CN101518556B

CN101518556B - 具有抗肿瘤和免疫佐剂作用的多糖及其制备方法和用途

Info

Publication number: CN101518556B
Application number: CN2009100974972A
Authority: CN
Inventors: 孙红祥; 吴远文
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2009-04-07
Filing date: 2009-04-07
Publication date: 2012-06-20
Anticipated expiration: 2029-04-07
Also published as: CN101518556A

Abstract

本发明涉及具有抗肿瘤和免疫佐剂作用的多糖及其制备方法和以该多糖为活性成分的药物组合物，以及它们在治疗肿瘤以及作为疫苗的佐剂中的应用。该多糖是从中草药白藤梨根中提取分离的白藤梨多糖A、白藤梨多糖B、白藤梨多糖C、白藤梨多糖D和包含有这4种多糖的混合物——白藤梨总多糖，具有显著抗肿瘤和免疫佐剂作用。这些多糖可显著抑制小鼠移植性S180肉瘤和H22肝癌的生长；提高荷瘤小鼠脾细胞增殖反应、自然杀伤(NK)细胞和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)活性、脾细胞分泌IL-2和IFN-γ能力以及血清中肿瘤抗原特异性IgG、IgG2a和IgG2b抗体水平；增强卵清蛋白免疫小鼠的体液免疫和细胞免疫应答，诱生机体同时产生Th1型和Th2型免疫应答。这些多糖可作为具有免疫调节作用的抗肿瘤药物和疫苗的免疫佐剂。

Description

具有抗肿瘤和免疫佐剂作用的多糖及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及从中草药白藤梨中提取分离的具有抗肿瘤和免疫佐剂作用的白藤梨多糖A、白藤梨多糖B、白藤梨多糖C、白藤梨多糖D和包含有这4种多糖的白藤梨总多糖，及其制备方法和以该多糖为活性成分的药物组合物，以及它们在治疗肿瘤以及作为疫苗佐剂中的应用。

背景技术

肿瘤是当今世界最大的疑难病症之一，为仅次于心血管疾病的第二大死因，严重威胁人民的生活和健康，给社会和家庭带来巨大的压力。全球抗肿瘤药物约占药物市场总销售额的4.2％，份额虽不高，但年增长率却常年保持在二位数，明显高于其它各类药品市场增长的平均值，显示出临床必需及远未满足临床需求的强劲态势。2006年抗肿瘤药物全球零售额为221.82亿美元，年增长率为13％。我国更是以每年17％的速度增长。随着癌症发病率上升、诊断率提高以及人口增多，临床上对疗效好、毒副反应小的抗肿瘤药物的需求量激增。各国政府、研究机构和制药公司对抗肿瘤药物开发予以高度重视和巨额投资。

外科手术、化疗和放疗是肿瘤治疗的三大手段。外科手术适用于某些局部性肿瘤早期和中期的治疗，但多数病人靠手术治疗是不能防止肿瘤的复发和转移。放、化疗虽然有相当高的治愈率，但常引起如骨髓抑制、免疫低下等毒副反应，使患者难以坚持治疗。各种治疗方法所带来的患者生存质量的下降问题使如何保留机体以及各受累器官的功能从而提高病人的生活质量成为当前受到广泛重视的课题。

过去人们更多地强调根除肿瘤，但在实际中很多时候癌细胞被杀光了，病人也不行了，对病人造成的损害无可挽回。目前，临床上更强调保证病人的生活质量，更注重治疗的整体过程，而并非一味地追求杀灭癌细胞，体现了医学家不只关注药物的疗效，而且更关注对患者生存质量的影响。这与当今中医药治疗肿瘤的“带瘤生存”以及古人之“邪正相安”的治疗原则完全相符。大量的临床实践证明，中医药无论在改善临床症状、提高生存质量、防止复发转移、延长生存期、以及与放化疗配合的增效减毒等方面都有很好的效果。

