CN102294026A - 奶牛链球菌乳房炎灭活疫苗及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种奶牛链球菌乳房炎灭活疫苗及其制备方法，主要包括无乳、停乳、乳房型链球菌感染性奶牛乳房炎疫苗优势流行菌株，进一步通过发酵规模化生产菌液、灭活、纯化等工艺，经此形成灭活全菌、全菌+荚膜多糖、荚膜多糖结合蛋白抗原，不加或加入白花油、FIA、铝盐、MF59、SP01、SP02佐剂、免疫刺激复合物、免疫细胞因子等佐剂，制备单价、二价、三价或多加奶牛无乳、停乳、乳房型链球菌乳房炎灭活全菌疫苗、灭活全菌+荚膜多糖疫苗、荚膜多糖结合蛋白疫苗注射剂型，通过皮下注射、肌肉注射、乳头管注射、微针透皮免疫接种奶牛后，可安全、稳定、全面有效预防链球菌感染所致奶牛乳房炎的发生。

Description

奶牛链球菌乳房炎灭活疫苗及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种奶牛链球菌乳房炎灭活疫苗，特别是一种含奶牛无乳、停乳和乳房血清型链球菌乳房炎灭活全菌疫苗、灭活全菌+荚膜多糖疫苗、荚膜多糖结合蛋白疫苗及其制备方法，用于链球菌感染性奶牛乳房炎的免疫预防，属于生物制药领域。 

背景技术

奶牛乳房炎(Bovine Mastitis)是危害畜牧业、食品安全、人类健康的重大传染病，特别是近年气候环境改变、抗生素滥用耐药，超级细菌出现，细菌感染奶牛乳房炎发病率和死亡率逐年攀升，严重危害畜牧业发展、食品安全和人类健康，由此再次敲响警钟，奶牛乳房炎已成为国计民生的头等大事，疫苗防控势在必行。 

据国际奶牛联合会报告，全球有2.2亿头奶牛，因理化所致奶牛乳房炎发病率明显下降，而微生物感染奶牛乳房炎呈显著上升，其发病率高达60％以上。引发奶牛乳房炎的病原达140余种，主要是细菌类占主流，其中链球菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌感染占90％以上，且可多种病原菌共同或单独引起。我国奶牛乳房炎以链球菌、金葡菌和大肠杆菌病原菌为主，占据91.4％，其中链球菌高达40％，且以无乳、停乳、乳房型链球菌为主，与当前国际报道感染菌种及血清型相一致。奶牛乳房炎不但影响奶牛生活质量和产量，而且经济损伤也明显突出，如美国发达国家每年达30亿美元、英国4亿美元，我国每年达35亿元以上，尤其是奶制品及肉食品抗菌素及细菌产物严重超标至今不能出口，已成为国计民生的社会现实问题。 

目前奶牛乳房炎治疗仍是抗生素为首选，但大量抗生素造成奶牛耐药，而得不到有效控制。人们最大愿望就是通过接种疫苗有效控制奶牛乳房炎，其目的就是增强机体免疫应答反应，特别是乳腺组织的免疫应答反应来阻止、中和、杀灭外界进入的病原微生物，但由于乳房本身的生理特点给有效免疫力的产生带来了了一系列特殊的挑战。第一，乳房炎是乳腺组织的炎症，然而免疫应答增强在奶牛患乳房炎的情况下并不总是有益的。免疫反应的一个重要组成部分是大量的嗜中性粒白细胞从血液迁移到感染的乳腺来发挥作用。在实际生产中，牛奶中出现大量体细胞并不认为是好事，因为体细胞数量增加说明奶牛已患乳房炎，并且此时牛奶品质、产量会明显下降。第二，乳腺中的牛奶会稀释抗感染的嗜中性粒细胞的浓度， 而且牛奶中的一些成分，像脂肪和酪蛋白能降低抗感染嗜中性粒细胞的杀菌能力。第三，奶牛饲养有大量可引起乳房炎的微生物的环境中，而且牛奶本身给这些病原菌生长提供了温床。因此，使奶牛乳腺产生有效的免疫力，降低乳房炎的发生率，需要攻克的难题较多，由此给奶牛乳房炎疫苗研发提出了更高要求。 

细菌感染性奶牛乳房炎菌种多而复杂，且与宿主交互作用免疫应答及免疫保护复杂性，疫苗佐剂在疫苗中发挥了重要作用更佳凸现，它决定免疫应答与免疫保护的走向，已成为奶牛乳房炎疫苗研发的重要内容。动物疫苗使用的白花油佐剂，能产生高滴度抗体，但没有黏膜免疫和细胞免疫应答，尤其是副作用较大，而影响奶牛质量和奶产量。近些年，以色列Gabriel Leitner等研制的奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌苗“MASTIVACS I”，曾对FIA和ISA206(vaccine adjuvant for w/o/w emusion based onmineral oil)佐剂效果比较，发现FIA(freund’s incomplete adjuvant)对小鼠的刺激性较大，认为ISA206佐剂比较适合；我国罗金印等曾研制的氢氧化铝佐剂灭活菌苗、靳亚平等研制的葡聚糖、油佐剂和弗氏不完全佐剂奶牛乳房炎疫苗结果表明，3种以FIA佐剂效果最好，但仍存在副作用大；本发明者采用自主知识产权的SP01佐剂(角鲨烯、聚氧乙烯蓖麻油和聚醚水包油组成水包油佐剂)作为奶牛乳房炎灭活疫苗佐剂，结果显示SP01佐剂具有全面免疫应答效果，且副作用明显好于白花油、FIA、ISA206和铝盐佐剂，成为新一代有发展前途的疫苗新佐剂。 

链球菌(Streptococcus)是最常见奶牛乳房炎的病原菌之一，其致病复杂与其荚膜多糖(Capsular polysaccharides，CPs)、外毒素、黏附素等紧密相关，是制约疫苗发展的瓶颈问题。奶牛链球菌乳房炎的主要有无乳链球菌、停乳链球菌、乳房链球菌、化脓链球菌、肺炎链球菌等，其中最为重要的是停乳链球菌、无乳链球菌和乳房链球菌三个血清型，占链球菌感染的92％以上。疫苗是预防传染病最有效的手段，到目前为止还无有效预防链球菌性乳房炎的商品化疫苗面市。国内外对链球菌乳房炎疫苗研究较少，且不系统而深入，如Mackie报道使用甲醛灭活无乳链球菌对奶牛保护力不佳、Nasher等将甲醛灭活的乳房链球菌直接注入干奶期奶牛的乳房内，结果表明在产犊后2个月牛奶中仍可检测到IgGI和IgA抗体。从已有的研究可见，灭活全菌疫苗保护效果不全面，这与没有足够荚膜多糖保护性抗原有关，且使用白花油佐剂副作用大而影响疫苗效果紧密相连。 

发明内容

本发明目的在于公开一种奶牛链球菌乳房炎灭活疫苗及其制备方法，奶牛链球菌乳房炎灭活单价、二价、三价或多价灭活(无乳、停乳、乳房等血清型全菌、全菌+荚膜多糖、荚膜多糖结合蛋白)疫苗；本发明目的还在于公开该疫苗的制备方法；本发明的目的还在于公开该疫苗可安全、稳定、全面有效预防链球菌感染奶牛乳房炎的发生。 

本发明目的是通过如下技术方案实现的： 

1、通过对我国内蒙古、重庆、广州、黑龙江、兰州、河北、山东等东西南北中30个省市90个中大型奶牛场、近3万头奶牛乳腺炎奶汁样品，分离、鉴定、确定了我国奶牛链球菌流行优势株为无乳、停乳、乳房血清型，制备了优势流行菌株兔血清与已有国内外代表奶牛链球菌乳房炎菌株免疫交叉达95％以上，由此选用的无乳、停乳、乳房等血清型链球菌优势疫苗株具有代表国内外奶牛乳房炎流行株。 

