CN106479910A - 一种产乳酸牛链球菌及其分离方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种产乳酸牛链球菌，其核苷酸包括SEQ NO.1所示序列，以及该牛链球菌的分离方法如下：1)制备含有可溶性淀粉的富集培养基液，并将其高温灭菌除氧后密封冷却，调节pH为6.5到6.8；2)将无菌厌氧采集的菌源按照1：30～70的比例与步骤1)中制备所得的富集培养基液混合于厌氧培养容器中，于37℃震荡培养至少24小时后，竖立厌氧培养容器，继续静置培养至少24小时；3)制备分离培养基，高温灭菌除氧后在厌氧环境下冷却，调节pH为6.5到6.8后浇板；4)挑取步骤2)中培养容器中的沉淀物，涂布于分离培养板,在厌氧条件下37到39℃避光培养24到36小时，挑选表面湿润、有光泽、颜色为乳白色的圆滴状菌落，进行分离培养。该方法分离简单高效、选择性较强。

Description

一种产乳酸牛链球菌及其分离方法

技术领域

本发明涉及一种牛链球菌，尤其涉及一种能够利用淀粉发酵产出混合酸的产乳酸牛链球菌，以及该菌的体外分离方法，属于微生物技术领域。

背景技术

牛链球菌(Streptococcus bovis)是瘤胃主要的乳酸产生菌，在饲喂高精料饲粮导致瘤胃乳酸中毒的重要诱因。从反刍动物瘤胃中分离培养牛链球菌，研究其发酵产酸通路及主要影响因素将为寻找抑制其乳酸产生的方法(如：抑制型添加剂的研发等)提供理论参考，从而在生产上达到通过调控牛链球菌乳酸的产生来缓解反刍动物瘤胃乳酸中毒的目的。另外，利用牛链球菌产生混合酸的特点，可以将分离的瘤胃源牛链球菌用于反刍动物青贮饲料发酵，改进单纯使用乳酸菌作为发酵菌株的单一化的发酵模式。

目前，有关牛链球菌的研究主要集中在检测瘤胃酸中毒情况下牛链球菌菌群数量变化情况。Wang,et al.研究结果发现，牛链球菌的数量在瘤胃酸中毒后剧增，直接揭示了其在诱导瘤胃酸中毒中的关键作用(Wang H,Pan X,Wang C,et al.Effects of differentdietary concentrate to forage ratio and thiamine supplementation on the rumenfermentation and ruminal bacterial community in dairy cows[J].AnimalProduction Science,2015,55(2):189-193)。国外，特别是欧洲国家借助于高效的细菌库资源共享平台，研究开发了诸如莫能菌素等有效杀灭瘤胃牛链球菌的抗生素制剂(McGuffey R K,Richardson L F,Wilkinson J I D.Ionophores for dairy cattle:current status and future outlook[J].Journal of Dairy Science,2001,84:E194-E203)，以及有效刺激反刍动物产生抗牛链球菌抗体的疫苗等(Shu Q,Bird S H,Gill H S,et al.Immunological cross-reactivity between the vaccine and other isolatesof Streptococcus bovis and Lactobacillus[J].FEMS Immunology&MedicalMicrobiology,1999,26(2):153-158)，为在生产中预防和治疗瘤胃酸中毒提供了可行的解决方案。然而，由于牛链球菌能够感染人类引起相关炎症反应，使得从国外引进相关菌株存在一定风险，并且引进成本较为高昂。

国内相关实验室开展了从瘤胃中分离培养牛链球菌的工作，但相关成功案例报道并不多见，主要是因为：(1)难营造严格厌氧环境：瘤胃源牛链球菌为厌氧菌，厌氧菌对分离、培养的厌氧环境要求较为严格，即使微量混入氧气不会导致其死亡，但长期可能具有引起其分 化突变的可能，从而使得其厌氧下的部分功能丧失；(2)分选培养基没有选择性：分选培养基多以葡萄糖为能源，可以被几乎瘤胃所有细菌利用，部分与牛链球菌拮抗的细菌具有更强的葡萄糖竞争能力，从而抑制甚至产生毒害物质杀灭牛链球菌，导致牛链球菌的体外分离效率很低；(3)对牛链球菌菌斑特征的不熟悉，导致筛选过程中的漏选。

