月以上，并且SPO1佐剂在不同两种动物间结果有表现出相同的免疫应答和和效应趋势。由此可见，SPO1佐剂具有对疫苗抗原滞留作用，并具有诱导天然免疫和获得性免疫以及黏膜免疫应答效应，且有良好长效性。

2、基于SPO1佐剂疫苗在动物体内的有效性

以本发明的SPO1佐剂(由实施例1方法制备)为例，与流感、病毒性乙肝、甲肝、丙肝、手足口病、HPV、HSV、狂犬病、流脑、HIB等病原体不同类型抗原成分，如灭活全病原体、裂解病原提取组分、细菌囊泡、荚膜多糖或多糖结合蛋白、重组蛋白、重组VLP、DNA或RNA核酸等与等体积SPO1佐剂0.5ML混匀制备不同类型疫苗，并与铝盐佐剂、没有佐剂做对照，通过皮下或肌肉注射、黏膜途径免疫12～16g小鼠，间隔21-28天，免疫2次，观察基于SPO1佐剂的疫苗有效性。由表3可见，SPO1佐剂的疫苗均能诱导体液免疫应答及黏膜免疫应答效应，比铝盐佐剂产生的免疫应答效应好，且所产生的黏膜免疫应答效应是铝盐佐剂不具备的，为现有病原体灭活全病毒、裂解组分、细菌荚膜多糖、重组蛋白、核酸疫苗抗原提供了行之有效的广谱佐剂。

表3 给予注射途径的抗体效价比较

表4 给予粘膜途径的抗体效价比较

与此同时，SPO1佐剂应用于手足口病、HPV、狂犬病、流脑等抗原时，也能明显地提高机体体液和细胞水平的免疫应答。以铝佐剂和单抗原组做对照，由表2可见，铝佐剂引起的抗体滴度较单抗原高出，而SPO1佐剂相比较铝佐剂引起的抗体效价高5-50倍，且没有明显副作用。

3、基于SPO1佐剂疫苗在人体体内的有效性

以本发明SPO1佐剂(由实施例1方法制备)为例，与流感、病毒性乙肝、甲肝、戊肝、手足口病、HPV、狂犬病、流脑、HIb病原体等不同抗原成分，如灭活全病原体、组分、重组蛋白、核酸抗原与等体积SPO1佐剂0.5ML混匀制备不同类型疫苗，并与铝盐佐剂、没有佐剂做对照，通过皮下或肌肉注射、黏膜途径免疫3～5kg恒河猴动物，间隔21-28天，免疫2次，观察基于SPO1佐剂的疫苗有效性。由表3可见，SPO1佐剂的疫苗均能诱导体液免疫应答及黏膜免疫应答效应，比铝盐佐剂产生的免疫应答效应好，且所产生的黏膜免疫应答效应是铝盐佐剂不具备的，为现有病原体灭活全病毒、裂解组分、重组蛋白、核酸疫苗抗原提供了行之有效的广谱佐剂。

通常在皮下或肌肉注射时，铝佐剂的剂量为0.5mg，最大剂量不超过1.25mg。铝佐剂主要是通过储存库效应和免疫刺激效应激发机体的免疫应答，SPO1佐剂也可通过这两种机制提高机体的抗体效价，更好的促进抗原在机体内表达抗原蛋白，从而激发机体免疫系统产生针对流感病毒编码蛋白的特异性免疫应答反应，并且效果远远好于铝佐剂。而通过粘膜途径免疫，SPO1佐剂也同样能明显提高机体的体液和细胞水平免疫应答。以流感为例，SPO1佐剂与铝佐剂、单抗原的抗体效价比较见表5、6：

表5 给予注射流感疫苗和不同佐剂引起的抗体效价比较

表6 给予滴鼻流感疫苗和不同佐剂引起的抗体效价比较

下述实施例均能实现上述实验例的效果。

具体实施方式

实施例1：新型疫苗佐剂的制备

角鲨烯 5.0g

聚氧乙烯蓖麻油 0.3g

聚醚 0.3g

取原料使用匀浆机制备初乳，匀浆条件为：转速6000rpm，时间4分钟；初乳的粒径为x₁₀＝1612.39nm，x₅₀＝1969.24nm，x₉₀＝2401.49nm，SMD＝1946.88nm，VMD＝1992.92nm；均质初乳：均质条件为压力5000psi，6个循环，测量其粒径为x₁₀＝197.10nm，x₅₀＝240.37nm，x₉₀＝292.69nm，SMD＝237.53nm，VMD＝243.16nm；再次均质，均质条件：压力10000psi，7个循环，测量其粒径为x₁₀＝125.12nm，x₅₀＝155.54nm，x₉₀＝193.14nm，SMD＝153.30nm，VMD＝157.78nm；制备成乳白色的疫苗佐剂制剂后，缓冲液选择去离子水加至100ml，用0.22μm滤器过滤除菌，即得。