在本发明的方法中，包括但不限于无乳、停乳、乳房血清型链球菌作为奶牛乳腺炎疫苗候选优势菌株；包括适宜于制备奶牛乳房炎链球菌疫苗生产的当前和今后广泛流行野生株或突变株。 

2、选用奶牛链球菌乳房炎无乳、停乳、乳房血清型优势疫苗株，通过培养传代、建立了奶牛链球菌乳房炎灭活疫苗原始种子批、主种子批和工作种子批库，进一步通过理化性质、基因特征、毒理和免疫原性等全面分析，表明建立的奶牛无乳、停乳、乳房等血清型链球菌疫苗菌株三级种子批库符合疫苗生产要求。 

在本发明专利中，包括但不限于无乳、停乳、乳房血清型链球菌建立种子批库；包括适用于当前和今后广泛流行的链球菌野生株或突变株均可建立疫苗株种子批库用于疫苗生产。 

3、通过奶牛乳房炎菌无乳、停乳、乳房血清型链球菌菌苗工作种子批株，从10L到1000L发酵放大培养，制备了无乳、停乳、乳房等血清型奶牛链球菌乳房炎菌苗原液，经甲醛灭活、离心分离、生化提取制备了纯化无乳、停乳、乳房等血清型灭活全菌、荚膜多糖抗原，抗原纯度达95％；通过对温度、时间、接种量等培养条件的优化，获得了规模化生产灭活全菌、荚膜多糖疫苗原液；进一步血清型别、理化性质、基因特征、外源因子、免疫原性等全面鉴定。 

在本发明专利中，包括但不限于无乳、停乳、乳房血清型金黄色葡萄球菌苗工作种子批株、BHI培养基用于疫苗原液规模化生产；也包括适用于当前和今后广泛流行的候选链球菌新优势菌株及THB等培养基介质。 

4、纯化的无乳、停乳、乳房等血清型链球菌乳房炎灭活荚膜多糖疫苗原液，用偶联剂与破伤风毒素蛋白(TT)、白喉毒素蛋白(DT)、无毒力白喉毒素蛋白(CRM197)或其他合适的载体蛋白分子。依Pr-L-Ps结构式偶联，其中，Pr是载体蛋白，Ps是奶牛链球菌荚膜多糖，L是共价键、或连接基团，且Ps∶Pr的质量比为0.5-3.5∶1。先采用溴化氢活化多糖，然后再采用碳二亚胺将活化的多糖与蛋白共价偶联。制备出奶牛链球菌奶牛乳房炎荚膜多糖结合蛋白抗原原液，TT或DT或CRM197载体蛋白与各血清型荚膜多糖结合蛋白都有好的交联效果，交联率达85％以上，由此TT或DT或CRM197均可作为该疫苗载体结合蛋白。 

在本发明专利中，包括但不限于无乳、停乳、乳房血清型链球菌灭活荚膜多糖和TT、DT、CRM197交联载体蛋白；包括适用于当前和今后广泛流行链球菌野生株株、突变株荚膜多糖及其他载体蛋白。 

5、制备的有效剂量纯化奶牛乳房炎无乳、停乳、乳房血清型链球菌灭活全菌(比如1～10×10¹⁰CFU)、全菌(比如1～10×10¹⁰CFU)+荚膜多糖(比如10～60Ug)抗原、荚膜多糖结合蛋白抗原(比如40～60Ug/CPs-10～20Ug/TT或DT或CRM197)分别与常规用量的白花油、FIA、铝盐、MF59和SP01、SP02疫苗佐剂混均匀，制备奶牛链球菌乳房炎灭活全菌、全菌+荚膜多糖、荚膜多糖结合蛋白疫苗，分别免疫BALB/c、豚鼠、家兔和奶牛动物，间隔28天，皮下或肌肉或乳头管免疫2次，末次免疫14天采集血清、奶汁、脾淋巴细胞，观察奶牛产奶量与质量、体温、体重、体细胞计数、细菌计数及ELISA、ELISPOT测定抗体效价、细胞免疫水平及死亡情况。试验结果可见，这几种佐剂可提升奶牛链球菌乳房炎灭活疫苗产生高效价抗体滴度、依次是白花油、不完全弗氏、SP01、MF59和铝盐佐剂，而SP01、SP02还产生了细胞免疫和黏膜免疫效应，且在不同动物呈现一致性趋势。由此SP01、SP01、MF59、白花油、不完全弗氏和铝盐均可有效的作为奶牛乳房炎灭活疫苗的佐剂。 

在本发明专利中，包括但不限于SP01、SP02、MF59、白花油、FIA和铝盐佐剂中的一种 或几种用于奶牛链球菌灭活疫苗的制备；包括适用于免疫刺激复合物、细胞因子、脂质体等佐剂制备的奶牛链球菌乳房炎灭活疫苗。 

6、本发明的奶牛链球菌乳房炎灭活疫苗可不含有佐剂，也可以含有SP01、SP02、MF59、白花油、FIA和铝盐佐剂中的一种或几种，以有效剂量制备有或无佐剂的奶牛链球菌灭活单价、多价(无乳、停乳、乳房血清型)菌体(比如1～10×10¹⁰CFU)疫苗注射剂型；制备有或无佐剂的奶牛链球菌灭活单价、、二价、三价、多价(无乳、停乳、乳房等血清型)菌体(比如1～10×10¹⁰CFU)+荚膜多糖(比如10～60Ug)疫苗注射剂型；制备有或无佐剂的奶牛链球菌灭活单价、二价、三价、多价荚膜多糖结合蛋白(比如40～60Ug/CPs-10～20Ug/TT或DT或CRM197)疫苗注射剂型。 

7、本发明的奶牛链球菌乳房炎灭活疫苗注射剂型可皮下注射，也可以肌肉、乳头管注射，也可以一种或几种联合，制备有或无佐剂的奶牛链球菌不同剂量灭活单价、二价、三价、多价灭活全菌疫苗、全菌+荚膜多糖疫苗、荚膜多糖结合蛋白疫苗，分别免疫BALB/c、豚鼠、家兔和奶牛动物，观察过敏性反应、异常毒性、热源质反应、一般毒性。结果表明：奶牛链球菌乳房炎灭活疫苗制品接种动物是安全的。 

8、本发明的奶牛链球菌乳房炎灭活疫苗有或无佐剂的灭活单价、二价、三价、多价有效剂量的灭活全菌疫苗、全菌+荚膜多糖疫苗、荚膜多糖结合蛋白疫苗，分别免疫BALB/c、家兔和奶牛动物，通过量效、时效、次效测定抗体和细胞免疫水平以评价免疫原性；进一步在2-3岁即将进入泌乳期(即产前25d，怀孕8个月20d)健康奶牛，免疫剂量是灭活全菌疫苗(比如5×10¹⁰CFU)、灭活全菌+荚膜多糖(比如5×10¹⁰CFU+50UgCPs)、荚膜多糖结合蛋白(比如50UgCPs+20UgTT或DT或CRM197)疫苗，0，28，56天各免疫1次(即产前25天，产后3天、31天)，末次免疫后14天用1000CFU混合无乳、停乳、乳房链球菌野生菌株乳头管内注射攻毒，通过临床症状红肿热痛、体温、体重、奶汁产量质量、体细胞数、细菌数、进食死亡等指标评价免疫保护率。结果显示，制备的不管是皮下注射或是以肌肉或是乳头管注射、不管是单价或是多价、不管是有佐剂或是无佐剂奶牛链球菌乳房炎灭活疫苗都有产生高效价抗体滴度，与剂量呈相关，且5×10¹⁰CFU、50UgCPs、20Ug TT或DT或CRM197达到平台期，加佐剂优于无佐剂组，多价、三价、二价好于单价，荚膜多糖好于灭活全菌疫苗类型，在不 同动物有一致免疫应答趋势，加荚膜多糖可提高免疫保护率，在奶牛体内免疫保护率达到75％以上。 