白藤梨为猕猴桃科植物毛花猕猴桃Actinidia eriantha Benth.的干燥根，广泛分布于浙江、江西、福建、湖南、广西及广东。民间用于治疗胃癌、食道癌、乳腺癌、子宫颈癌和前列腺癌等多种癌症。我们以小鼠移植性S180肉瘤和H22肝癌为模型，环磷酰胺为阳性对照药，研究了白藤梨的抗肿瘤活性成分。通过比较白藤梨水提取物与乙醇提取物，以及水提取物的石油醚、正丁醇、醋酸乙酯三部分萃取物与粗多糖的体内抗肿瘤作用，确定白藤梨的抗肿瘤活性物质主要为多糖。

发明内容

本发明的目的是提供一类具有抗肿瘤和免疫佐剂作用的多糖。

本发明的另一个目的是提供从中草药白藤梨中提取分离多糖的方法。

本发明的进一步目的是提供治疗肿瘤和作为疫苗免疫佐剂的药物组合物。

本发明的还有一个目的是提供上述多糖和组合物在制备治疗肿瘤的药物以及制备预防和治疗人兽传染性疾病和癌症的疫苗制剂方面的用途。

本发明具有抗肿瘤和免疫佐剂作用的多糖包括从中草药白藤梨中提取分离的白藤梨多糖A、白藤梨多糖B、白藤梨多糖C、白藤梨多糖D和包含有这4种多糖的混合物——白藤梨总多糖。白藤梨多糖A相对分子量为1.43×10⁶Da，由鼠李糖、岩藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖按摩尔比为1.00∶6.06∶10.26∶1.26∶3.04∶1.48∶14.38组成；白藤梨多糖B相对分子量为2.06×10⁶Da，由鼠李糖、岩藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖按摩尔比为1.00∶6.06∶10.26∶1.26∶3.04∶1.48∶14.38组成；白藤梨多糖C相对分子量为1.73×10⁶Da，由岩藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖按摩尔比为5.76∶9.95∶1.00∶3.60∶2.77∶14.16组成；白藤梨多糖D相对分子量为1.13×10⁶Da，由岩藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖按摩尔比为5.51∶8.29∶1.00∶3.49∶3.99∶13.59组成。

本发明提供的白藤梨多糖A(AEPA)、白藤梨多糖B(AEPB)、白藤梨多糖C(AEPC)、白藤梨多糖D(AEPD)和包含有这4种多糖的混合物——白藤梨总多糖(AEPS)，是从猕猴桃科植物毛花猕猴桃Actinidia eriantha Benth.的干燥根中提取的，制备方法包括以下步骤：

a.将白藤梨药材粉碎后，以水提取。

b.浓缩水提取液，加入3倍水提取液体积的质量浓度95％乙醇沉淀。收集沉淀依次以乙醇、丙酮和石油醚洗涤后，溶于蒸馏水中，透析，渗余物减压浓缩，冷冻干燥，得白藤梨粗多糖。白藤梨粗多糖溶于0.1mol/L氯化钠，经0.45μm微孔滤膜滤过，滤液以凝胶色谱柱纯化，氯化钠溶液洗脱，收集洗脱液，浓缩，脱盐，冷冻干燥，得白藤梨总多糖。

c.白滕梨总多糖经凝胶色谱柱分离，以0.1～2.0mol/L氯化钠洗脱，收集不同洗脱液，浓缩，脱盐，冷冻干燥，得到4个流份。

d.各流份再经凝胶色谱柱纯化，以氯化钠溶液洗脱，浓缩，脱盐，冷冻干燥，得到白藤梨多糖A、白藤梨多糖B、白藤梨多糖C和白藤梨多糖D。

上述步骤b和c中所说的柱色谱凝胶为DEAE-Sephadex A-25、DEAE-Sephadex A-50、DEAE-Sepharose CL-4B、DEAE-Sepharose CL-6B、DEAE-Cellulose 32和DEAE-Cellulose 52。步骤d中所说的柱色谱凝胶为Sephadex G-100、Sephadex G-150、Sephadex G-200、Sephacryl S-300、SephacrylS-400、Sepharose CL-4B和Sepharose CL-6B。

