CN101829138B - 一种用于增强人体内免疫调节功能的组合物与它们的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于增强人体内免疫调节功能的组合物及其用途。本发明组合物是由有效组分竹节参皂苷与竹节参多糖或所述有效组分与在保健药品、保健食品、保健茶、保健酒或饮料上可接受的载体组成的,本发明组合物具备改善免疫低下小鼠免疫功能的作用。本发明的组合物在环磷酰胺(Cy)导致的免疫功能低下的动物模型中,可提高免疫低下小鼠的脾脏指数;提高CD4+、CD8+,B淋巴细胞及NK细胞比例;增加细胞因子IL-2和IFN-γ含量。该组合物提高了竹节参的药物效果和药用价值,由此可促进药材种植和药物研发,有较好的社会效益和经济效益。
Description
【技术领域】
本发明属于一种药物技术领域,更具体地,本发明涉及一种用于增强人体内免疫调节功能的组合物,还涉及所述组合物的用途。
【背景技术】
随着现代社会不断发展进步,人们的生活节奏日益加快、工作压力越来越大,加之工业生产对环境的破坏,使得人类免疫系统功能降低,亚健康状态日趋严重,它常以疲劳、失眠、胃口差、情绪不稳定等为主症,处于亚健康状态的人群约占整个人群的25%-28%。从临床检测来看,这个人群体集中地表现出三高一低倾向,即存在着接近临界水平的高血脂、高血糖、高血粘度和免疫功能偏低。而现代医学、细胞生物学及分子生物学的发展使人们认识到免疫系统的紊乱不仅会产生多种疾病,而且与人体衰老与老年人发病有关。艾滋病的危害更使人们对免疫缺损的严重后果有了更深刻的认识。其中,机体免疫状态失常更是肿瘤发生与发展的重要因素,免疫功能抑制或紊乱,使肿瘤细胞能够逃避机体免疫系统对其的杀伤作用。对于肿瘤传统的治疗方法一般都是应用化疗及放疗将肿瘤组织及细胞杀灭,但在化疗和放疗的同时会不可避免地造成机体免疫功能的抑制,使肿瘤病人的生活质量明显下降。
因此,目前迫切需要一种能够增强人体体内免疫调节功能的药物,改进人们的身体健康状况,增强人体抵抗力,消除一些与免疫功能低下相关的疾病。
竹节参(rhizoma Panax japonicus)又名竹节三七、竹节人参、白三七等,系五加科人参属植物,竹节参干燥呈竹鞭状根茎,是我国西南地区土家族、苗族民族聚居区民间常用中草药,为1977年以后各版《中国药典》所收载。其性甘、微苦,温,归肝、脾、肺经,功能滋补强壮、活血散瘀、消肿止痛,临床上主要用于病后虚弱,劳嗽咯血,咳嗽痰多,跌扑损伤等症。竹节参的主要活性成分是竹节参皂苷(chikusetsusaponin)、人参皂苷(ginsenoside)和多糖(polysaccharides)等。此外,还分离出少量的挥发油、含氮化合物、无机元素、维生素c、丁二酸等。
刘桂林等人在《第八届全国中药和天然药物学术研讨会与第五届全国药用植物和植物药学学术研讨会论文集》,2005年中公开了采用正交实验法优选竹节参的提取工艺,优选的提取工艺为8倍量60%乙醇回流提取回流2次,每次1.5小时。人参皂苷Rg1在0.5760-1.418μg范围内线性关系良好,r=0.9997(n=5),平均回收率为97.7%,RSD=2.94%(n=9)。结论优选后的提取工艺可用于鄂产竹节参人参皂苷Rg1的提取。
黄志萍等人在CN101265301A与CN101265302A公开了一种竹节参多糖的制备方法,并发现其在体外能促进淋巴细胞增殖。
本发明人经过大量试验研究,发现并制备了一种用于增强人体内免疫调节功能的组合物,它是由有效组分或有效组分与在保健药品、保健食品、保健茶、保健酒或饮料上可接受的载体组成的,在此基础上完成了本发明。
【发明内容】
[要解决的技术问题]
本发明的目的是提供一种用于增强人体内免疫调节功能的组合物。
本发明的另一个目的是提供所述组合物的用途。
[技术方案]
本发明是通过下述技术方案实现的。
本发明涉及一种用于增强人体内免疫调节功能的组合物。所述的组合物是由有效组分或有效组分与在保健药品、保健食品、保健茶、保健酒或饮料上可接受的载体组成的,其特征在于所述的有效组分是,以重量份计:
竹节参皂苷200-400份
竹节参多糖125-250份
所述的有效组分竹节参皂苷是采用下述方法制备得到的:
称取竹节参粉10重量份,按照竹节参粉与乙醇水溶液重量体积比为10-14添加50-70体积%乙醇水溶液,浸泡1-3小时,然后进行加热回流提取1-3小时,这样加热回流提3-5次,提取液合并,滤过,得到粗竹节参皂苷提取液;
然后,得到的提取液在减压下去除溶剂,直到无醇味,其残留物加水稀释后进行离心分离,得到的上清液再按照所述上清液与正丁醇的体积比1∶1使用正丁醇进行萃取,得到的萃取液再减压蒸去正丁醇,得到粗竹节参皂苷;
以所述的粗竹节参皂苷重量计使用1-2倍的80-90体积%乙醇水溶液进行溶解,再加入4-5倍的丙酮,静置4-6小时,然后离心分离,收集沉淀物,用丙酮洗涤,再在60-80℃下进行干燥1-2小时,得到所述的竹节参皂苷;
所述的有效组分竹节参多糖是采用下述方法制备得到的:
称取竹节参粉10重量份,然后加入80-120重量份水,在室温下进行提1-3小时,提取完后进行过滤,这个提取过程重复进行2-4次,得到的滤液合并,再减压浓缩至所述合并滤液体积的1/4至1/6,得到浓缩提取液;
然后,往所述的浓缩提取液中添加90-100体积%乙醇水溶液,使所述浓缩提取液中最终乙醇浓度达到50-体积重量%,在室温下进行醇沉过夜,然后进行过滤分离得到竹节参多糖溶液,再经真空喷雾干燥得到所述的竹节参多糖。
优选地,在本发明的组合物中所述的有效组分是,以重量份计:
竹节参皂苷250-380份
竹节参多糖160-220份。
更优选地,所述的有效组分是,以重量份计:
竹节参皂苷280-350份
竹节参多糖180-200份。
根据本发明的一种优选实施方式,所述的竹节参粉粒度是20-40目。
根据本发明的另一种优选实施方式,在制备竹节参皂苷时,按照竹节参粉与乙醇水溶液重量体积比为12,添加60体积%乙醇水溶液,浸泡2小时,然后进行加热回流提取2小时,这样加热回流提取4次。
根据本发明的另一种优选实施方式,得到的粗竹节参皂苷以所述的粗竹节参皂苷重量计使用1倍的85体积%乙醇水溶液进行溶解,再加入4倍的丙酮,静置5小时,然后离心分离,收集沉淀物,用丙酮洗涤,再在70℃下进行干燥1.5小时,得到所述的竹节参皂苷。
根据本发明的另一种优选实施方式,在制备竹节多糖时,称取竹节参粉10重量份,加入100重量份水,在室温下进行提取2小时,这个提取过程重复进行3次,合并滤液,再减压浓缩至所述合并滤液体积的1/5;
往得到的浓缩提取液中添加95体积%乙醇水溶液,使所述浓缩提取液中最终乙醇浓度达到60体积%。
根据本发明的另一种优选实施方式,所述的减压是压力为0.01-0.10MPa。
在本发明中,所述的组合物是散剂、片剂、胶囊、颗粒剂、口服液和注射剂。
本发明还涉及所述的组合物在制备用于增强人体内免疫调节功能的药物、保健药品、保健茶、保健食品、保健酒、饮料等中的用途。
下面将更详细地描述本发明。
本发明涉及一种用于增强人体内免疫调节功能的组合物。所述的组合物是由有效组分或有效组分与在保健药品、保健食品、保健茶、保健酒或饮料上可接受的载体组成的,其特征在于所述的有效组分是,以重量份计:
竹节参皂苷200-400份
竹节参多糖125-250份。
大量研究工作表明,竹节参的主要活性成分是竹节参皂苷(chikusetsusaponin)、人参皂苷(ginsenoside)、竹节参多糖(tochhibanan)及挥发油部分β檀香萜烯(βsantalene)等,还含有多种水溶性氨基酸,其中包括8种人体必需氨基酸。采用本发明的方法主要提取竹节参中的竹节参皂苷和竹节人参多糖,以竹节参皂苷和竹节参多糖作为主要活性成分。
一、所述的有效组分竹节参皂苷可以采用下述方法制备得到:
A、称取竹节参粉10重量份,按照竹节参粉与乙醇水溶液重量体积比为10-14添加50-70体积%乙醇水溶液,浸泡1-3小时,然后进行加热回流提取1-3小时,这样加热回流提取3-5次,提取液合并,滤过,得到粗竹节参皂苷提取液。