实施例2：新型疫苗佐剂的制备

角鲨烯 7.0g

聚氧乙烯蓖麻油 2.0g

聚醚 1.5g

取原料使用匀浆机制备初乳，匀浆条件为：超声波制备初乳，超声7次，45s/次，初乳的粒径为x₁₀＝1623.75nm，x₅₀＝1958.31nm，x₉₀＝2400.35nm，SMD＝1948.22nm，VMD＝1989.54nm；均质初乳：均质条件为压力6000psi，7个循环，测量其粒径为x₁₀＝197.10nm，x₅₀＝240.37nm，x₉₀＝292.69nm，SMD＝237.53nm，VMD＝243.16nm；再次均质，均质条件：压力12000psi，7个循环，测量其粒径为x₁₀＝126.13nm，x₅₀＝156.58nm，x₉₀＝194.15nm，SMD＝154.36nm，VMD＝158.79nm，制备成乳白色的疫苗佐剂制剂后，缓冲液选择生理盐水加至100ml，用0.22μm滤器过滤除菌，即得。

实施例3：新型疫苗佐剂的制备

角鲨烯 3.0g

聚氧乙烯蓖麻油 4.0g

聚醚 3.5g

取原料使用匀浆机制备初乳，匀浆条件为：转速8000rpm，时间3min；初乳的粒径为x₁₀＝1620.79nm，x₅₀＝1968.33nm，x₉₀＝2410.65nm，SMD＝1950.12nm，VMD＝1987.51nm；均质初乳：均质条件为压力7000psi，5个循环，测量其粒径为x₁₀＝193.10nm，x₅₀＝238.55nm，x₉₀＝290.66nm，SMD＝234.53nm，VMD＝240.36nm；再次均质，均质条件：压力14000psi，6个循环，测量其粒径为x₁₀＝123.82nm，x₅₀＝150.54nm，x₉₀＝190.74nm，SMD＝149.30nm，VMD＝157.78nm，制备成乳白色的疫苗佐剂制剂后，选择磷酸盐缓冲液加至100ml，用0.22μm滤器过滤除菌，即得。