9、本发明的奶牛链球菌乳房炎灭活疫苗有或无佐剂的灭活单价、二价、三价、多价灭活全菌疫苗、全菌+荚膜多糖疫苗、荚膜多糖结合蛋白疫苗制品，分别置于4℃、室温(20-25)℃和37℃，从外观、pH、蛋白含量、动物免疫原性等指标观察疫苗稳定性。结果表明，奶牛链球菌乳房炎灭活疫苗制品放置2～8℃稳定性良好，有效期暂定2年。 

10、在本发明的方法中，可以采用任何适宜于制备灭活全菌体、全菌+荚膜多糖、荚膜多糖结合蛋白疫苗的奶牛乳房炎链球菌株进行疫苗生产，但疫苗株的选择应具有代表性，依据流行病学调查资料选择的、当前和今后广泛流行的野生株。另外，菌株产量高、诱导免疫保护的能力强、交叉保护谱广、稳定。 

11、本发明的奶牛链球菌乳房炎灭活疫苗采用皮下、肌肉、乳头管、微针透皮的一种或几种的联合免疫不同品种、不同年龄奶牛，可安全、稳定、全面有效预防链球菌感染性奶牛乳房炎的发生。 

综上，奶牛链球菌乳房炎灭活疫苗及其制备方法，主要含有奶牛乳房炎无乳、停乳、乳房型链球菌，具有代表中国链球菌感染所致奶牛乳房炎优势流行菌株。制备的无乳、停乳、乳房型链球菌兔抗血清，与现有国内外临床分离奶牛乳房炎链球菌代表株免疫交叉中和达95％以上，由此选择无乳、停乳、乳房型链球菌具有代表国内外奶牛乳房炎流行株和疫苗株特征。建立符合疫苗生产要求的无乳、停乳、乳房型链球菌奶牛乳房炎灭活疫苗原始种子批、主种子批和工作种子批库。通过BHI或THB等培养基放大培养工业化生产，制备奶牛无乳、停乳、乳房型链球菌乳房炎菌苗原液，经甲醛灭活、离心分离、生化提取制备了纯化无乳、停乳、乳房型链球菌灭活全菌。通过BHI或THB等培养基放大培养工业化生产，制备奶牛无乳、停乳、乳房型链球菌乳房炎菌苗原液，经甲醛灭活、离心分离、生化提取制备了纯化无乳、停乳、乳房型链球菌荚膜多糖抗原。制备的无乳、停乳、乳房型链球菌荚膜多糖抗原用溴化氢、碳二亚胺偶联剂与TT、DT、CRM197或其他载体蛋白共价偶联出奶牛链球菌乳房炎荚膜多糖结合蛋白。形成奶牛无乳、停乳、乳房型链球菌乳房炎灭活全菌疫苗、灭活全菌+荚膜多糖疫 苗、灭活荚膜多糖结合蛋白疫苗。该疫苗中可以不含有佐剂，制备无佐剂的单价或多价的奶牛链球菌乳房炎灭活全菌疫苗、全菌+荚膜多糖疫苗、荚膜多糖结合蛋白疫苗。疫苗中可以含有佐剂，佐剂为如下的一种：①白花油，为商品化佐剂；②FIA，为商品化佐剂；③铝盐，为氢氧化铝或磷酸铝；④MF59，为商品化佐剂；⑤SP01，为2％角鲨烯、0.1％聚氧乙烯蓖麻油、0.1％聚醚混匀水包油样；⑥SP02，为2％角鲨烯、0.1％聚氧乙烯蓖麻油、0.1％聚醚、10ug细菌鞭毛混匀水包油样。佐剂也可如上的两种或多种组合或其它佐剂。制备有佐剂的单价或多价的奶牛链球菌乳房炎灭活全菌疫苗、全菌+荚膜多糖疫苗、荚膜多糖结合蛋白疫苗。该疫苗制备成临床适用的注射剂型：皮下注射、肌肉注射和乳头管注射剂型。该疫苗有或无佐剂的单价、二价、三价、多价灭活全菌疫苗、全菌+荚膜多糖疫苗、荚膜多糖结合蛋白疫苗通过皮下或肌肉或乳头管注射，表明该疫苗都能产生良好的免疫应答，皮下注射高于肌肉、乳头管途径；免疫加佐剂好于无佐剂组；多价、三价、二价好于单价；有荚膜多糖好于灭活全菌疫苗；在不同动物有一致免疫应答趋势，奶牛链球菌乳房炎灭活疫苗在奶牛体内免疫保护率75％以上。该疫苗制品在动物体内使用安全，无不良反应。该疫苗制品放置2～8℃稳定性良好，有效期在2年以上。该疫苗制品采用皮下注射、肌肉注射、乳头管注射、微针透皮的一种或几种的联合用于不同品种、不同年龄奶牛免疫接种，可安全、稳定、有效预防链球菌感染所致奶牛乳房炎的发生。 

本发明的优点是：本发明选择我国奶牛乳房炎无乳、停乳和乳房等血清型链球菌优势流行菌株作为疫苗株、通过灭活全菌、灭活全菌+荚膜多糖及荚膜多糖结合蛋白为疫苗靶抗原、与加入或不加入佐剂制备奶牛链球菌乳房炎灭活疫苗注射剂型、微针透皮剂型，为安全、高效、全面有效预防奶牛链球菌乳房炎提供了保证，将是奶牛链球菌乳房炎疫苗发展的新里程碑。 

具体实施方式

下面参考实施例对本发明作进一步说明。给出这些实施例只是为了举例说明，它们不以任何方式限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。 

实施例1：筛选并确定奶牛链球菌乳房炎优势流行菌株： 

从覆盖我国东西南北中的内蒙古、重庆、广州、黑龙江、兰州、河北、山东等30个省市 地90个中大型奶牛场收集近3万份临床牛乳房炎奶汁样品，分离检定、筛选并确定奶牛链球菌感染乳房炎优势菌株； 

1.奶牛乳样的采集：选取出现临床症状(或者怀疑为亚临床型乳房炎)乳房炎奶牛，先用温水，再用0.2％新洁尔灭擦洗乳房，最后用70％的酒精擦拭乳头。采样者同时进行手指擦拭消毒。每个乳室先挤去头2～3把奶，以排除污染的杂菌，每头奶牛取乳样至少5mL于无菌乳样杯中，待检。 

2.奶牛乳房炎链球菌的分离培养：将少量乳汁涂片、革兰氏染色、镜检。如发现圆球形革兰氏阳性细菌可怀疑为链球菌；进一步将乳样摇匀，分别取适量接种于营养肉汤(10％血清)、BHI培养基、THB培养基、TSB培养基、普通琼脂平板、TSA平板、鲜血琼脂平板、麦康凯琼脂平板后，置于37℃温箱培养24～48h。观察每个平板中细菌生长的情况，记录菌落生长表现。 