优选地,可以按照竹节参粉与乙醇水溶液重量体积比为12,往竹节参粉中添加60体积%乙醇水溶液,浸泡2小时,然后进行加热回流提取2小时,这样加热回流提取4次。
所述的竹节参例如可以是目前我国市场上销售的竹节参中药材,例如选自湖北省恩施州宣恩椿木营竹节参种植基地种植的竹节参,它为五加科植物竹节参Panax japonicus C.A.Meyer的根茎。
然后,使用在本技术领域中通常使用的超声波清洗器进行清洗,除去泥沙,例如使用昆山市超声仪器有限公司生产的KQ-250B型超声波清洗器进行清洗。清洗后的竹节参再使用在本技术领域中通常使用的真空干燥箱进行干燥,例如像德国MMM公司生产的真空干燥箱进行干燥。然后,使用在药材加工中通常使用的粉碎机对干燥竹节参的进行粉碎,粉碎的竹节参再用标准筛进行筛分,收集20-40目的竹节参粉。
得到的竹节参粉与所述乙醇水溶液进行浸泡后,使用在本技术领域中通常使用的提取器进行加热回流提取,例如使用上海宏兴机械仪器实业制造公司生产的电子恒温不锈钢水浴锅与海洪纪仪器设备有限公司提供的SXT-06型索氏提取器进行加热回流提取。
B、得到的提取液在减压下蒸去溶剂,直到无醇味,其残留物加水稀释后进行离心分离,得到的上清液再按照所述上清液与正丁醇的体积比1∶1使用正丁醇进行萃取,得到的萃取液再减压蒸去正丁醇,得到粗竹节参皂苷。
得到的提取液可以使用在本技术领域中通常使用的减压蒸发设备蒸去溶剂,例如使用上海亚荣生化仪器厂生产的旋转蒸发器RE-52AA在压力0.01-0.10MPa进行减压蒸发,除去乙醇溶剂。使用同样的设备将所得到萃取液中的正丁醇蒸去。在这个步骤中进行离心分离使用的设备是在本技术领域中通常使用的设备,例如德国SIGMA离心机。
C、得到的粗竹节参皂苷以所述的粗竹节参皂苷重量计使用1-2倍的80-90体积%乙醇水溶液进行溶解,再加入45倍的丙酮,静置46小时,然后离心分离,收集沉淀物,用丙酮洗涤,再在60-80℃下进行干燥12小时,得到所述的竹节参皂苷。
优选地,得到的粗竹节参皂苷以所述的粗竹节参皂苷重量计使用1倍的85体积%乙醇水溶液进行溶解,再加入4倍的丙酮,静置5小时,然后离心分离,收集沉淀物,用丙酮洗涤,再在70℃下进行干燥1.5小时,得到所述的竹节参皂苷。
在这个步骤中,进行离心、干燥操作所使用的设备与上述设备相同。
二、所述的有效组分竹节参多糖是采用下述方法制备得到的:
A、称取竹节参粉10重量份,然后加入80-120重量份水,在室温下进行提取13小时,提取完后进行过滤,这个提取过程重复进行24次,得到的滤液合并,再减压浓缩至所述合并滤液体积的1/4至1/6,得到浓缩提取液。
优选地,在制备竹节多糖时,称取竹节参粉10重量份,加入100重量份水,在室温下进行提取2小时,这个提取过程重复进行3次,合并滤液,再减压浓缩至所述合并滤液体积的1/5。
使用的竹节参粉是采用与前面描述的相同方法得到的。
在这个步骤中,进行提取、减压浓缩操作所使用的设备与上述设备相同。
B、然后,往所述的浓缩提取液中添加90-100体积%乙醇水溶液,使所述浓缩提取液中最终乙醇浓度达到50-70体积%,在室温下进行醇沉过夜,然后进行过滤分离得到竹节参多糖溶液,再经真空喷雾干燥得到所述的竹节参多糖。
在本发明的意义上,醇沉就是利用有效组分能溶于乙醇而杂质不溶于乙醇的特性,在加入乙醇后,有效组分转溶于乙醇中而杂质则被沉淀出来。醇沉的目的是为了除去杂质保留药物有效组分,因而醇沉操作应该是十分重要的。
优选地,往得到的浓缩提取液中添加95体积%乙醇水溶液,使所述浓缩提取液中最终乙醇浓度达到60体积%,在室温下进行醇沉过夜。
所述的真空喷雾干燥可以使用在本技术领域中通常使用的真空喷雾干燥设备进行干燥,例如使用像上海世远生物设备工程有限公司提供的SY-6000小型喷雾干燥仪进行干燥。
在本发明中,竹节参及其提取物的总皂苷测定方法如下:
样品溶液及标准样品溶液的制备
