CN101348769B - 一种H+-ATP酶耐酸基因atpA’和包括该基因的干酪乳杆菌 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种H⁺-ATP酶耐酸基因atpA’和包括该基因的干酪乳杆菌。所述干酪乳杆菌是从酸马奶中分离的耐酸型干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei Zhang)，该菌菌株的保藏号为：CGMCC No.1697。所述基因是从所述干酪乳杆菌中分离的，是H⁺-ATP酶α亚单位的部分基因；并且对该基因进行了克隆和测序。本发明的干酪乳杆菌可用作食品，特别是乳制品发酵用的生产菌株。本发明的耐酸基因可用于乳酸菌益生菌株的筛选和遗传改造。

Description

一种H+-ATP酶耐酸基因atpA’和包括该基因的干酪乳杆菌

技术领域

本发明涉及一种H⁺-ATP酶耐酸基因atpA’(H⁺-ATP酶的α亚单位部分基因)和包括该基因的干酪乳杆菌。

技术背景

乳酸菌是人体肠道中正常菌群之一，当达到一定数量时，能够调节宿主体内微生物菌群的平衡，对宿主的健康有一定促进作用。因此，能否在人体肠道中的低pH值，高胆汁酸中存活是有益菌群面对的首要挑战，同时也是进行益生菌筛选的先决条件。另外，能否在不断降低的酸性环境中保持较高的活性，也是筛选性质优良乳酸菌发酵剂的标准之一。

人们对于乳酸菌耐酸机理进行了许多有益的探索和研究。其中，质子原动力透性转移酶系统(PMF)认为，H⁺-ATP酶作为胞膜结合蛋白酶，其作用为通过消耗胞体内的ATP，将胞内质子(H⁺)泵出胞外，以保持胞内pH值中性。与此同时，产生胞膜质子原动力，因此，称其为质子移位膜ATP酶(proton translocationg ATPase)。H⁺-ATP酶水平的提高通过膜上功能单元(F₁F₀复合体)的增加而获得。pH值的调节是通过依靠于细胞质pH值的H⁺-ATP酶的数量和活性的改变而调节。F₁F₀复合体具有氧化特性或光磷酸化作用。该系统主要在酸性环境中发生作用的低亲和力系统，转运物为葡萄糖。乳酸菌依靠该系统可将葡萄糖和其它溶质逆浓度梯度通过胞膜上的载体蛋白，即透性酶由胞外转至胞内，同时还伴有氢离子向胞内的转移。该复合体全长为7kb左右。由两部分组成：形成质子通道的胞膜结合部分(F₀)和包含ATP水解结合部位的胞浆部分(F₁)。F₁包含5个亚单元(δ，α，γ，β，ε)，F₀包含3个亚单元(c，a，b)  (图1)。 其中，F₁高度保守，F₀是低度保守的。在所有这些亚单元中，F₁中的α、γ、β是高度的同源性，而与膜连接的F₀具有较低的同源性。F₁的一部分-δ呈现出最低的同源性。F₁F₀-ATP复合体的基因顺序为atpE，atpB，atpF，atpH，atpA，atpG，atpD，atpC，这些基因分别编码亚单元c，a，b，δ，α，γ，β，ε。通过与其它乳酸菌的启动子相比较，发现atp启动子和rrnA启动子(rRNA操纵子)有较高的同源性。

因此，了解耐酸干酪乳杆菌H⁺-ATP酶与其耐酸性能间的关系，探索乳酸菌耐酸可能的分子机制，可为乳酸菌益生菌株的筛选、遗传改造和应用提供基础性的研究材料。

发明内容

本发明人针对上述课题，以酸马奶中的乳酸菌为目标菌群，采用特定的筛选方法，从内蒙古民族传统乳制品——酸马奶中筛选出耐酸菌株，并进一步研究了该耐酸菌株中H⁺-ATP酶与其耐酸性能之间的关系。

本发明的目的之一是提供一种耐酸型干酪乳杆菌(Lactobacillus caseiZhang)及其筛选方法。

本发明的目的之二是对耐酸型干酪乳杆菌(Lactobacillus casei Zhang)中H⁺-ATP酶保守编码亚单位α亚单位——H⁺-ATP酶耐酸基因atpA’的克隆和测序。

本发明的目的之三是通过RT-PCR确定H⁺-ATP酶与干酪乳杆菌耐酸性能之间的关系。

本发明的干酪乳杆菌(Lactobacillus casei Zhang)已于2006年4月21日，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址为中国北京市朝阳区大屯路，国家专利局指定专利微生物保藏中心)，保藏号：CGMCC No.1697。

本发明技术方案的实现途径如下：

本发明提供了一种干酪乳杆菌，所述干酪乳杆菌(Lactobacillus caseiZhang)是从酸马奶中分离的耐酸型益生菌；该菌菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏号：CGMCCNo.1697。