普通琼脂平板上，37℃，24～72h培养后，未见到菌落。鲜血琼脂平板上长有灰白色、半透明表面光滑圆形隆起的小菌落，出现溶血现象，如果是β溶血则疑为无乳链球菌，如果为α溶血，疑为停乳链球菌或者乳房链球菌，如为γ溶血，则疑为乳房链球菌；血清肉汤中生长初呈均匀浑浊，管底出现絮状沉淀，上清变得透明。挑取典型菌落涂片、染色、镜检，镜检如呈球状，短链状或者长链状排列，无芽胞，革兰氏染色阳性则疑为链球菌。 

3.生化鉴定：镜检形态符合链球菌特性，且触酶试验阴性细菌，即鉴定为链球菌属细菌。若细菌CAMP试验阳性，水解七叶苷和马尿酸钠，能够利用葡萄糖、乳糖、棉子糖、水杨甘，不能利用山梨醇、海藻糖和甘露醇。七叶苷、胆汁七叶苷实验为阴性，高盐肉汤实验为阴性，即鉴定为无乳链球菌；若细菌CAMP试验阴性，不水解七叶苷和马尿酸钠，能够利用葡萄糖、乳糖、棉子糖、海藻糖，不能利用山梨醇、水杨甘和甘露醇。七叶苷、胆汁七叶苷实验为阴性，高盐肉汤实验为阴性，即鉴定为停乳链球菌；若细菌CAMP试验阴性，水解七叶苷和马尿酸钠，能够利用葡萄糖、乳糖、棉子糖，不能利用山梨醇和甘露醇。七叶苷、胆汁七叶苷实验为阴性，高盐肉汤实验为阴性，即鉴定为乳房链球菌。 

4.血清型鉴定，将鉴定好的链球菌用标准奶牛乳房炎无乳、停乳、乳房链球菌血清型(ATCC购买)进行玻片凝集试验。结果显示，分离、筛选的无乳、停乳、乳房型链球菌与同型标准 血清出现特异性凝集反应阳性，且各血清型交叉凝集反应阴性。由此，从现场分离具有代表中国流行株的无乳、停乳、乳房型链球菌作为疫苗候选株。 

5.酶切质粒图谱分析：将其分离无乳、停乳和乳房等主要血清型奶牛链球菌乳房炎菌株提取质粒DNA，质粒DNA大小及酶切片断符合奶牛乳房炎链球菌各血清型特征。 

5.SDS分析菌体蛋白组分：将其分离无乳、停乳和乳房等主要血清型奶牛链球菌乳房炎菌株进行SDS-PAGE，可见呈26-30余条大小不等蛋白条带，进一步免疫印迹符合奶牛乳房炎链球菌各血清型蛋白条带特征。 

6.致病性分析：将其分离无乳、停乳和乳房等主要血清型奶牛链球菌乳房炎菌株培养传代，分离纯化各血清型链球菌菌株分别注入6-18周BALB/c鼠腹腔注射2×10⁸个活菌、1.5-2岁家兔腹腔注射8×10⁸个活菌、2-3岁奶牛乳管注射1000个活菌，可使动物发病，甚至在1周内死亡。对奶牛观察产奶量与质量、体温、体重、体细胞数、排细菌数等。对接种后发病、死亡动物肝脏、奶牛乳房进行病原菌重分离。进行菌落涂片、革兰氏染色、显微镜检查，观察所分离菌株为无乳、停乳和乳房血清型奶牛链球菌乳房炎主要的致病菌。 

以上通过选择性培养基上分离与筛选、生化鉴定、基因分析、BALB/c、家兔、奶牛动物的致病性等评价，确定了无乳、停乳、乳房三个血清型链球菌为我国流行优势株，占奶牛乳房炎链球菌株的92％，为候选奶牛链球菌乳房炎优势疫苗株提供了依据。 

实施例2：制备奶牛链球菌乳房炎优势疫苗菌株免疫血清及确定疫苗菌株： 

从确定具有代表性的无乳、停乳、乳房血清型链球菌流行优势株，制备无乳、停乳和乳房主要血清型奶牛链球菌乳房炎菌株抗原，分别用5×10⁷CFU/1ml剂量皮下免疫家兔(链球菌抗原及抗体阴性)一次，免疫后14天心脏放血，血清抗体效价达到1∶1200以上，再分别与临床病例分离奶牛链球菌乳房炎毒株、购买美国ATCC和中国菌种库主要奶牛乳房炎标准株进行免疫中和试验，免疫中和交叉率达97％，由此确定所选用的无乳、停乳、乳房型奶牛链球菌乳房炎血清型优势疫苗株具有广泛的国内外代表性。 

实施例3：建立奶牛链球菌乳房炎疫苗株三级种子批库及检定： 

从确定具有代表奶牛乳房炎无乳、停乳、乳房链球菌流行优势株，分别接种于BHI培养基中，37℃培养24小时，收取菌液，建立三级种子批库及全面检定。 

1.原始种子批的建立：选取奶牛乳房炎无乳、停乳、乳房链球菌流行优势株菌落划线接种5％绵羊血琼脂培养基上培养，置37℃培养20-24小时培养，用脱脂牛奶冲下，第二代作为原始种子批库，加入5％脱脂奶粉分装于冻存管，冻干后-70℃以下长期保存。 

2.主种子批的建立：取第二代无乳、停乳、乳房奶牛链球菌乳房炎原始种子批菌株接种于BHI培养基，37℃培养20-24小时，第三代作为主种子批库，加入5％脱脂奶粉分装于冻存管，冻干后-70℃以下长期保存。 

3.工作种子批的建立：取第三代无乳、停乳、乳房奶牛链球菌乳房炎原始种子批菌株接种于BHI培养基，37℃培养24小时，第四代作为主种子批库，加入50％的甘油分装于培养瓶内，-70℃保存。 

4.三级种子批的检定：通过对奶牛乳房炎无乳、停乳、乳房血清型链球菌菌疫苗菌株原始种子批、主种子批、工作种子批菌株以及传代30代菌株的外观、血清型别、PH值、溶解时间、菌落变异率、形态与染色、菌株质粒图谱、荚膜多糖、菌株毒性和免疫原性进行了全面检定。结果显示，建立的奶牛无乳、停乳、乳房血清型链球菌乳房炎疫苗三级种子批库安全、稳定，符合疫苗生产的要求。 

实施例4：规模化发酵培养奶牛乳房炎链球菌原液及灭活： 

取奶牛无乳、停乳和乳房链球菌乳房炎疫苗工作种子批库菌株，接种于10L细菌培养罐的BHI培养基中，37℃培养24h；然后转接于1000L发酵罐中进行培养，37℃培养约20h，收获菌液，取样作纯检并计算菌数；随后加入终浓度为0.4％的甲醛溶液，37℃，转速150rpm，灭活36-48h。取样品连传三代无细菌生长，用无热源的PBS洗菌三次，每次4℃，6500rpm离心15min，沉淀用于制备灭活全菌疫苗抗原，上清液用于制备荚膜多糖疫苗抗原。 

实施例5：纯化奶牛乳房炎链球菌灭活全菌、荚膜多糖及检定： 

1.制备灭活全菌抗原：取规模化发酵培养的奶牛无乳、停乳和乳房链球菌乳房炎疫苗灭活全菌，用PBS洗涤2次，每次4℃，6500rpm离心15min，要沉淀，用PBS溶解，测定含量，冻干或液体为纯化的灭活全菌疫苗抗原。 

2.粗提荚膜多糖抗原：取规模化发酵培养的奶牛无乳、停乳和乳房链球菌乳房炎疫苗发酵上清液，加入终浓度为1％的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)，连续搅拌后4℃静置过夜， 10000rpm/min离心收沉淀为复合多糖。将复合多糖溶入2M氯化钙溶液，使十六烷基三甲基溴化铵与多糖解离，加入终浓度为25％的乙醇，4℃静置3h或过夜，5000rpm，4℃离心30min去核酸沉淀。收集澄清的上清液，中加入冷却的终浓度为80％的乙醇，4℃静置3h或过夜沉淀多糖，10000rpm，4℃离心15min，收集沉淀为粗糖，用无水乙醇及丙酮各洗2次，干燥，即为多糖粗制品，保存于-20℃以下备用。 