发明内容

本发明的目的在于提供一种产乳酸牛链球菌，该菌可以有很好地利用淀粉发酵产混合酸。

本发明的目的还在于提供一种产乳酸牛链球菌的分离方法，该方法简单高效、选择性较强，解决了厌氧且具发酵淀粉产生乳酸的牛链球菌菌株分离没有特异性、分离效率低的难题。

本发明的目的还在于提供上述产乳酸牛链球菌及其分离方法的应用。

为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：

本发明提供了一种产乳酸牛链球菌，其核苷酸序列包括如序列表中所示SEQNO.1。

本发明提供了一种如上所述的产乳酸牛链球菌的分离方法，主要包括如下步骤：

(1)制备富集培养基液：

以水为溶质，向其中加入质量比为1.0％蛋白胨，0.5％酵母提取物，1.0％牛肉提取物，1.0％可溶性淀粉，0.2％K₂HPO₄，0.1％吐温80，0.02％MgSO₄·7H₂O，0.005％MgSO₄·H₂O，0.2％柠檬酸铵，0.5％C₂H₃NaO₂，并向其中加入刃天青钠(终浓度为20mg/L)，作为厌氧指示剂，在将配置的富集培养基液高温灭菌除氧后密封冷却，调节pH为6.5到6.8。优选地，将配置的富集培养基液放于高压灭菌锅中115到121℃高压灭菌至少15分钟充分除氧后取出密封冷却。在富集培养基液组分中，以可溶性淀粉为唯一能源，使得无法利用淀粉的其他菌在富集培养基液中生长缓慢，而牛链球菌可以利用淀粉，迅速增殖，形成优势菌群。

(2)菌源稀释

将无菌厌氧采集的菌源按照1：30～70的比例与步骤(1)中所制备获得的富集培养基液混合于厌氧培养容器中，于37℃震荡培养至少24小时后，竖立厌氧培养容器，继续静置培养至少24小时。

(3)制备固体分离培养基

以水为溶质，向其中加入质量比为1.0％蛋白胨，0.5％酵母提取物，1.0％牛肉提取物，1.0％可溶性淀粉，0.2％K₂HPO₄，0.1％吐温80，0.02％MgSO₄·7H₂O，0.005％MgSO₄·H₂O，0.2％柠檬酸铵，0.5％C₂H₃NaO₂，并向其中加入1.5％琼脂糖，将配置的分离培养基高温灭菌除氧后在厌氧环境下冷却，调节pH为6.5到6.8后浇板。优选地，将配置的分离培养基放于高压灭菌 锅中115到121℃高压灭菌至少15分钟后立即取出转移至厌氧工作站中冷却，调节pH为6.5到6.8，并浇板。

(4)细菌的分离纯化

吸弃步骤(2)中的培养容器中的培养液，保留沉淀物。因为牛链球菌菌体呈白色，且产乳酸后会发生聚集沉降。挑取少许沉淀，涂布于分离培养浇筑的培养板,优选琼脂培养板上，在厌氧条件下37到39℃避光培养24到36小时，挑选表面湿润、有光泽、颜色为乳白色的圆滴状菌落，进行产乳酸生化管鉴定和革兰氏染色鉴定，选择鉴定结果为产乳酸阳性及革兰氏阳性的菌落进一步转移至新的平板中分离培养。优选地，重复本步骤4次，分离得到纯菌株。