本发明的药物组合物含有治疗有效量的白藤梨多糖A、白藤梨多糖B、白藤梨多糖C、白藤梨多糖D或白藤梨总多糖为活性成分，以及含有一种或多种药学上可接受的载体。

本发明的多糖和药物组合物可用于制备治疗肿瘤的药物以及制备预防和治疗传染性疾病和癌症的疫苗制剂。

上文所述药学上可接受的载体是指药学领域的药物载体。例如：稀释剂、赋形剂如水、生理盐水、葡萄糖、甘露醇、甘油、乙醇及其混合物等；填充剂如淀粉、蔗糖等；粘合剂如纤维素衍生物、海藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮；湿润剂如甘油；崩解剂如碳酸钙和碳酸氢钠；吸收促进剂如季铵化合物；表面活性剂如吐温-80；润滑剂如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁和聚乙二醇等。另外还可以在组合物中加入其它辅料如香味剂、甜味剂等。

本发明化合物可以组合物形式通过口服、鼻吸入、直肠、肠胃外或经皮给药的方式施用于需要这种治疗的患者或需要接种疫苗的对象。用于口服时，可将其制成常规的固体制剂如片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊剂、丸剂、缓释微丸、固体分散体、包含物等，制成的液体制剂如混悬剂、乳剂、溶胶剂、糖浆剂、合剂、溶液剂等；用于肠胃外给药时，可将其制成注射用的溶液、水或油性混悬剂、乳剂、冻干粉、脂质体、微囊、微球、纳米囊、纳米球等。优先的形式是片剂、包衣片剂、胶囊、微丸、栓剂和注射剂，特别优先特定部位靶向释放的制剂。

本发明药物组合物的各种剂型可以按照药学领域的常规生产方法制备。例如使活性成分与一种或多种载体混合，然后将其制成所需的剂型。

本发明的药物组合物优选含有活性成分占总重量比为0.01％～99.9％。最优选含有活性成分占总重量比为0.5％～95％。

本发明多糖的使用量可根据用药途径、患者年龄、体重、所治疗的肿瘤种类和严重程度等变化，以及根据抗原种类、所需的抗体水平、接种对象的特异性及所需的免疫程序等各种因素，其日剂量可以是0.01μg/kg～100mg/Kg体重，优选0.1～10mg/Kg体重。可以一次或多次使用。

本发明的多糖动物实验结果显示出显著抗肿瘤和免疫佐剂作用，可显著抑制小鼠移植性S180肉瘤和H22肝癌的生长；提高荷瘤小鼠脾细胞增殖反应、自然杀伤(NK)细胞和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)活性、脾细胞分泌IL-2和IFN-γ能力以及血清中肿瘤抗原特异性IgG、IgG2a和IgG2b抗体水平；增强卵清蛋白免疫小鼠的体液免疫和细胞免疫应答，诱生机体同时产生Th1型和Th2型免疫应答。该类多糖的毒性小、安全性好。所以，本发明的多糖有望开发成具有免疫调节作用的抗肿瘤药物和疫苗的免疫佐剂。

附图说明

图1是白藤梨总多糖(AEPS)对荷S180肉瘤小鼠脾细胞增殖反应的影响。^aP＜0.05和^cP＜0.001 vs荷瘤对照组(MC)。

图2是白藤梨总多糖(AEPS)对荷S180肉瘤小鼠自然杀伤(NK)细胞活性的影响。^cP＜0.001 vs荷瘤对照组(MC)。

图3是白藤梨总多糖(AEPS)对荷S180肉瘤小鼠细胞毒性T淋巴细胞(CTL)活性的影响。^bP＜0.01和^cP＜0.001 vs荷瘤对照组(MC)。

图4是白藤梨总多糖(AEPS)对荷S180肉瘤小鼠脾细胞分泌白介素2(IL-2)能力的影响。^aP＜0.05和^bP＜0.01 vs荷瘤对照组(MC)。

图5是白藤梨总多糖(AEPS)对荷S180肉瘤小鼠血清特异性抗体效价的影响。^aP＜0.05和^bP＜0.01 vs荷瘤对照组(MC)。

图6是白藤梨多糖A(AEPA)、白藤梨多糖B(AEPB)、白藤梨多糖C(AEPC)和白藤梨多糖D(AEPD)对荷H22肝癌小鼠脾细胞增殖反应的影响。^aP＜0.05、^bP＜0.01和^cP＜0.001 vs荷瘤对照组(MC)。