3.纯化荚膜多糖抗原：将荚膜多糖粗制品溶解于10％饱和中性乙酸钠中，按1∶2容量用冷酚提取2-4次，10000rpm，4℃离心20min，收集上清液，用0.1M氯化钙溶液透析过夜，再加无水乙醇至终浓度为75％，充分振摇，4℃静置3h或过夜沉淀多糖，10000rpm，4℃离心20min，收集沉淀，用无水乙醇及丙酮各洗2次，测含量，冻干或液体即得纯化荚膜多糖抗原。 

4.荚膜多糖抗原的鉴定：纯化的奶牛无乳、停乳和乳房链球菌乳房炎疫苗荚膜多糖抗原通过核酸、蛋白、总氮、总磷、分子大小、纯度、糖醛酸、氨基己糖和甲基戊糖等指标检测。结果显示，制备的奶牛无乳、停乳和乳房链球菌乳房炎疫苗荚膜多糖抗原纯度达到95％以上，呈各血清型荚膜多糖成分。 

实施例6：制备奶牛乳房炎链球菌荚膜多糖结合蛋白抗原及检定： 

将纯化奶牛乳房炎无乳、停乳、乳房链球菌荚膜多糖加入溴化氢(多糖与溴化氢的重量比例为1∶0.5)活化，再加入己二酰井处理，衍化率为1-3％。再加入TT或DT蛋白或CRM197和碳二亚胺(19.17mg/ml)，反应得到链球菌荚膜多糖与TT或DT蛋白或CRM197的化学共价偶联物。采用DEAE离子交换柱进行色谱分离，即将荚膜多糖结合蛋白抗原，悬浮于100mMTris，pH8.6缓冲液中，再经过分子筛柱层析进行分离，去除未结合的蛋白，分离后的溶液除菌过滤后，即为荚膜多糖结合TT或DT或CRM197蛋白抗原。通过高压液相纯度、外源因子测定，结果显示荚膜多糖结合蛋白纯度达95％、偶联率达88％，呈单一结合物成分，无外源因子。实施例7：制备奶牛链球菌乳房炎三价灭活疫苗及检定： 

1.奶牛链球菌乳房炎三价灭活全菌疫苗：①将纯化奶牛链球菌乳房炎三价(无乳、停乳、乳房)灭活全菌抗原不加佐剂，配制1×10¹⁰CFU/1ml、5×10¹⁰CFU/5ml无佐剂注射剂型；②将纯化奶牛链球菌乳房炎三价(无乳、停乳、乳房)灭活全菌抗原加入氢氧化铝或磷酸铝，分 别配制1×10¹⁰CFU/0.5mg(铝盐)/1ml、5×10¹⁰CFU/2.5mg(铝盐)/5ml有铝盐佐剂注射剂型；③将纯化奶牛链球菌乳房炎三价(无乳、停乳、乳房)灭活全菌抗原加入等量SP01佐剂(2％角鲨烯、0.1％聚氧乙烯蓖麻油、0.1％聚醚)或SP02佐剂(2％角鲨烯、0.1％聚氧乙烯蓖麻油、0.1％聚醚、10ug细菌鞭毛)混匀水包油样，分别配制1×10¹⁰CFU+0.5ml SP01(或SP02)/1ml、5×10¹⁰+2.5ml SP01(或SP02CFU)/5ml有SP01或SP02佐剂注射剂型；④将纯化奶牛链球菌乳房炎三价(无乳、停乳、乳房)灭活全菌抗原加入等量白花油或FIA佐剂混匀油包水样，分别配制1×10¹⁰CFU+0.5ml白花油(或FIA)/1ml、5×10¹⁰CFU/+2.5ml白花油(或FIA)/5ml有白花油或FIA佐剂注射剂型，以上注射疫苗可作为皮下、肌肉、奶头乳管注射免疫接种剂型，放2-8℃备用。 

2.奶牛链球菌乳房炎三价灭活(全菌+荚膜多糖)疫苗：①将纯化奶牛链球菌乳房炎三价(无乳、停乳、乳房)灭活全菌+荚膜多糖抗原不加佐剂，配制1×10¹⁰CFU+20ugCPs/1ml、5×10¹⁰CFU+50ugCPs/5ml无佐剂注射剂型；②将纯化奶牛链球菌乳房炎三价(无乳、停乳、乳房)灭活全菌+荚膜多糖抗原加入氢氧化铝或磷酸铝，分别配制1×10¹⁰CFU+20ugCPs/0.5mg(铝盐)/1ml、5×10¹⁰CFU+60ugCPs/2.5mg(铝盐)/5ml有铝盐佐剂注射剂型；③将纯化奶牛链球菌乳房炎三价(无乳、停乳、乳房)灭活全菌+荚膜多糖抗原加入等量SP01佐剂(2％角鲨烯、0.1％聚氧乙烯蓖麻油、0.1％聚醚)、SP02佐剂(2％角鲨烯、0.1％聚氧乙烯蓖麻油、0.1％聚醚、10ug细菌鞭毛)混匀水包油样，配制1×10¹⁰CFU+20ugCPs+0.5ml SP01(或SP02)/1ml、5×10¹⁰CFU+60ugCPs+2.5ml SP01(或SP02)/5ml有SP01或SP02佐剂注射剂型；④将纯化奶牛链球菌乳房炎三价(无乳、停乳、乳房)灭活全菌+荚膜多糖抗原加入等量白花油或FIA佐剂混匀油包水样，分别配制1×10¹⁰CFU+20ugCPs+0.5ml白花油(或FIA)/1ml、5×10¹⁰CFU+50ugCPs+2.5ml白花油(或FIA)/5ml有白花油或FIA佐剂注射剂型，以上注射疫苗可作为皮下、肌肉、奶头乳管注射免疫接种剂型，放2-8℃备用。 

3.奶牛链球菌乳房炎三价荚膜多糖结合蛋白疫苗：①将纯化奶牛链球菌乳房炎三价(无乳、停乳、乳房)荚膜多糖结合蛋白(载体蛋白TT或DT或CRM197)抗原不加佐剂，配制20ugCPs+10ugTT(或DT或CRM197)/1ml、50ugCPs+20ugTT(或DT或CRM197)/5ml无佐剂注射剂型；②将纯化奶牛链球菌乳房炎三价(无乳、停乳、乳房)荚膜多糖结合蛋白抗原加 入氢氧化铝或磷酸铝，分别配制20ugCPs+10ugTT(或DT或CRM197)/0.5mg(铝盐)/1ml、50ugCPs+20ugTT(或DT或CRM197)/2.5mg(铝盐)/5ml有铝盐佐剂注射剂型；③将纯化奶牛链球菌乳房炎三价(无乳、停乳、乳房)荚膜多糖结合蛋白抗原加入等量SP01佐剂(2％角鲨烯、0.1％聚氧乙烯蓖麻油、0.1％聚醚)或SP02佐剂(2％角鲨烯、0.1％聚氧乙烯蓖麻油、0.1％聚醚、10ug细菌鞭毛)混匀水包油样，配制20ugCPs+10ugTT(或DT或CRM197)+0.5mlSP01(或SP02或CRM197)/1ml、50ugCPs+20ugTT(或DT或CRM197)+2.5ml SP01(或SP02)/5ml有SP01或SP02佐剂注射剂型；④将纯化奶牛链球菌乳房炎三价(无乳、停乳、乳房)灭活荚膜多糖结合蛋白抗原加入等量白花油或FIA佐剂混匀油包水样，分别配制20ugCPs+10ugTT(或DT或CRM197)+0.5ml白花油或FIA/1ml、50ugCPs+20ugTT(或DT或CRM197)+2.5ml白花油或FIA/5ml有白花油佐剂注射剂型，以上注射疫苗可作为皮下、肌肉、乳头管注射免疫接种剂型，放2-8℃备用。 