本发明还提供了如上所述的产乳酸牛链球菌及其分离方法在开发牛链球菌疫苗以及新型饲料发酵菌剂方面的应用。

本发明的技术方案的有益效果是：

1)本发明提供的产乳酸牛链球菌的体外分离方法，能够简单高效、选择性较强地分离和筛选牛链球菌菌株。其中，以可溶性淀粉为唯一能源，使得无法利用淀粉的其他菌在富集培养基中生长缓慢，而使得牛链球菌可以利用淀粉，迅速增殖，形成优势菌群，相比于以葡萄糖作为能源的现有技术，本发明提供的分离方法对牛链球菌的选择性更强；此外，在菌源稀释步骤中，不同于现有技术中常用的“稀释富集培养液，然后接种到平板上”的分选方法，本发明中采用了竖立静置至少24小时的方法，通过竖立使得牛链球菌发生聚集下沉，并产生乳酸等形成粘液胶状白色沉淀，长时间的静置使得聚集下沉到底部，形成白色沉淀，以便进一步分选链球菌是直接挑选白色沉淀物进行分离培养，从而使得分选方法的目的性更强；另外，至少24小时的静置，使得牛链球菌发酵产生更多乳酸，pH进一步降低到4.5左右，此时几乎所有细菌都无法耐受此低pH而尽数死亡，但牛链球菌能耐受低pH，因此不会死亡，从而使得分离的选择性更强。本发明提供的产乳酸牛链球菌的体外分离方法解决了发酵淀粉产生乳酸的厌氧牛链球菌菌株分离困难、分离效率低的难题；

2)分离得到的牛链球菌菌株纯度和活力较高，能够用于体外研究瘤胃酸中毒条件下其产酸通路的变化；另外，分离得到的菌株具有发酵淀粉产混合酸的能力，将为反刍动物青贮饲料发酵提供新型发酵菌种，具有一定的经济效益。

附图说明

图1是S1环境扫描电镜图。

图2是S1革兰氏染色图。

图3是S1产酸LC-MS/MS定性图。

图4是S1生长于富含葡萄糖培养基生长曲线图。

图5是S1PCR产物电泳图。

图6是S1测序峰图。

图7是S1系统发育树图。

具体实施方式

为了阐明本发明的技术方案及技术目的，下面结合附图及具体实施方式对本发明做进一步的介绍。

实施例1

本实施例1提供了一种产乳酸牛链球菌的分离方法，具体包括以下步骤：

(1)菌源获取

以饲料精粗比为7:3的饲粮饲喂扬州大学实验农牧场健康成年带瘤胃瘘管萨能奶山羊15天，诱导其产生酸中毒，采用专利号为ZL201520957016.1的授权专利技术，厌氧无菌采集、过滤瘘管的萨能奶山羊瘤胃液，装入无菌厌氧密封袋中并密封。

(2)制备富集培养基

称取蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g，牛肉提取物10.0g，可溶性淀粉10.0g，K₂HPO₄2.0g，吐温80 1.0g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，MgSO₄·H₂O 0.05g，柠檬酸铵2.0g，C₂H₃NaO₂ 5.0g后，将其溶于1L超纯水中，并向其中滴加20μl 0.1％(质量分数)的刃天青钠，放于高压灭菌锅中121℃高压灭菌15分钟后取出密封冷却，调节pH为6.8。

(3)菌源稀释、运输和保存

将无菌厌氧采集的瘤胃液按照1：50的比例与步骤(2)富集培养基混合于厌氧培养瓶中，置于37℃保温运输,送入实验室并继续放置于37℃保温箱中震荡培养24小时后，树立厌氧培养瓶，继续静置培养24小时。

(4)制备分离培养基

称取蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g，牛肉提取物10.0g，可溶性淀粉10.0g，K₂HPO₄2.0g，吐温80 1.0g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，MgSO₄·H₂O 0.05g，柠檬酸铵2.0g，C₂H₃NaO₂5.0g后，将其溶于1L超纯水中，并向其中加入15.0g琼脂糖，放于高压灭菌锅中121℃高压灭菌15分钟后立即取出转移至厌氧工作站中冷却、调节pH为6.8，浇板。

(5)细菌的分离纯化

取出静置培养后的培养瓶，吸弃培养液，保留底部白色沉淀。因为牛链球菌菌体呈白色，且产乳酸后会发生聚集沉降。用接种棒挑取少许白色沉淀，采用划线法均匀涂布于琼脂培养板上，在厌氧工作站中37-39℃避光培养24-36小时，挑选表面湿润、有光泽、颜色为乳白色的圆滴状菌落，进行产乳酸生化管鉴定和革兰氏染色鉴定，选择鉴定结果为产乳酸阳性及革兰氏阳性的菌落进一步转移至新的平板中分离培养，重复以上过程4次，分离得到纯菌株。