样品溶液的制备:精确称取20-40目竹节参药材粉末1.0g,置索氏提取器中,加200mL乙醚,加热回流1h,弃去乙醚液,药渣挥去乙醚,置于索氏提取器中,再加200mL甲醇,加热提取至甲醇无色,取出甲醇提取液,让其挥发至干,其残渣用30mL蒸馏水分多次转移至分液漏斗中,用蒸馏水饱和的正丁醇振摇提取5次,每次20mL,合并正丁醇提取液,再用正丁醇饱和的蒸馏水洗涤2次,每次30mL,合并正丁醇提取液,蒸干,得到的残渣加甲醇溶解并转移至25mL量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,得到样品溶液。
标准样品溶液的制备:精确称取人参皂苷Re标准样品适量,置10mL量瓶中,用甲醇溶解制成每1mL含1.30mg的标准样品溶液。
线性关系的考察:
分别精密吸取人参皂苷Re标准样品溶液30、50、70、90、110、130μL,置于10mL具塞试管中,用水浴使溶剂挥发,分别精确加入0.2mL新配制的5%香草醛-冰乙酸溶液,0.8mL高氯酸溶液,加塞,摇匀,于60℃水浴加热15min,取出,置冰水中冷却3min,分别精确加入5mL冰醋酸,摇匀,随行试剂作空白,于552nm处测定吸光度,以吸光度(A)对人参皂苷Re质量浓度(C,μg·mL-1)进行线性回归,得回归方程:A=0.0194C-0.0059,r=0.9997,该结果表明人参皂苷Re在6.50μg·mL-1~28.17μg·mL-1浓度范围内线性关系良好。标准曲线见附图1。
如前面所述制备样品溶液,精密吸取40μL该样品溶液,按标准曲线制备方法操作,于552nm处测定吸光度。由标准曲线给出样品溶液相当于人参皂苷Re标准样品溶液的浓度,根据回归方程,计算样品中总皂苷的含量。
在本发明中,竹节参及其提取物的多糖测定方法如下:
5%苯酚的配制:
称取苯酚100g,加0.1g铝片和0.05g碳酸氢钠,进行常压蒸馏,收集180±2℃馏分。精确称取约10.0g该馏分,置于200mL量瓶中,加水溶解并稀释至刻度,摇匀后转置于棕色试剂瓶中,4℃保存备用。
葡萄糖对照溶液的配制:
精确称取50mg减压真空干燥至恒重的葡萄糖,溶于在50mL容量瓶中的蒸馏水中,精确移取1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0mL,加到25mL容量瓶中,用蒸馏水稀释至刻度,摇匀,得到一组葡萄糖对照溶液。
竹节参多糖测试液的制备:
精确称取1g 20-40目竹节参粉末,置圆底烧瓶中,加入50mL 80重量%乙醇水溶液,加热回流3次,每次2h,弃滤液,沉淀进行挥发至干,加50mL蒸馏水,称重,静置1h,加热回流2h,放冷,称重,用蒸馏水补足重量,摇匀,滤过,滤液备用。
竹节参多糖最大吸收波长的选择:
吸取葡萄糖标准溶液、竹节参多糖测试液各1mL至具塞试管中,加入2.0mL苯酚,迅速加入7.0mL浓硫酸,混匀,置40℃水浴中30min,在冰浴中冷却10min。以试剂空白为参比,在200~1100nm波长范围进行扫描,确定最大吸收波长为478nm。扫描结果见附图2。
标准曲线的绘制:
精确量取葡萄糖与测试溶液各1mL,测定吸光度,得到在每1mL含葡萄糖40~160μg范围内葡萄糖量与吸收度呈良好的线性关系,回归方程为A=0.0051X-0.0341,r=0.9953。根据回归方程,计算样品中竹节参多糖的含量。
在本发明中,在保健药品、保健食品、保健茶、保健酒或饮料上可接受的载体应该理解是指在药学、食品、酒或饮料技术领域中通常使用的载体,例如像稀释剂、赋形剂和水等,填充剂,例如淀粉、蔗糖,乳糖、微晶纤维素等;粘合剂,例如纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮;润湿剂,例如甘油;崩解剂,例如羧甲基淀粉钠、羟丙纤维素、交联羧甲基纤维素、琼脂、碳酸钙或碳酸氢钠;吸收促进剂,例如季铵化合物;表面活性剂,例如十六烷醇、十二烷基硫酸钠;吸附载体,例如高龄土和皂粘土;润滑剂,例如滑石粉、硬脂酸钙和硬脂酸镁、聚乙二醇等。另外还可以在组合物中加入其它辅剂如香味剂、甜味剂等。
在本发明中,所述组合物的剂型是散剂、片剂、胶囊、颗粒剂、口服液和注射剂。
优选地,在本发明的组合物中所述的有效组分是,以重量份计:
竹节参皂苷250-380份