实施例4：新型疫苗佐剂的制备

角鲨烯 8.0g

聚氧乙烯蓖麻油 6.0g

聚醚 7.0g

柠檬酸钠缓冲液加至100ml

取上述原料，按照常规工艺制备成疫苗佐剂。

实施例5：新型疫苗佐剂的制备

角鲨烯 2.0g

聚氧乙烯蓖麻油 9.0g

聚醚 8.0g

磷酸盐缓冲液加至100ml

取上述原料，按照常规工艺制备成疫苗佐剂。

实施例6：注射剂的制备

取实施例1制备的疫苗佐剂，与灭活全病原体抗原混匀，按照常规工艺，加入常规辅料，制成注射剂。

实施例7：注射剂的制备

取实施例1制备的疫苗佐剂，与裂解病原提取组分抗原混匀，按照常规工艺，加入常规辅料，制成注射剂。

实施例8：注射剂的制备

取实施例1制备的疫苗佐剂，与荚膜多糖抗原混匀，按照常规工艺，加入常规辅料，制成注射剂。

实施例9：注射剂的制备

取实施例1制备的疫苗佐剂，与多糖结合蛋白抗原混匀，按照常规工艺，加入常规辅料，制成注射剂。

实施例10：注射剂的制备

取实施例1制备的疫苗佐剂，与重组蛋白抗原混匀，按照常规工艺，加入常规辅料，制成注射剂。

实施例11：注射剂的制备

取实施例1制备的疫苗佐剂，与重组VLP抗原混匀，按照常规工艺，加入常规辅料，制成注射剂。

实施例12：注射剂的制备

取实施例1制备的疫苗佐剂，与RNA核酸抗原混匀，按照常规工艺，加入常规辅料，制成注射剂。

实施例13：注射剂的制备

取实施例1制备的疫苗佐剂，与DNA核酸抗原混匀，按照常规工艺，加入常规辅料，制成注射剂。

实施例14：微针矩阵剂的制备

取实施例2制备的疫苗佐剂，与灭活全病原体抗原混匀，按照常规工艺，加入常规辅料，制成微针矩阵剂。

实施例15：微针矩阵剂的制备

取实施例2制备的疫苗佐剂，与裂解病原提取组分抗原混匀，按照常规工艺，加入常规辅料，制成微针矩阵剂。

实施例16：微针矩阵剂的制备

取实施例2制备的疫苗佐剂，与荚膜多糖抗原混匀，按照常规工艺，加入常规辅料，制成微针矩阵剂。

实施例17：微针矩阵剂的制备

取实施例2制备的疫苗佐剂，与多糖结合蛋白抗原混匀，按照常规工艺，加入常规辅料，制成微针矩阵剂。

实施例18：微针矩阵剂的制备

取实施例2制备的疫苗佐剂，与重组蛋白抗原混匀，按照常规工艺，加入常规辅料，制成微针矩阵剂。

实施例19：微针矩阵剂的制备

取实施例2制备的疫苗佐剂，与重组VLP抗原混匀，按照常规工艺，加入常规辅料，制成微针矩阵剂。

实施例20：微针矩阵剂的制备

取实施例2制备的疫苗佐剂，与RNA核酸抗原混匀，按照常规工艺，加入常规辅料，制成微针矩阵剂。

实施例21：微针矩阵剂的制备

取实施例2制备的疫苗佐剂，与DNA核酸抗原混匀，按照常规工艺，加入常规辅料，制成微针矩阵剂。

实施例22：透皮贴剂的制备

取实施例3制备的疫苗佐剂，与灭活全病原体抗原混匀，按照常规工艺，加入常规辅料，制成透皮贴剂。

实施例23：透皮贴剂的制备

取实施例3制备的疫苗佐剂，与裂解病原提取组分抗原混匀，按照常规工艺，加入常规辅料，制成透皮贴剂。

实施例24：透皮贴剂的制备

取实施例3制备的疫苗佐剂，与荚膜多糖抗原混匀，按照常规工艺，加入常规辅料，制成透皮贴剂。

实施例25：透皮贴剂的制备

取实施例3制备的疫苗佐剂，与多糖结合蛋白抗原混匀，按照常规工艺，加入常规辅料，制成透皮贴剂。

实施例26：透皮贴剂的制备

取实施例3制备的疫苗佐剂，与重组蛋白抗原混匀，按照常规工艺，加入常规辅料，制成透皮贴剂。

实施例27：透皮贴剂的制备

取实施例3制备的疫苗佐剂，与重组VLP抗原混匀，按照常规工艺，加入常规辅料，制成透皮贴剂。

实施例28：透皮贴剂的制备

取实施例3制备的疫苗佐剂，与RNA核酸抗原混匀，按照常规工艺，加入常规辅料，制成透皮贴剂。

实施例29：透皮贴剂的制备

取实施例3制备的疫苗佐剂，与DNA核酸抗原混匀，按照常规工艺，加入常规辅料，制成透皮贴剂。

实施例30：喷鼻剂的制备

取实施例4制备的疫苗佐剂，与灭活全病原体抗原混匀，按照常规工艺，加入常规辅料，制成喷雾剂。

实施例31：喷鼻剂的制备

取实施例4制备的疫苗佐剂，与裂解病原提取组分抗原混匀，按照常规工艺，加入常规辅料，制成喷雾剂。

实施例32：喷鼻剂的制备

取实施例4制备的疫苗佐剂，与荚膜多糖抗原混匀，按照常规工艺，加入常规辅料，制成喷雾剂。

实施例33：喷鼻剂的制备

取实施例4制备的疫苗佐剂，与多糖结合蛋白抗原混匀，按照常规工艺，加入常规辅料，制成喷雾剂。

实施例34：喷鼻剂的制备

取实施例4制备的疫苗佐剂，与重组蛋白抗原混匀，按照常规工艺，加入常规辅料，制成喷雾剂。

实施例35：喷鼻剂的制备

取实施例5制备的疫苗佐剂，与重组VLP抗原混匀，按照常规工艺，加入常规辅料，制成喷雾剂。

实施例36：喷鼻剂的制备

取实施例5制备的疫苗佐剂，与RNA核酸抗原混匀，按照常规工艺，加入常规辅料，制成喷雾剂。

实施例37：喷鼻剂的制备

取实施例5制备的疫苗佐剂，与DNA核酸抗原混匀，按照常规工艺，加入常规辅料，制成喷雾剂。

Claims

1.一种疫苗佐剂的制备方法，其特征在于该疫苗佐剂的原料组成为：

角鲨烯 5.0g 聚氧乙烯蓖麻油 0.3g

聚醚 0.3g 缓冲液加至100ml；

该方法包括如下步骤：

取原料使用匀浆机制备初乳，匀浆条件为：转速5000rpm-15000rpm，时间1-10min；或者使用超声波来制备初乳，超声5-10次，45s/次，初乳的粒径为x₁₀=1612.39±10nm，x₅₀=1969.24±10nm，x₉₀=2401.49±10nm，SMD=1946.88±10nm，VMD=1992.92±10nm；均质初乳：均质条件为压力5000-8000psi，5-8个循环，测量其粒径为x₁₀= 197.10±10nm，x₅₀= 240.37±10nm，x₉₀=292.69±10nm，SMD=237.53±10nm，VMD=243.16±10nm，再次均质，均质条件：压力8000-15000psi，5-8个循环，测量其粒径为x₁₀=125.12±10nm，x₅₀ =155.54±10nm，x₉₀=193.14±10nm，SMD=153.30±10nm，VMD=157.78±10nm，制备成乳白色的疫苗佐剂制剂后，缓冲液选择去离子水、生理盐水、磷酸盐缓冲液或柠檬酸钠缓冲液中的一种，采用0.22μm滤器过滤除菌，即得。

2.如权利要求1所述的疫苗佐剂的制备方法，其特征在于其中所述的匀浆条件为：转速6000rpm，时间2-5min，或者用超声波来制备初乳时超声6-8次。