4.将本发明实施例7制备的奶牛链球菌乳房炎三价(无乳、停乳、乳房)灭活全菌疫苗、全菌+荚膜多糖疫苗、荚膜多糖结合蛋白疫苗有佐剂或无佐剂剂型进行安全性评价。结果可见，奶牛链球菌乳房炎三价灭活疫苗外观见均一，无异味和染菌；通过豚鼠、家兔试验无热原、异常毒性和急性毒性反应；通过染色和镜检无杂菌污染、热源质检测在范围内；通过SDS-PAGE和WB检测抗原蛋白成分存在；通过免疫Balb/C小鼠1次血清中和抗体效价在1600以上。 

实施例8：本发明的奶牛链球菌乳房炎灭活疫苗在动物体内的免疫效果评价： 

1.将本发明实施例7制备的奶牛链球菌乳房炎三价灭活全菌疫苗、全菌+荚膜多糖疫苗、荚膜多糖结合蛋白疫苗加入或不加入相应佐剂，制备的皮下、肌肉、乳管注射剂型，并用PBS、铝盐、SP01、SP02、白花油、FIA、细菌鞭毛为对照组，分别免疫6-8周Balb/C小鼠、18月家兔，每组10只，其免疫剂量按实施例7疫苗低剂量组(抗原1×10¹⁰CFU、1×10¹⁰CFU+20ugCPs/1ml、20ugCPs+10ugTT(或DT或CRM197)/1ml，免疫两次(0，28天)；末次免疫后14天将各组小鼠、家兔取血、分离血清和免疫细胞及通过ELISA法测定血清、乳汁抗体效价都在1∶3200以上，采用MTT法测定中和抗体效价都在1∶1600以上，采用流式细胞仪、ELISPOT仪测定免疫细胞与血清中重要细胞因子、炎性分子、趋化因子及嗜酸性粒细胞、中性粒细胞等动态变化使得TH2/Th1应答平衡，采用ELISA法测定乳汁sIgA抗体效价都在 1∶100以上。这说明制备的奶牛链球菌乳房炎灭活疫苗不管是加入佐剂与没有佐剂均都能产生满意的双重免疫应答，且呈现出试验组有佐剂优于无佐剂组、高剂量组高于低剂量组免疫应答效果，而对阴性照组没有产生双重免疫应答；制备的奶牛链球菌乳房炎灭活疫苗不管是皮下注射还是肌肉、乳管注射剂型均都能产生满意的双重免疫应答，且注射剂血清抗体效价高于乳管内注射剂型，乳管内注射的黏膜和细胞免疫效应好于肌肉和皮下免疫途径；制备的奶牛链球菌乳房炎灭活三价荚膜多糖结合蛋白疫苗免疫应答效力优于灭活全菌疫苗和全菌+荚膜多糖疫苗，且与后者无显著差异；制备的奶牛链球菌乳房炎灭活三价灭活疫苗免疫应答效力优于单价灭活疫苗；由此制备的奶牛链球菌乳房炎灭活疫苗在小鼠、家兔体内具有好的免疫应答效果；加佐剂优于无佐剂组，SP01或SP02佐剂整体优于铝盐、白花油和FIA佐剂组，且在不同动物有一致免疫应答趋势。由此，研制的奶牛链球菌乳房炎灭活疫苗在小鼠、家兔体内有很好的免疫原性。 

2.将本发明实施例7制备的奶牛链球菌乳房炎三价(无乳、停乳、乳房)灭活全菌疫苗、全菌+荚膜多糖疫苗、荚膜多糖结合蛋白疫苗加入或不加入相应佐剂制备的皮下、肌肉、乳管注射疫苗剂型，并用PBS、铝盐、SP01、SP02、白花油、IFA、细菌鞭毛为对照组，分别按皮下、肌肉、乳管注射途径选择2-3岁即将进入泌乳期(即产前25d，怀孕8个月20d)健康(即疫苗抗体阴性，病原体阴性)奶牛，每组10头；免疫剂量在(抗原5×10¹⁰CFU、5×10¹⁰CFU+50ugCPs/5ml、50ugCPs+20ugTT(或DT或CRM197)/5ml，免疫程序是0，28，56天各免疫1次(即产前25天，产后3天、31天)；末次免疫后14天取血、分离血清和免疫细胞，采集、乳汁；通过ELISA法测定血清、乳汁抗体效价都在1∶1600以上，采用MTT法测定中和抗体效价都在1∶12800以上。这说明制备的奶牛链球菌乳房炎灭活疫苗不管是加入佐剂与没有佐剂均都能产生满意的双重免疫应答，且呈现出试验组有佐剂优于无佐剂组、高剂量组高于低剂量组免疫应答效果，而对阴性照组没有产生双重免疫应答；制备的奶牛链球菌乳房炎灭活疫苗不管是皮下注射还是肌肉、乳管注射剂型均都能产生满意的双重免疫应答，且注射剂血清抗体效价高于乳管内注射剂型，乳管内注射的黏膜和细胞免疫效应好于肌肉和皮下免疫途径；制备的奶牛链球菌乳房炎灭活三价荚膜多糖结合蛋白疫苗免疫应答效力优于灭活全菌疫苗和全菌+荚膜多糖疫苗，且与后者无显著差异；制备的奶牛链球菌乳房炎灭活三价 灭活疫苗免疫应答效力优于单价灭活疫苗；由此制备的奶牛链球菌乳房炎灭活疫苗在奶牛体内具有好的免疫应答效果；加佐剂优于无佐剂组，SP01、SP02佐剂整体优于铝盐、白花油、IFA佐剂组，且与剂量呈正相关免疫应答趋势。 

依上末次免疫14天后，用临床分离无乳、停乳、乳房链球菌野毒株进行攻毒，通过导管奶头注射将1000CFU链球菌注入乳腺乳区。攻毒后观测临床症状(发烧、乳腺肿胀)，奶样质量(血奶、异常块、奶量减少)及进食情况(进食减少)，通过奶样细菌学检测、体细胞计数SCC和血清抗体ELISA分析指标评价保护率。试验结果显示，研制的奶牛链球菌乳房炎灭活疫苗在奶牛体内有良好的保护率，有荚膜多糖高于无荚膜多糖保护率，加佐剂组高于不加佐剂组保护率，保护率达到75％以上。 

实施例9：本发明奶牛链球菌乳房炎灭活疫苗在奶牛体内的长效免疫保护评价： 

将本发明实施例7制备的奶牛链球菌乳房炎三价(无乳、停乳、乳房)灭活全菌疫苗、全菌+荚膜多糖疫苗、荚膜多糖结合蛋白疫苗皮下注射2-3岁即将进入泌乳期(即产前25d，怀孕8个月20d)健康(即疫苗抗体阴性，病原体阴性)奶牛，每组20头；免疫剂量在(抗原5×10¹⁰CFU、5×10¹⁰CFU+50ugCPs/5ml、50ugCPs+20ugTT(或DT或CRM197)/5ml，免疫程序是0，28，56天各免疫1次(即产前25天，产后3天、31天)，第二年后加强免疫1次，观察1083天，其间每隔3个月取血、奶汁，观察奶牛产奶量与质量、体细胞计数、细菌计数及通过ELISA、ELISPOT测定抗体效价、细胞免疫的长效免疫应答及保护效果。试验结果显示，研制的奶牛链球菌乳房炎灭活疫苗具有长效免疫应答和免疫保护，第一年免疫3次后，以后每年加强免疫一次，其保护率达到78％。 