竹节参多糖160-220份。
更优选地,所述的有效组分是,以重量份计:
竹节参皂苷280-350份
竹节参多糖180-200份。
本发明还涉及所述的组合物在制备用于增强人体内免疫调节功能的保健药品、保健食品、保健茶、保健酒或饮料中的用途。
在本发明中,应该注意到,使用作为保健药品的本发明组合物的剂量需要由医生根据病人的体重、身体状况与疾病严重程度进行确定。但每个病人一般使用剂量是每个病人每天每千克体重100-400mg/天.kg。
本发明的组合物可以通过口服或肠胃外给药的方式为需要这种治疗的患者给药。采用口服方式给药时,可将本发明的组合物制成常规的固体制剂,例如片剂、胶囊、粉剂、颗粒剂等,制成液体制剂,例如水或油悬浮剂,其它液体制剂,例如糖浆、口服液等;用于肠胃外给药时,可将其制成注射用的溶液、粉针、水或油性悬浮剂等。
在制备用于增强人体内免疫调节功能的保健食品、保健茶、保健酒或饮料时,可以在制作保健食品、保健茶、保健酒或饮料的过程中,将本发明的组合物作为一种添加剂加到其制作原料中,或者在饮茶、酒或饮料时把本发明的组合物加到茶、酒或饮料中,这时每个人一般使用剂量是每个人每天每千克体重50-100mg/天.kg。
[有益效果]
本发明含有竹节参皂苷和多糖的组合物能明显改善环磷酰胺引起免疫低下小鼠的脾萎缩,显著提高脾脏指数,提高CD4+、CD8+,B淋巴细胞及NK细胞比例;增加细胞因子IL-2和IFN-γ含量;并且本发明组合物的效果非常明显地优于单一活性成分竹节参皂苷或单一活性成分竹节参多糖的效果。该组合物可以大大提高竹节参的药物效果和药用价值。
【附图说明】
图1是竹节参皂苷标准曲线。
图2是多糖吸收曲线
样品1为葡萄糖标准品,样品2为测试样品。
【具体实施方式】
实施例1:本发明颗粒剂的制备
制备所述的有效组分竹节参皂苷:
选用湖北省恩施州宣恩椿木营竹节参种植基地种植的竹节参,使用昆山市超声仪器有限公司生产的KQ-250B型超声波清洗器进行清洗,清洗后的竹节参再使用德国MMM公司生产的真空干燥箱进行干燥,然后进行粉碎,用标准筛进行筛分,收集20-40目的竹节参粉。称取竹节参粉10重量份,按照竹节参粉与乙醇水溶液重量体积比为12添加60体积%乙醇水溶液,浸泡2小时,然后使用上海宏兴机械仪器实业制造公司生产的电子恒温不锈钢水浴锅与海洪纪仪器设备有限公司提供的SXT-06型索氏提取器进行加热回流提取2小时,这样加热回流提取4次,提取液合并,滤过,得到粗竹节参皂苷提取液。
得到的提取液使用上海亚荣生化仪器厂生产的旋转蒸发器RE-52AA在压力0.05MPa进行减压蒸发,除去乙醇溶剂,其残留物加水稀释后使用北德国SIGMA离心机进行离心分离,得到的上清液再按照所述上清液与正丁醇的体积比1∶1使用正丁醇进行萃取,得到的萃取液再使用旋转蒸发器RE-52AA减压蒸去正丁醇,得到粗竹节参皂苷。
得到的粗竹节参皂苷以所述的粗竹节参皂苷重量计使用1倍的85体积%乙醇水溶液进行溶解,再加入4倍的丙酮,静置5小时,然后离心分离,收集沉淀物,用丙酮洗涤,再在70℃下进行干燥1.5小时,得到所述的竹节参皂苷。
采用本发明说明书中描述的竹节参皂苷测定方法测定了在所得到竹节参皂苷中的皂苷含量,其结果是以所得到竹节参皂苷总重量计为96.8重量%。
制备所述的有效组分竹节参多糖:
称取前面步骤得到的竹节参粉10重量份,然后加入100重量份水,在室温下进行提取2小时,提取完后进行过滤,这个提取过程重复进行3次,得到的滤液合并,再减压浓缩至所述合并滤液体积的1/5,得到浓缩提取液。
在这个步骤中,进行提取、减压浓缩操作所使用的设备与上述设备相同。
然后,往所述的浓缩提取液中添加95体积%乙醇水溶液,使所述浓缩提取液中最终乙醇浓度达到60体积%,在室温下进行醇沉过夜,然后进行过滤分离得到竹节参多糖溶液,再使用上海世远生物设备工程有限公司提供的SY-6000小型喷雾干燥仪进行真空喷雾干燥,于是得到所述的竹节参多糖。
采用本发明说明书中描述的竹节参多糖测定方法测定了在所得到竹节参多糖中的多糖含量,其结果是以所得到竹节参多糖总重量计为98.6重量%。