图7是白藤梨多糖A(AEPA)、白藤梨多糖B(AEPB)、白藤梨多糖C(AEPC)和白藤梨多糖D(AEPD)对荷H22肝癌小鼠自然杀伤(NK)细胞和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)活性的影响。^aP＜0.05、^bP＜0.01和^cP＜0.001 vs荷瘤对照组(MC)。

图8是白藤梨多糖A(AEPA)、白藤梨多糖B(AEPB)、白藤梨多糖C(AEPC)和白藤梨多糖D(AEPD)对荷H22肝癌小鼠脾细胞分泌IL-2能力的影响。^cP＜0.01vs荷瘤对照组(MC)。

图9是白藤梨多糖A(AEPA)、白藤梨多糖B(AEPB)、白藤梨多糖C(AEPC)和白藤梨多糖D(AEPD)对荷H22肝癌小鼠脾细胞分泌γ-干扰素(IFN-γ)能力的影响。^cP＜0.01 vs荷瘤对照组(MC)。

图10是白藤梨多糖A(AEPA)、白藤梨多糖B(AEPB)、白藤梨多糖C(AEPC)和白藤梨多糖D(AEPD)对荷H22肝癌小鼠血清特异性抗体效价的影响。^aP＜0.05和^bP＜0.01 vs荷瘤对照组(MC)。

图11是白藤梨总多糖(AEPS)对卵清蛋白(OVA)免疫小鼠脾细胞增殖反应的影响。^aP＜0.05、^bP＜0.01和^cP＜0.001 vs OVA对照组。

图12是白藤梨总多糖(AEPS)对卵清蛋白(OVA)免疫小鼠血清特异性IgG1、IgG2a和IgG2b抗体效价的影响。^aP＜0.05、^bP＜0.01和^cP＜0.001 vs OVA对照组。

图13是白藤梨总多糖(AEPS)对卵清蛋白(OVA)免疫小鼠自然杀伤(NK)细胞活性的影响。^bP＜0.01和^cP＜0.001 vs OVA对照组。

图14是白藤梨总多糖(AEPS)对卵清蛋白(OVA)免疫小鼠分泌IL-2和IL-10能力的影响。^cP＜0.001 vs OVA对照组。

图15是白藤梨总多糖(AEPS)对卵清蛋白(OVA)免疫小鼠分泌IFN-γ能力的影响。^cP＜0.001 vs OVA对照组。

具体实施方式

以下通过实例进一步说明本发明。

实施例1：白藤梨多糖制备

制备白藤梨总多糖

药材白藤梨粗粉5kg，以水加热回流提取2小时，滤过，药渣继续以水回加热流提取2次。合并滤液，减压回收至2000ml，加入3倍体积的质量浓度95％乙醇，混匀，4℃静置24小时。收集沉淀，依次以乙醇、丙酮和石油醚洗涤3次。将沉淀溶于蒸馏水中，透析，渗余物减压浓缩，冷冻干燥，得白藤梨粗多糖。白藤梨粗多糖溶于0.1mol/L氯化钠，经0.45μm微孔滤膜滤过，滤液上DEAE-Sephadex A-50凝胶色谱柱纯化，氯化钠溶液洗脱，收集洗脱液，浓缩，脱盐，冷冻干燥，得白藤梨总多糖。白藤梨总多糖主要有鼠李糖、岩藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖组成，摩尔比为1.00∶4.67∶8.45∶1.41∶2.46∶2.43∶11.02。

制备白藤梨多糖A

药材白藤梨粗粉5kg，以水加热回流提取2小时，滤过，药渣继续以水回加热流提取2次。合并滤液，减压回收至2000ml，加入3倍体积的质量浓度95％乙醇，混匀，4℃静置24小时。收集沉淀，依次以乙醇、丙酮和石油醚洗涤3次。将沉淀溶于蒸馏水中，透析，渗余物减压浓缩，冷冻干燥，得白藤梨粗多糖。白藤梨粗多糖溶于0.1mol/L氯化钠，经0.45μm微孔滤膜滤过，滤液上DEAE-Sephadex A-50凝胶色谱柱纯化，氯化钠溶液洗脱，收集洗脱液，浓缩，脱盐，冷冻干燥，得白藤梨总多糖。总多糖以DEAE-Sephadex A-50色谱柱分离，以0.1～2.0mol/L氯化钠洗脱，收集0.2mol/L氯化钠的洗脱液，浓缩，脱盐，冷冻干燥；再经Sephacryl S-400色谱柱纯化，以氯化钠洗脱，浓缩，脱盐，冷冻干燥，得到白藤梨多糖A。白藤梨多糖A相对分子量为1.43×10⁶Da，由鼠李糖、岩藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖组成，摩尔比为1.00∶6.06∶10.26∶1.26∶3.04∶1.48∶14.38。