实施例10：本发明的奶牛链球菌乳房炎灭活疫苗安全性试验： 

1、无菌、支原体试验：将实施例7制备的奶牛链球菌乳房炎灭活疫苗接种硫乙醇酸盐培养基、营养琼脂斜面培养基和改良马丁培养基培养14d，并以无菌生理盐水做阴性对照，培养温度为25℃、35℃。结果显示，奶牛链球菌乳房炎灭活疫苗未见细菌生长。将奶牛链球菌乳房炎灭活疫苗分别用半流体和肉汤培养基，37℃初代培养21天，次代培养21天，无菌生理盐水做阴性对照，结果显示奶牛链球菌乳房炎灭活疫苗无支原体生长。结果显示，奶牛链球菌乳房炎灭活疫苗无支原体生长。 

2、溶血性试验：选取体重为350g左右的豚鼠，采集新鲜豚鼠血1ml，用PBS洗涤3次，再将血细胞体积恢复并稀释10倍。PBS稀释奶牛链球菌乳房炎灭活疫苗(由实施例7制备)，分别为2倍、4倍、8倍，将豚鼠血细胞加入到稀释的待检佐剂中，8小时后，评价血球溶解以目测或者上清浓度检测为准，并在570nm处检测吸光度。结果显示，没有发生血球破裂，无溶血现象。说明奶牛链球菌乳房炎灭活疫苗中的成分不能使红细胞裂解。因此，奶牛链球菌乳房炎灭活疫苗无溶血反应。 

3、急性毒性试验：取实施例7制备的奶牛链球菌乳房炎灭活疫苗0.5ml腹腔注射体重为12～18g Balb/C小鼠，每组10只，同时设PBS阴性对照组，连续2周观察小鼠的活动状态、体重变化和存活率。结果表明，实验小鼠全部存活，没有出现竖毛、精神萎靡、行动迟缓等不良症状，而体重呈现增加，由此证明奶牛链球菌乳房炎灭活疫苗在试验的浓度下对动物是安全的，且14天后处死进行大体解剖检查，未见脏器有病理改变。在体重为8～10kg的Beagle狗体内的急性毒性结果：取实施例7制备的奶牛链球菌乳房炎灭活疫苗肌肉注射15ML，每组10只，同时设PBS阴性对照组，连续2周观察行为、体重和存活率变化。结果可见，Beagle狗未见毒性反应，行为正常，没有死亡，与对照组狗比较无差异，各狗体重有所增加，并处死大体解剖未见脏器有明显的病理改变。因此，奶牛链球菌乳房炎灭活疫苗无急性毒性反应，使用是安全的。 

4、过敏试验研究：取实施例7制备的奶牛链球菌乳房炎灭活疫苗皮下接种体重为250～350g Hartley豚鼠，每个样品接种豚鼠5只，每只接种0.5ml，隔日一次，共3次。第3次注射后21天，耳静脉给予相同奶牛链球菌乳房炎灭活疫苗0.5ml，并用人血白蛋白和生理盐水以同样的方法分别接种3只豚鼠作为阳性、阴性对照。注射后30分钟及3天观察动物，阳性、阴性对照均成立，奶牛链球菌乳房炎灭活疫苗组豚鼠无死亡，且无鼻痒、喷嚏、烦躁不安、呼吸困难、休克、痉挛等过敏症状。因此，奶牛链球菌乳房炎灭活疫苗在动物体内无过敏反应。 

5、兔热源质试验：取预检合格的体重为2～3kg家兔3只固定，30分钟后测量体温，共测2次，间隔30分钟，要求2次温差不大于0.2℃，各家兔2次平均温度在38.6-39.5℃。将实施例7制备的奶牛链球菌乳房炎灭活疫苗预热至38℃，于第2次测温后15分钟内，自 家兔耳边静脉缓缓注入0.5ml/只。注射后每隔30分钟测量体温1次，连测6次。结果显示：奶牛链球菌乳房炎灭活疫苗给予家兔个体升温未超过0.2℃，3只家兔升温总和未超过0.4℃，没有引起家兔的发热反应。因此，制备的奶牛链球菌乳房炎灭活疫苗无热源质。 

6、免疫病理损伤试验：由实施例7制备的奶牛链球菌乳房炎灭活疫苗通过小鼠、家兔和奶牛外周血抗体亚型、趣化因子、炎性因子、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、嗜碱性细胞及气管、肺脏、肝脏、脾脏、肾脏等检测。试验结果显示，奶牛链球菌乳房炎灭活疫苗免疫接种不管在小动物，或是在奶牛体内Th2/Th1免疫应答趋于平衡，没有免疫器官损伤的迹象，因此具有安全性。 

实施例11：本发明奶牛链球菌乳房炎灭活疫苗的稳定性实验： 

由实施例7制备的奶牛链球菌乳房炎灭活疫苗，分别置于2-8℃、室温(20-25℃)、37℃1周、2周、1个月、3个月、6个月、12个月、18个月和24个月，取样观察外观、PH值、无菌、电镜观察粒径、免疫动物观察安全性。结果显示：奶牛链球菌乳房炎灭活疫苗放置2-8℃24个月内均无变色分层等现象，PH值在7.0-7.2之间无变化，电镜观察粒径大小保持一致，且注射或滴鼻或透皮给Balb/c小鼠表现正常；奶牛链球菌乳房炎灭活疫苗放置室温25℃3个月内均有好的稳定性；奶牛链球菌乳房炎灭活疫苗放置室温37℃1个月内均有好的稳定性效果。由结果说明，奶牛链球菌乳房炎灭活疫苗放置2-8℃理化性质、生物学性能稳定，有效期至少24个月。 

Claims (4)

1.一种奶牛链球菌乳房炎灭活疫苗及其制备方法，其特征是：

(1)通过对奶牛乳腺炎奶汁样品的分离、鉴定，确定奶牛链球菌流行优势株为无乳、停乳、乳房血清型，制备优势流行菌株兔血清与已有国内外代表奶牛链球菌乳房炎菌株免疫交叉中和活性达95％以上，由此选用的无乳、停乳、乳房等血清型链球菌优势疫苗株具有代表国内外奶牛乳房炎流行菌株；

在方法中，包括但不限于无乳、停乳、乳房血清型链球菌作为奶牛乳腺炎疫苗候选优势菌株；包括适宜于制备奶牛乳房炎链球菌疫苗生产的当前和今后广泛流行野生株或突变株；

(2)选用奶牛链球菌乳房炎无乳、停乳、乳房血清型优势疫苗株，通过培养传代、建立了奶牛链球菌乳房炎灭活疫苗原始种子批、主种子批和工作种子批库，进一步通过理化性质、基因特征、毒理和免疫原性等全面分析，表明建立的奶牛无乳、停乳、乳房等血清型链球菌疫苗菌株三级种子批库符合疫苗生产要求；

在本方法中，包括但不限于无乳、停乳、乳房血清型链球菌建立种子批库；包括适用于当前和今后广泛流行的链球菌野生株或突变株，均可建立疫苗株种子批库用于疫苗生产；

(3)通过奶牛乳房炎菌无乳、停乳、乳房血清型链球菌菌苗工作种子批株，从10L到1000L发酵放大培养，制备了无乳、停乳、乳房等血清型奶牛链球菌乳房炎菌苗原液，经甲醛灭活、离心分离、生化常规方法提取制备了纯化无乳、停乳、乳房血清型灭活全菌、荚膜多糖抗原，抗原纯度达95％；通过对温度、时间、接种量等培养条件的优化，获得了规模化生产灭活全菌、荚膜多糖疫苗原液；进一步血清型别、理化性质、基因特征、外源因子、免疫原性等全面鉴定，由此规模化制备的疫苗抗原可以产业化生产。