(6)制备保存培养基

称取蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g,牛肉提取物10.0g，可溶性淀粉5.0g，葡萄糖5.0g，K₂HPO₄ 2.0g，吐温80 1.0g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，MgSO₄·H₂O 0.05g，柠檬酸铵2.0g，C₂H₃NaO₂ 5.0g后，将其溶于1L超纯水中，放于高压灭菌锅中121℃高压灭菌15分钟后，立即取出转移至厌氧工作站中冷却，调节pH为6.8，后与等体积的无菌液态甘油1:1等体积混匀，高速搅拌机均质，分装于细胞冻存管备用。

(7)纯化后的细菌保存

用接种棒挑出纯菌株的菌落，转至含保存培养基的冻存管中，旋盖密封，并涡旋震荡30秒，投入液氮速冻，随后再转移至-80℃超低温冰箱长期保存。

实施例2

本实施例2中，对上面实施例1中分离的菌落进行了系统鉴定。

(1)形态学鉴定

菌落形态学观察发现牛链球菌新菌株S1菌落为乳白色，湿润，有光泽，圆滴状。将生长在琼脂平板上的菌落连同琼脂一起挖出，放入2％戊二醛固定4小时，取出冷冻干燥后，采用培养基及菌体一起固定技术在环境扫描电镜下观察发现，S1菌株呈球形，直径在1μm左右，多个细胞首尾相连呈链状(图1)。其中，培养基及菌体一起固定技术(即：在琼脂平板上的菌落连同琼脂一起挖出，放入2％戊二醛固定4小时，而不是用戊二醛冲洗菌落)，避免了使用传统方法将菌落挑选后涂布于样品台观察时，在挑菌过程中机械性的挑选使得链状连接断裂。

(2)理化性质鉴定

参照《伯杰细菌鉴定手册》进行革兰氏染色和理化特征鉴定。革兰氏结果显示呈阳性(图2)；产酸结果显示产乳酸、甲酸、乙酸等(图3)。结合《伯杰细菌鉴定手册》对牛链球菌的界定，初步得出S1菌株为能够发酵淀粉产酸的牛链球菌菌株。

(3)增殖性能鉴定

将S1菌株接种到pH为6.8的含葡萄糖10.0g/L(不含可溶性淀粉)的富集培养液中，该菌株能够利用葡萄糖快速增值，分批培养8小时达到增殖平台期(图4)。

(4)16S rRNA基因组鉴定

取处于对数生长期的S1菌株菌液2mL，用上海生工Ezup柱式细菌基因组提取试剂盒提取该S1菌株DNA，用作菌株16S rRNA基因扩增模板。通过Primer 6软件设计扩增引物为：F：ATACATAGCCGACCTGAGA(SEQ NO.2)，R：CCTACAATCCGAACTGAGAT(SEQ NO.3)，交由上海生工合成。PCR反应体系为25μL：10x Taq-buffer 2.5μL,dNTPs(2.5mmo l/L)1μL,Ex Taq酶0.2μL，F和R引物(10uM)各0.5μL,灭菌三蒸水19.8μL，因组模板0.5μL。其扩增反应条件为:94℃预变性4min；94℃变性45s，55℃复性45s，72℃延长1min，循环30次；72℃修复延伸10min。

PCR产物经过1％琼脂糖凝胶电泳检验扩增片段是否是目的片段。结果显示为1500bp左右的目的片段(图5)。确定为目的片段后，PCR产物电泳条带切割所需DNA目的条带，纯化方式依照说明书步骤进行，纯化后的PCR产物用PCR引物直接测序。测序谱峰图中各峰稳定，无重合峰出现，说明用于测序的菌株较为纯净(图6)。测序结果序列经过与现有的牛链球菌菌株比对发现，S1菌株与已报道的猪源ATCC27960(登录号：AB002481.1)瘤胃源JB1(登录号：AF104109.1)菌株同源性高(图7)，共属于链球菌属，牛链球菌种。该S1菌株测序序列数据已被NCBI的GenBank数据库收录，登录号为：KU853019.1(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/KU853019.1)。