制备白藤梨多糖B

药材白藤梨粗粉5kg，以水加热回流提取2小时，滤过，药渣继续以水回加热流提取2次。合并滤液，减压回收至2000ml，加入3倍体积的质量浓度95％乙醇，混匀，4℃静置24小时。收集沉淀，依次以乙醇、丙酮和石油醚洗涤3次。将沉淀溶于蒸馏水中，透析，渗余物减压浓缩，冷冻干燥，得白藤梨粗多糖。白藤梨粗多糖溶于0.1mol/L氯化钠，经0.45μm微孔滤膜滤过，滤液上DEAE-Sephadex A-50凝胶色谱柱纯化，氯化钠溶液洗脱，收集洗脱液，浓缩，脱盐，冷冻干燥，得白藤梨总多糖。白藤梨总多糖以DEAE-Sephadex A-50色谱柱分离，以0.1～2.0mol/L氯化钠洗脱，收集0.4mol/L氯化钠的洗脱液，浓缩，脱盐，冷冻干燥；再经Sephacryl S-400色谱柱纯化，以氯化钠洗脱，浓缩，脱盐，冷冻干燥，得到白藤梨多糖B。白藤梨多糖B相对分子量为2.06×10⁶Da，由鼠李糖、岩藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖组成，摩尔比为1.00∶6.06∶10.26∶1.26∶3.04∶1.48∶14.38。

制备白藤梨多糖C

药材白藤梨粗粉5kg，以水加热回流提取2小时，滤过，药渣继续以水回加热流提取2次。合并滤液，减压回收至2000ml，加入3倍体积的质量浓度95％乙醇，混匀，4℃静置24小时。收集沉淀，依次以乙醇、丙酮和石油醚洗涤3次。将沉淀溶于蒸馏水中，透析，渗余物减压浓缩，冷冻干燥，得白藤梨粗多糖。白藤梨粗多糖溶于0.1mol/L氯化钠，经0.45μm微孔滤膜滤过，滤液上DEAE-Sephadex A-50凝胶色谱柱纯化，氯化钠溶液洗脱，收集洗脱液，浓缩，脱盐，冷冻干燥，得白藤梨总多糖。白藤梨总多糖以DEAE-Sephadex A-50色谱柱分离，以0.1～2.0mol/L氯化钠洗脱，收集0.4mol/L氯化钠的洗脱液，浓缩，脱盐，冷冻干燥；再经Sephacryl S-400色谱柱纯化，以氯化钠洗脱，浓缩，脱盐，冷冻干燥，得到白藤梨多糖C。白藤梨多糖C相对分子量为1.73×10⁶Da，由岩藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖组成，摩尔比为5.76∶9.95∶1.00∶3.60∶2.77∶14.16。

制备白藤梨多糖D

药材白藤梨粗粉5kg，以水加热回流提取2小时，滤过，药渣继续以水回加热流提取2次。合并滤液，减压回收至2000ml，加入3倍体积的质量浓度95％乙醇，混匀，4℃静置24小时。收集沉淀，依次以乙醇、丙酮和石油醚洗涤3次。将沉淀溶于蒸馏水中，透析，渗余物减压浓缩，冷冻干燥，得白藤梨粗多糖。白藤梨粗多糖溶于0.1mol/L氯化钠，经0.45μm微孔滤膜滤过，滤液上DEAE-Sephadex A-50凝胶色谱柱纯化，氯化钠溶液洗脱，收集洗脱液，浓缩，脱盐，冷冻干燥，得白藤梨总多糖。白藤梨总多糖以DEAE-Sephadex A-50色谱柱分离，以0.1～2.0mol/L氯化钠洗脱，收集0.4mol/L氯化钠的洗脱液，浓缩，脱盐，冷冻干燥；再经Sephacryl S-400色谱柱纯化，以氯化钠洗脱，浓缩，脱盐，冷冻干燥，得到白藤梨多糖D。白藤梨多糖D相对分子量为1.13×10⁶Da，由岩藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖组成，摩尔比为5.51∶8.29∶1.00∶3.49∶3.99∶13.59。