在本方法中，包括但不限于无乳、停乳、乳房血清型金黄色葡萄球菌苗工作种子批株、BHI培养基用于疫苗原液规模化生产；也包括适用于当前和今后广泛流行的候选链球菌新优势菌株及THB等培养基介质；

(4)纯化的无乳、停乳、乳房等血清型链球菌乳房炎灭活荚膜多糖疫苗原液，用偶联剂与破伤风毒素蛋白(TT)、白喉毒素蛋白(DT)、无毒力白喉毒素蛋白(CRM197)或其他合适的载体蛋白分子；依Pr-L-Ps结构式偶联，其中，Pr是载体蛋白，Ps是奶牛链球菌荚膜多糖， L是共价键、或连接基团，且Ps∶Pr的质量比为0.5-3.5∶1；先采用溴化氢活化多糖，然后再采用碳二亚胺将活化的多糖与蛋白共价偶联；制备出奶牛链球菌奶牛乳房炎荚膜多糖结合蛋白抗原原液，TT或DT或CRM197载体蛋白与各血清型荚膜多糖结合蛋白都有好的交联效果，交联率达85％以上，由此TT或DT或CRM197均可作为该疫苗载体结合蛋白；

在本方法中，包括但不限于无乳、停乳、乳房血清型链球菌灭活荚膜多糖和TT、DT、CRM197交联载体蛋白；包括适用于当前和今后广泛流行链球菌野生株株、突变株荚膜多糖及其他载体蛋白；

(5)制备的有效剂量纯化奶牛乳房炎无乳、停乳、乳房血清型链球菌灭活全菌(比如1～10×10¹⁰CFU)、全菌(比如1～10×10¹⁰CFU)+荚膜多糖(比如10～60Ug)抗原、荚膜多糖结合蛋白抗原(比如40～60Ug/CPs-10～20Ug/TT或DT或CRM197)分别与常规用量的白花油、FIA、铝盐、MF59、SP01和SP02疫苗佐剂混均匀，制备奶牛链球菌乳房炎灭活全菌、全菌+荚膜多糖、荚膜多糖结合蛋白疫苗，分别免疫BALB/c、豚鼠、家兔和奶牛动物，间隔28天，皮下或肌肉或乳头管免疫2次，末次免疫14天采集血清、奶汁、脾淋巴细胞，观察奶牛产奶量与质量、体温、体重、体细胞计数、排细菌计数及ELISA、ELISPOT测定抗体效价、细胞免疫水平及死亡情况；试验结果可见，这几种佐剂可提升奶牛链球菌乳房炎灭活疫苗产生高效价抗体滴度、依次是白花油、不完全弗氏、SP01、MF59和铝盐佐剂，而SP01、SP02还产生了细胞免疫和黏膜免疫效应，且在不同动物呈现一致性趋势；由此SP01、SP01、MF59、白花油、不完全弗氏和铝盐均可有效的作为奶牛乳房炎灭活疫苗的佐剂；

在本方法中，包括但不限于SP01、SP02、MF59、白花油、FIA和铝盐佐剂中的一种或几种用于奶牛链球菌灭活疫苗的制备；包括适用于免疫刺激复合物、细胞因子、脂质体等佐剂制备奶牛链球菌乳房炎灭活疫苗；

(6)本发明的奶牛链球菌乳房炎灭活疫苗可不含有佐剂，也可以含有SP01、SP02、MF59、白花油、FIA和铝盐佐剂中的一种或几种，以有效剂量制备有或无佐剂的奶牛链球菌灭活单价、多价(无乳、停乳、乳房血清型)菌体(比如1～10×10¹⁰CFU)疫苗注射剂型；制备有或无佐剂的奶牛链球菌灭活单价、二价、三价、多价(无乳、停乳、乳房等血清型)菌体(比 如1～10×10¹⁰CFU)+荚膜多糖(比如10～60Ug)疫苗注射剂型；制备有或无佐剂的奶牛链球菌灭活单价、多价荚膜多糖结合蛋白(比如40～60Ug/CPs-10～20Ug/TT或DT或CRM197)疫苗注射剂型。

2.根据权利要求1所述的奶牛链球菌乳房炎灭活疫苗的制备方法，其特征是：奶牛链球菌乳房炎灭活疫苗注射剂型可皮下注射，也可以肌肉注射、乳头管注射、微针透皮免疫，也可以一种或几种联合，制备有或无佐剂的奶牛链球菌不同剂量灭活单价、二价、三价、多价灭活全菌疫苗、全菌+荚膜多糖疫苗、荚膜多糖结合蛋白疫苗，分别免疫BALB/c、豚鼠、家兔和奶牛动物，观察过敏性反应、异常毒性、热源质反应、一般毒性。结果表明：奶牛链球菌乳房炎灭活疫苗制品接种动物是安全的。

3.根据权利要求1所述的奶牛链球菌乳房炎灭活疫苗的制备方法，其特征是：奶牛链球菌乳房炎灭活疫苗有或无佐剂的灭活单价、、二价、三价、多价有效剂量的灭活全菌疫苗、全菌+荚膜多糖疫苗、荚膜多糖结合蛋白疫苗，分别免疫BALB/c、家兔和奶牛动物，通过量效、时效、次效测定抗体和细胞免疫水平以评价免疫原性；进一步在2-3岁即将进入泌乳期(即产前25d，怀孕8个月20d)健康奶牛，免疫剂量是灭活全菌疫苗(比如5×10¹⁰CFU)、灭活全菌+荚膜多糖(比如5×10¹⁰CFU+50UgCPs)、荚膜多糖结合蛋白(比如50UgCPs+20UgTT或DT或CRM197)疫苗，0，28，56天各免疫1次(即产前25天，产后3天、31天)，末次免疫后14天用1000CFU混合无乳、停乳、乳房链球菌野生菌株乳头管内注射攻毒，通过临床症状红肿热痛、体温、体重、奶汁产量质量、体细胞数、排细菌数、进食和死亡等指标评价免疫保护率。结果显示，制备的不管是皮下注射或是以肌肉或是乳头管注射、不管是单价或是、二价、三价、多价、不管是有佐剂或是无佐剂奶牛链球菌乳房炎灭活疫苗都有产生高效价抗体滴度，与剂量呈相关，且5×10¹⁰CFU、50UgCPs、20Ug TT或DT或CRM197达到平台期，加佐剂优于无佐剂组，多价好于单价，荚膜多糖好于灭活全菌疫苗类型，在不同动物有一致免疫应答趋势，加荚膜多糖可提高免疫保护率，在奶牛体内免疫保护率达到75％以上，可有效用于奶牛乳房炎的免疫预防。

4.根据权利要求1所述的奶牛链球菌乳房炎灭活疫苗的制备方法，其特征是：本发明的奶牛链球菌乳房炎灭活疫苗有或无佐剂的灭活单价、二价、三价、多价灭活全菌疫苗、全菌+荚膜 多糖疫苗、荚膜多糖结合蛋白疫苗制品，分别置于4℃、室温(20-25)℃和37℃，从外观、pH、蛋白含量、动物免疫原性等指标观察疫苗稳定性；结果显示，奶牛链球菌乳房炎灭活疫苗制品放置2～8℃稳定性良好，有效期2年。