实施例3：

本实施例3中，对牛链球菌S1进行了发酵可溶性淀粉产甲酸、乙酸和乳酸分析。

取2ml对于对数生长期的S1菌株，接种到含100ml富集培养基(只提供1g/L可溶性淀粉作为碳源，其他成分不变)的厌氧瓶中，37℃水浴，滴加NaOH保持发酵环境pH恒定为6.5，于摇床中培养13小时采集发酵液，测定甲酸、乳酸以及乙酸的产生量，结果显示(表1)：该培养条件下产甲酸、乙酸和乳酸在总酸体系中分别占7.10％、18.66％和74.24％。为发酵可溶性淀粉产混合酸，具有利用其作为青贮饲料发酵剂的应用前景。

表1：S1控pH发酵产甲酸、乳酸和乙酸量

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，本发明要求保护范围由所附的权利要求书、说明书及其等效物界定。

Claims (7)

1.一种产乳酸牛链球菌，其特征在于，所述产乳牛链球菌的核苷酸包括如序列表中SEQNO.1所示之序列。

2.一种如权利要求1所述的产乳酸牛链球菌的分离方法，其特征在于，主要包括如下步骤：

(1)制备富集培养基液：

以水为溶质，向其中加入质量比为1.0％蛋白胨，0.5％酵母提取物，1.0％牛肉提取物，1.0％可溶性淀粉，0.2％K₂HPO₄，0.1％吐温80，0.02％MgSO₄·7H₂O，0.005％MgSO₄·H₂O，0.2％柠檬酸铵，0.5％C₂H₃NaO₂，并向其中加入终浓度为20mg/L的刃天青钠，在将配置的富集培养基液高温灭菌除氧后密封冷却，调节pH为6.5到6.8；

(2)菌源稀释：

将无菌厌氧采集的菌源按照1：30～70的比例与步骤(1)中所制备获得的富集培养基液混合于厌氧培养容器中，于37℃震荡培养至少24小时后，竖立厌氧培养容器，继续静置培养至少24小时；

(3)制备固体分离培养基：

以水为溶质，向其中加入质量比为1.0％蛋白胨，0.5％酵母提取物，1.0％牛肉提取物，1.0％可溶性淀粉，0.2％K₂HPO₄，0.1％吐温80，0.02％MgSO₄·7H₂O，0.005％MgSO₄·H₂O，0.2％柠檬酸铵，0.5％C₂H₃NaO₂，并向其中加入1.5％琼脂糖，在将配置的分离培养基高温灭菌除氧后在厌氧环境下冷却，调节pH为6.5到6.8后浇板，制得分离培养板；

(4)细菌的分离纯化：

吸弃步骤(2)中的培养容器中的培养液，保留沉淀物；挑取少许沉淀，涂布于步骤3)中制备的分离培养板,在厌氧条件下37到39℃避光培养24到36小时，挑选表面湿润、有光泽、颜色为乳白色的圆滴状菌落，进行产乳酸生化管鉴定和革兰氏染色鉴定，选择鉴定结果为产乳酸阳性及革兰氏阳性的菌落进一步转移至新的平板中分离培养。

3.一种如权利要求2所述的产乳酸牛链球菌的分离方法，其特征在于，在步骤(1)中，将配置的富集培养基液放于高压灭菌锅中115到121℃高压灭菌至少15分钟充分除氧后取出密封冷却。

4.一种如权利要求2或3所述的产乳酸牛链球菌的分离方法，其特征在于，在步骤(3)中，将配置的分离培养基放于高压灭菌锅中115到121℃高压灭菌至少15分钟后立即取出转移至厌氧工作站中冷却。

5.一种如权利要求4所述的产乳酸牛链球菌的分离方法，其特征在于，在步骤(4)中，优选地，重复本步骤4次，分离得到纯菌株。

6.一种如权利要求2所述的产乳酸牛链球菌的分离方法，其特征在于，在步骤(4)中，优选地，重复本步骤4次，分离得到纯菌株。

7.如权利要求1所述的产乳酸牛链球菌或者如权利要求2所述的产乳酸牛链球菌的分离方法在开发牛链球菌疫苗以及新型饲料发酵菌剂方面的应用。