实施例2：白藤梨总多糖的体内抗肿瘤作用

取清洁级ICR小鼠50只，每鼠右腋皮下常规接种小鼠肉瘤S₁₈₀细胞悬液0.2ml。接种24h后，称重，随机分组，每组10只。设为荷瘤对照组、环磷酰胺(CTX)阳性对照组、白藤梨总多糖(AEPS)低、中、高剂量试验组。荷瘤对照组每日按0.2ml/10g经口灌服生理盐水，连续10天；阳性对照组按20mg/kg剂量腹腔注射CTX，隔日一次，共5次；白藤梨总多糖低、中、高剂量组按2.5mg/kg、5mg/kg和10mg/kg剂量灌胃给药，每天一次，连续10次。于第11天处死动物，取出肿瘤组织，称重，计算抑瘤率。

表1白藤梨总多糖口服给药对小鼠S180肉瘤的抑瘤作用

^aP＜0.05和^cP＜0.001 vs荷瘤对照组(MC)。

结果表明：白藤梨总多糖对小鼠S₁₈₀肉瘤具有较好的治疗作用。灌胃给以白藤梨总多糖2.5mg/kg、5mg/kg和10mg/kg对小鼠S₁₈₀肉瘤的抑瘤率分别为47.81％、50.11％和55.34％(表1)。说明白藤梨总多糖具有显著的体内抗肿瘤作用。

实施例3：白藤梨总多糖对荷瘤小鼠免疫功能的影响

取清洁级ICR小鼠60只，除正常对照组10只小鼠外，其余每鼠右腋皮下常规接种小鼠肉瘤S₁₈₀细胞悬液0.2ml。接种24h后，称重，随机分组，每组10只。设为正常对照组、荷瘤对照组、环磷酰胺(CTX)阳性对照组、白藤梨总多糖(AEPS)低、中、高剂量试验组。正常对照组和荷瘤对照组每日按0.2ml/10g经口灌服生理盐水，连续10天；阳性对照组按20mg/kg剂量腹腔注射CTX，隔日一次，共5次；白藤梨总多糖低、中、高剂量组按2.5mg/kg、5mg/kg和10mg/kg剂量灌胃给药，每天一次，连续10次。于第11天处死动物，取脾脏，制备脾细胞悬液；取血，分离制备血清。采用MTT法和ELISA法检测AEPS低、中、高3个剂量口服给药对荷S₁₈₀肉瘤小鼠的脾细胞增殖反应、NK细胞和CTL活性、脾细胞分泌IL-2能力、以及血清中肿瘤抗原特异性IgG、IgG2a和IgG2b抗体水平的影响。

结果表明：AEPS不仅能显著增强荷S₁₈₀肉瘤小鼠T、B淋巴细胞的增殖能力、NK细胞和CTL的杀伤活性以及脾细胞分泌IL-2的能力，而且也能显著提高荷瘤小鼠血清肿瘤抗原特异性IgG、IgG2a和IgG2b抗体水平(图1～5)。这些结果说明AEPS具有促进荷瘤小鼠体液免疫和细胞免疫功能的作用，其可通过增强荷瘤小鼠免疫功能发挥抗肿瘤作用。

实施例4：白藤梨多糖A、白藤梨多糖B、白藤梨多糖C和白藤梨多糖D的体内抗肿瘤作用

取清洁级ICR小鼠60只，每鼠右腋皮下常规接种小鼠肝癌H22细胞悬液0.2ml。接种24h后，称重，随机分组，每组10只。设为荷瘤对照组、环磷酰胺(CTX)阳性对照组、白藤梨多糖A(AEPA)试验组、白藤梨多糖B(AEPB)试验组、白藤梨多糖C(AEPC)试验组和白藤梨多糖D(AEPD)试验组。荷瘤对照组每日按0.2ml/10g经口灌服生理盐水，连续10天；阳性对照组按40mg/kg剂量腹腔注射CTX，隔日一次，共2次；白藤梨多糖A(AEPA)、白藤梨多糖B(AEPB)、白藤梨多糖C(AEPC)和白藤梨多糖D(AEPD)试验组按10mg/kg剂量灌胃给药，每天一次，连续10次。于第11天处死动物，取出肿瘤组织，称重，计算抑瘤率。