使用本实施例制备竹节参皂苷与竹节参多糖按照下述配方采用通常颗粒剂的制备方法制备颗粒剂:
竹节参皂苷 200mg
竹节参多糖 125mg,
淀粉 20mg
聚乙烯吡咯烷酮5mg
实施例2:本发明片剂的制备
按照与实施例1相同方式制备竹节参皂苷与竹节参多糖。
使用本实施例制备竹节参皂苷与竹节参多糖按照下述配方采用通常片剂制备方法制备片剂:
竹节参皂苷 300mg
竹节参多糖 145mg,
乳糖 20mg
聚乙烯吡咯烷酮5mg
羟丙纤维素5mg
实施例3:本发明胶囊剂的制备
按照与实施例1相同方式制备竹节参皂苷与竹节参多糖。
使用本实施例制备竹节参皂苷与竹节参多糖按照下述配方采用通常胶囊剂制备方法制备胶囊剂:
竹节参皂苷 380mg
竹节参多糖 245mg,
蔗糖 10mg
甘油 50mg
实施例4:本发明口服的制备
按照与实施例1相同方式制备竹节参皂苷与竹节参多糖。
使用本实施例制备竹节参皂苷与竹节参多糖按照下述配方采用通常口服液制备方法制备口服液:
竹节参皂苷350mg
竹节参多糖188mg,
蔗糖 10mg
甘油 50mg
下面通过动物实验进一步说明本发明组合物的功效。
试验例1:竹节参皂苷多糖组合物对免疫低下小鼠免疫器官重量的影响
材料与方法:
Balb/e小鼠,体重18-22g,雌雄各半,由湖北省动物实验中心提供,合格证号:SCXK(鄂2008-0005)给药期间,每只小鼠按规定给予定量饲料,自由饮水,每日记录小鼠体重,观察小鼠体重及毛色变化。
取Balb/c小鼠(18~22g),72只,随即分9组,每组各8只。分为正常组:蒸馏水;香菇多糖组:香菇多糖(100mg/kg);模型组:环磷酰胺(30mg/kg);实验组:竹节参皂苷组(200mg/kg、400mg/kg)两个剂量组;竹节参多糖(125mg/kg、250mg/kg);皂苷多糖组合物(皂苷200mg/kg+多糖125mg/kg、皂苷400mg/kg+多糖250mg/kg)。
灌胃给药,连续18d,正常组及模型组给予相应体积的蒸馏水。d3除正常组外腹腔注射环磷酰胺30mg/kg(正常组给予等容量生理盐水),隔天注射,共注射4次,制备免疫功能低下的动物模型。每天记录小鼠体重。
未次给药后,小鼠颈椎脱臼处死,取脾并称湿重,计算小鼠脾脏指数。脾脏指数=小鼠脾重/体重(mg·g-1)。
实验结果
Cy免疫抑制组小鼠脾脏器指数比正常组降低,说明Cy可以降低脾的重量;香菇多糖组脾脏的重量得到一定恢复,说明阳性药对免疫低下小鼠的脾脏有保护作用;竹节参皂苷和多糖组均提高脾指数,均可提高脾脏的指数。竹节参皂苷多糖组合物使脾脏指数恢复到正常水平,见表1。
表1:小鼠脾脏指数表()
△△P<0.01vs正常组;*P<0.05,**P<0.01vs模型组
▲前一个数据为实施例1制备的竹节参皂苷,后一个数据为实施例1制备的多糖。
试验例2:竹节参皂苷多糖组合物对免疫低下小鼠T淋巴细胞亚群的影响
材料与方法:
Balb/c小鼠分组及给药方式同上,末次灌胃给药24h后,眼球取血,每个样品加入50U·ml-1的肝素抗凝,分别加入FITC标记的CD3+和PE+标记的CD4+抗体各5μL(检测CD4+亚群T细胞),或者加入FITC标记的CD3+和PE标记的CD8+抗体各5μL(检测CD8+亚群T细胞),或者加入PE标记的CD49b+抗体5μL(检测NK细胞),或者加入PE标记的CD19+抗体5μL(检测B细胞),。混匀,4℃孵育30min,然后把试管放入Q-PreP标本制备仪上自动把标本溶血,加入固定液;1500r/min离心5min,弃上清,清洗2次,加入600μlPBS振荡混匀,避光保存于4℃冰箱待上机检测。流式细胞仪测定CD4+、CD8+T细胞比例(Anti CD3/FITC,Anti CD4/PE,Anti CD8/PE,Anti CD49b/PE,AntiCD19/PE,美国,e-bioscience公司)。
实验结果:
Cy模型组小鼠T淋巴细胞亚群紊乱,CD4+、CD8+细胞百分比远低于正常组;香菇多糖组可明显提高CD4+和CD8+细胞百分比;竹节参皂苷和多糖的高剂量组均可提高CD4+和CD8+百分比,并具有统计学意义;竹节参皂苷多糖组合物同时提高CD4+及CD8+百分比,调节T细胞各亚群的比例,恢复到接近正常小鼠免疫水平,且作用优于单独用药组,见表2。
△△P<0.01vs正常组;*P<0.05,**P<0.01vs模型组
▲前一个数据为实施例1制备的竹节参皂苷,后一个数据为实施例1制备的多糖。
试验例3:竹节参皂苷多糖组合物对免疫低下小鼠B淋巴细胞的影响
材料与方法:
Balb/c小鼠分组及给药方式同上,末次灌胃给药24h后,眼球取血,每个样品加入50U·ml-1的肝素抗凝,分别加入FITC标记的CD3+和PE标记的CD4+抗体各5μL(检测CD4亚群T细胞),或者加入FITC标记的CD3+和PE标记的CD8+抗体各5μL(检测CD8+亚群T细胞),或者加入PE标记的CD49b+抗体5μL(检测NK细胞),或者加入PE标记的CD19+抗体5μL(检测B细胞),混匀,4℃孵育30min,然后把试管放入Q-PreP标本制备仪上自动把标本溶血,加入固定液;1500r/min离心5min,弃上清,清洗2次,加入600μlPBS振荡混匀,避光保存于4℃冰箱待上机检测。流式细胞仪测定B细胞比例。
实验结果:与正常组比较,Cy组小鼠B细胞数明显降低;与正常组比较,阳性药香菇多糖组B细胞水平明显提高;竹节参皂苷和多糖的高剂量组对Cy致免疫低下小鼠B细胞数均有显著性提高;组合物低、高剂量组均显著提高B细胞数,接近正常水平,并有统计学意义;提示竹节参皂苷和多糖联用对小鼠体液免疫反应有促进作用,并有一定的协同作用,且作用优于单独用药组,见表3。
△△P<0.01vs正常组;*P<0.05,**P<0.01vs模型组
▲前一个数据为实施例1制备的竹节参皂苷,后一个数据为实施例1制备的多糖。
试验例4:竹节参皂苷多糖组合物对免疫低下小鼠NK淋巴细胞的影响材料与方法:
Balb/c小鼠分组及给药方式同上,末次灌胃给药24h后,眼球取血,每个样品加入50U·ml-1的肝素抗凝,分别加入FITC标记的CD3+和PE标记的CD49b+抗体5μL(检测NK细胞),混匀,4℃孵育30min,然后把试管放入Q-PreP标本制备仪上自动把标本溶血,加入固定液;1500r/min离心5min,弃上清,清洗2次,加入600μlPBS振荡混匀,避光保存于4℃冰箱待上机检测。流式细胞仪测定NK细胞比例。
实验结果:
与正常组比较,Cy模型组小鼠NK细胞显著下降,阳性药组NK细胞显著性增高,超过正常组;竹节参皂苷和多糖组中,只有竹节参多糖低剂量组有提高NK细胞数的作用,并有统计学意义;皂苷多糖组合物两个剂量组均可明显提高NK细胞数,使之恢复正常,甚至更高。提示竹节参皂苷多糖组合物可促进非特异性免疫作用,且作用优于单独用药,见表4。
△△P<0.01vs正常组;*P<0.05,**P<0.01vs模型组
▲前一个数据为实施例1制备的竹节参皂苷,后一个数据为实施例1制备的多糖。
试验例5:竹节参皂苷多糖组合物对免疫低下小鼠IL-2水平的影响
材料与方法:
Balb/c小鼠分组及给药方式同上,小鼠末次给药后,摘小鼠眼球取血,分离血清,采用ELIAS法,按试剂盒操作说明进行(白细胞介素2酶免试剂盒及IFN-γ试剂盒,美国,Rndsystems公司)。
实验结果:
与正常组比较,Cy组小鼠IL-2含量明显降低;阳性药香菇多糖组IFN有明显提高;竹节参皂苷和多糖组对Cy致免疫低下小鼠IL-2含量均具有提高作用,并呈一定的量效关系;竹节参皂苷多糖组合物均可明显提高IL-2含量,具有统计学意义;提示竹节参皂苷多糖组合物可以显著提高免疫低下小鼠的IL-2含量,效果优于皂苷和多糖单独使用组。见表5
△△P<0.01vs正常组;*P<0.05,**P<0.01vs模型组
▲前一个数据为实施例1制备的竹节参皂苷,后一个数据为实施例1制备的多糖。
实验例6:竹节参皂苷多糖组合物对免疫低下小鼠IFN--γ水平的影响
材料与方法:
Balb/c小鼠分组及给药方式同上,小鼠末次给药后,摘小鼠眼球取血,分离血清,采用ELIAS法,按试剂盒操作说明进行(白细胞介素2酶免试剂盒及IFN-γ试剂盒,美国,Rndsystems公司)。