表2白藤梨多糖A、白藤梨多糖B、白藤梨多糖C和白藤梨多糖D对小鼠移植性H22肝癌的抑制作用

^aP＜0.05和^cP＜0.001 vs荷瘤对照组(MC)。

结果表明：白藤梨多糖A、白藤梨多糖B、白藤梨多糖C和白藤梨多糖D对小鼠H22肝癌具有较好的治疗作用。按10mg/kg剂量灌胃给以白藤梨多糖A、白藤梨多糖B、白藤梨多糖C和白藤梨多糖D对小鼠H22肝癌的抑瘤率分别为48.75％、47.11％、56.67％和54.05％(表2)。说明白藤梨多糖A、白藤梨多糖B、白藤梨多糖C和白藤梨多糖D具有显著的体内抗肿瘤作用。

实施例5：白藤梨多糖A、白藤梨多糖B、白藤梨多糖C和白藤梨多糖D对荷瘤小鼠免疫功能的影响

取清洁级ICR小鼠70只，除正常对照组10只小鼠外，其余每鼠右腋皮下常规接种小鼠H22肝癌细胞悬液0.2ml。接种24h后，称重，随机分组，每组10只。设为正常对照组、荷瘤对照组、环磷酰胺(CTX)阳性对照组、白藤梨多糖A(AEPA)试验组、白藤梨多糖B(AEPB)试验组、白藤梨多糖C(AEPC)试验组和白藤梨多糖D(AEPD)试验组。正常对照组和荷瘤对照组每日按0.2ml/10g经口灌服生理盐水，连续10天；阳性对照组按20mg/kg剂量腹腔注射CTX，隔日一次，共5次；阳性对照组按40mg/kg剂量腹腔注射CTX，隔日一次，共2次；白藤梨多糖A(AEPA)、白藤梨多糖B(AEPB)、白藤梨多糖C(AEPC)和白藤梨多糖D(AEPD)试验组按10mg/kg剂量灌胃给药，每天一次，连续10次。于第11天处死动物，取脾脏，制备脾细胞悬液；取血，分离制备血清。采用MTT法和ELISA法检测白藤梨多糖A、白藤梨多糖B、白藤梨多糖C和白藤梨多糖D口服给药对荷H22肝癌小鼠脾细胞增殖反应、NK细胞和CTL活性、脾细胞分泌IL-2和IFN-γ能力以及血清中肿瘤抗原特异性IgG、IgG2a和IgG2b抗体水平的影响。

结果表明：白藤梨多糖A、白藤梨多糖B、白藤梨多糖C和白藤梨多糖D不仅能显著增强荷H22肝癌小鼠的T、B淋巴细胞增殖能力、NK细胞和CTL的杀伤活性，以及脾细胞分泌IL-2和IFN-γ的能力，而且也能显著提高荷瘤小鼠血清中肿瘤抗原特异性IgG、IgG2a和IgG2b抗体水平(图6～10)，证实白藤梨多糖A、白藤梨多糖B、白藤梨多糖C和白藤梨多糖D均具有促进荷瘤小鼠体液免疫和细胞免疫功能的作用，4个多糖可通过增强荷瘤小鼠免疫功能发挥抗肿瘤作用。

实施例6：白藤梨总多糖的免疫佐剂作用

清洁级ICR小鼠随机分组，每组5只。生理盐水对照组：每只皮下注射生理盐水0.2ml；卵清蛋白(OVA)对照组：每只皮下注射OVA溶液(0.5mg/m1)0.2ml；氢氧化铝对照组：每只皮下注射0.2ml含200μg氢氧化铝的OVA溶液(0.5mg/ml)；白藤梨总多糖试验组：每只注射0.2ml含白藤梨总多糖(25、50、100μg)的OVA溶液(0.5mg/ml)。各组免疫2次，第一次免疫和第二次免疫间隔14天。二免后14天处死动物，取脾脏，制备脾细胞悬液；取血，分离制备血清。采用MTT法、ELISA法和RT-PCR检测OVA免疫小鼠脾细胞增殖反应、NK细胞和CTL活性、细胞因子分泌能力、细胞因子和转录因子mRNA表达水平以及血清中特异性抗体效价。

表3白藤梨总多糖(AEPS)对卵清蛋白(OVA)免疫小鼠脾细胞细胞因子和转录因子mRNA表达的影响

^aP＜0.05、^bP＜0.01和^cP＜0.001 vs OVA对照组。

结果表明：AEPS能显著增强ConA、LPS和OVA诱导的OVA受免小鼠淋巴细胞增殖反应；提高免疫小鼠血清中OVA特异性IgG、IgG1、IgG2a和IgG2b抗体效价；促进免疫小鼠脾细胞分泌IL-2、IL-10和IFN-γ的能力；增强免疫小鼠NK细胞对K562细胞的杀伤活性(图11～15)；上调IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ等细胞因子及T-bet和GATA-3等转录因子的mRNA表达(表3)。说明AEPS不仅能促进免疫小鼠对OVA的体液免疫和细胞免疫应答，而且可诱导平衡的Th1/Th2免疫应答。

综上所述，本发明的多糖具有显著抗肿瘤和免疫佐剂，有望开发成具有免疫调节作用的抗肿瘤药物和疫苗的免疫佐剂。

Claims

1.具有抗肿瘤和免疫佐剂作用的多糖，其特征在于它是从中草药白藤梨根中提取分离的白藤梨多糖A、白藤梨多糖B、白藤梨多糖C和白藤梨多糖D，白藤梨多糖A相对分子量为1.43×10⁶Da，由鼠李糖、岩藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖按摩尔比为1.00∶6.06∶10.26∶1.26∶3.04∶1.48∶14.38组成；白藤梨多糖B相对分子量为2.06×10⁶Da，由鼠李糖、岩藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖按摩尔比为1.00∶6.06∶10.26∶1.26∶3.04∶1.48∶14.38组成；白藤梨多糖C相对分子量为1.73×10⁶Da，由岩藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖按摩尔比为5.76∶9.95∶1.00∶3.60∶2.77∶14.16组成；白藤梨多糖D相对分子量为1.13×10⁶Da，由岩藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖按摩尔比为5.51∶8.29∶1.00∶3.49∶3.99∶13.59组成。

2.权利要求1所述的具有抗肿瘤和免疫佐剂作用的多糖的制备方法，其具体步骤如下：

a.将白藤梨药材粉碎后，以水提取；

b.浓缩水提取液，加入3倍水提取液体积的质量浓度95％乙醇沉淀，收集沉淀依次以乙醇、丙酮和石油醚洗涤后，溶于蒸馏水中，透析，渗余物减压浓缩，冷冻干燥，得白藤梨粗多糖，白藤梨粗多糖溶于0.1mol/L氯化钠，经0.45μm微孔滤膜滤过，滤液以凝胶色谱柱纯化，氯化钠溶液洗脱，收集洗脱液，浓缩，脱盐，冷冻干燥，得白藤梨总多糖；

c.白滕梨总多糖经凝胶色谱柱分离，以0.1～2.0mol/L氯化钠洗脱，收集不同洗脱液，浓缩，脱盐，冷冻干燥，得到4个流份；

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征是步骤b和c中所说的柱色谱凝胶为DEAE-Sephadex A-50。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征是步骤d中所说的柱色谱凝胶为Sephacryl S-400。

5.用于治疗肿瘤和作为疫苗佐剂的药物组合物，其中含有治疗有效量的权利要求1所述的白藤梨多糖A、白藤梨多糖B、白藤梨多糖C或白藤梨多糖D和药物学上可接受的载体。

6.根据权利要求5所述的药物组合物，其特征在于白藤梨多糖A、白藤梨多糖B、白藤梨多糖C或白藤梨多糖D的有效量为0.01μg/kg～100mg/kg体重。

7.根据权利要求1的多糖在制备治疗肿瘤的药物中的应用。

8.根据权利要求1的多糖在制备预防和治疗传染性疾病和癌症的疫苗制剂中的应用。