实验结果:
与正常组比较,Cy组小鼠IFN-γ含量明显降低;阳性药香菇多糖组IFN有明显提高;竹节参皂苷和多糖组对Cy致免疫低下小鼠IFN-γ含量均具有提高作用,并呈一定的量效关系;竹节参皂苷多糖组合物均可明显提高IFN-γ含量,具有统计学意义;提示竹节参皂苷多糖组合物可以显著提高免疫低下小鼠的IFN-γ含量,效果优于皂苷和多糖单独使用组,见表6。
表6:小鼠血清γ干扰素表达水平表()
△△P<0.01vs正常组;*P<0.05,**P<0.01vs模型组
▲前一个数据为实施例1制备的竹节参皂苷,后一个数据为实施例1制备的多糖。
Claims (9)
1.一种用于增强人体内免疫调节功能的组合物,它是由有效组分或有效组分与在保健药品、保健食品或饮料上可接受的载体组成的,其特征在于所述的有效组分是,以重量份计:
竹节参皂苷 200-400份
竹节参多糖 125-250份
所述的有效组分竹节参皂苷是采用下述方法制备得到的:
称取竹节参粉10重量份,按照竹节参粉与乙醇水溶液重量体积比为10-14添加50-70体积%乙醇水溶液,浸泡1-3小时,然后进行加热回流提取1-3小时,这样加热回流提取3-5次,提取液合并,滤过,得到粗竹节参皂苷提取液;
然后,得到的提取液在减压下去除溶剂,直到无醇味,其残留物加水稀释后进行离心分离,得到的上清液再按照所述上清液与正丁醇的体积比1∶1使用正丁醇进行萃取,得到的萃取液再减压去除正丁醇,得到粗竹节参皂苷;
以所述的粗竹节参皂苷重量计使用1-2倍的80-90体积%乙醇水溶液进行溶解,再加入4-5倍的丙酮,静置4-6小时,然后离心分离,收集沉淀物,用丙酮洗涤,再在60-80℃下进行干燥1-2小时,得到所述的竹节参皂苷;
所述的有效组分竹节参多糖是采用下述方法制备得到的:
称取竹节参粉10重量份,然后加入80-120重量份水,在室温下进行提取1-3小时,提取完后进行过滤,这个提取过程重复进行2-4次,得到的滤液合并,再减压浓缩至所述合并滤液体积的1/4至1/6,得到浓缩提取液;
然后,往所述的浓缩提取液中添加90-100体积%乙醇水溶液,使所述浓缩提取液中最终乙醇浓度达到50-70体积%,在室温下进行醇沉过夜,然后进行过滤分离得到竹节参多糖溶液,再经真空或喷雾干燥得到所述的竹节参多糖;
所述的组合物是散剂、片剂、胶囊、颗粒剂、口服液或注射剂。
2.根据权利要求1所述的组合物,其特征在于所述的有效组分是,以重量份计:
竹节参皂苷 250-380份
竹节参多糖 160-220份。
3.根据权利要求1所述的组合物,其特征在于所述的有效组分是,以重量份计:
竹节参皂苷 280-350份
竹节参多糖 180-200份。
4.根据权利要求1所述的组合物,其特征在于所述的竹节参粉粒度是20-40目。
5.根据权利要求1所述的组合物,其特征在于在制备竹节参皂苷时,按照竹节参粉与乙醇水溶液重量体积比为12添加60体积%乙醇水溶液,浸泡2小时,然后进行加热回流提取2小时,这样加热回流提取4次。
6.根据权利要求1所述的组合物,其特征在于得到的粗竹节参皂苷以所述的粗竹节参皂苷重量计使用1倍的85体积%乙醇水溶液进行溶解,再加入4倍的丙酮,静置5小时,然后离心分离,收集沉淀物,用丙酮洗涤,再在70℃下进行干燥1.5小时,得到所述的竹节参皂苷。
7.根据权利要求1所述的组合物,其特征在于在制备竹节多糖时,称取竹节参粉10重量份,加入100重量份水,在室温下进行提取2小时,这个提取过程重复进行3次,合并滤液,再减压浓缩至所述合并滤液体积的1/5;
往得到的浓缩提取液中添加95体积%乙醇水溶液,使所述浓缩提取液中最终乙醇浓度达到60体积%。
8.根据权利要求1所述的组合物,其特征在于所述的减压是压力为0.01-0.10MPa。
9.根据权利要求1-8中任一项权利要求所述的组合物在制备用于增强人体内免疫调节功能的保健药物、保健食品或饮料中的用途。
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