本发明还提供了从所述干酪乳杆菌中分离的耐酸基因atpA’，该基因是H⁺-ATP酶α亚单位的部分基因，并且对该基因进行了克隆和测序。

本发明还提供了一种耐酸型干酪乳杆菌菌株的筛选方法，包括：

a.以天然酸马奶为样品，从中分离鉴定得到50株乳杆菌，经过分析鉴定后制成乳杆菌菌液；

b.吸取所述乳杆菌悬浮液10μl接种于5mL pH3.5的MRS液体培养基中，置于37℃条件下进行24小时培养，同时吸取乳杆菌悬浮液1.0mL与9.0mL pH3.0的人工胃液混合后，置于37℃条件下培养，分别在培养开始时间0小时和培养3小时后取样。

c.用BCP琼脂培养基测定活菌数，筛选出具有高耐酸性生长能力的乳杆菌菌株，并进一步测定所述乳杆菌菌株在不同人工胃液和肠液中的存活能力，以及通过体外耐胆盐试验和降低胆固醇试验，由此获得耐酸型干酪乳杆菌。

本发明还提供了H⁺-ATP酶基因α亚单位——H⁺-ATP酶耐酸基因atpA’的克隆方法，包括：

a.查询GeneBank，找到已公布的相关序列进行H⁺-ATP酶基因α亚单位的引物设计；

b.对上述新鲜干酪乳杆菌进行PCR扩增，从而得到目的片段；

c.对目的片段进行琼脂糖凝胶回收以及基因克隆，并将克隆片段送往基因公司进行测序。

本发明还提供了H⁺-ATP酶耐酸基因atpA’在不同酸度条件下的表达方法，包括

a.将所述干酪乳杆菌的新鲜菌液分别于pH4.0，5.0，6.5的条件下培养；

b.于对数生长期提取RNA，进行RT-PCR；

c.扩增产物进行琼脂糖电泳检测，并根据扩增条带绘制柱状图。

本发明还研究了所述克隆基因在不同酸度条件下，在所述干酪乳杆菌中表达的差异。

本发明还提供了人工胃液和人工肠液的制备方法：

人工胃液：NaCl 0.2％、胃蛋白酶0.35％，用1mol/L HCl调整pH值为3.0后，过滤，除菌，备用。

人工肠液：将下述a液和b液以2∶1混合即为人工肠液。

a.胰腺液：重碳酸钠1.1％、NaCl 0.2％、胰蛋白酶(Trypsin，sigma)0.1％，调整pH为8.0后，过滤，除菌，备用。

b.胆汁液：Bile Salts(Difco)1.8％，调整pH为8.0后，过滤，除菌，备用。

本发明的干酪乳杆菌(Lactobacillus casei Zhang)具有较强的耐性和耐酸生长特性，能够耐受人工胃肠消化液，尤其在脱脂乳液中能够耐受pH2.0的人工胃液。因此，可将其用作食品，特别是乳制品的发酵剂。

对所述干酪乳杆菌中H⁺-ATP酶基因α亚单位的克隆及表达表明，在所述干酪乳杆菌中H⁺-ATP酶耐酸基因atpA’的表达与该菌株的耐酸性能是有一定关系的。因此，可用于乳酸菌益生菌株的筛选、遗传改造。

附图说明

图1为ATP操纵子的基因结构和DNA片段；

图2为本发明干酪乳酸菌L.casei Zhang对人工胃肠液的耐受性图；

图3为本发明发酵乳中L.casei Zhang对人工胃肠液的耐受性图；

图4为本发明干酪乳酸菌L.casei Zhang总基因组DNA提取流程图；

图5为本发明克隆所得目的基因片段的回收与鉴定流程图；

图6为本发明目的片段克隆所需感受态细胞的制备流程图；

图7为本发明目的片段质粒转化流程图；

图8为本发明转化菌落的PCR鉴定与培养流程图；

图9为本发明编码干酪乳杆菌L.casei Zhang中H⁺-ATP酶耐酸基因atpA’的核苷酸和编码蛋白序列；

图10为本发明干酪乳杆菌L.casei Zhang，ZL3-1，ZL3-2总RNA提取流程图；

图11为本发明干酪乳杆菌L.casei Zhang在不同酸度条件下的生长曲线图；

图12为本发明干酪乳杆菌L.casei Zhang不同循环次数扩增H⁺-ATP酶基因，GAPDH产物电泳图；

图13为本发明干酪乳杆菌L.casei Zhang在不同酸度条件下H⁺-ATP酶耐酸基因atpA’RT-PCR电泳图；

图14为本发明干酪乳杆菌L.casei Zhang在不同酸度条件下H⁺-ATP酶耐酸基因atpA’表达柱状图(n＝3)。

具体实施方式

下面将结合具体实施例对本发明做更详细的说明。

实施例1：干酪乳杆菌(Lactobacillus casei Zhang)的耐酸性及其在人工胃肠液中的耐受性分析。

从酸马奶样品中分离鉴定的50株乳杆菌中，经过pH3.5的MRS液体培养基中生长试验及在pH3.0人工胃液中的存活率测定，筛选到1株耐酸性极强的乳杆菌，即干酪乳杆菌(Lactobacillus casei Zhang)。

将Lactobacillus casei Zhang进行pH3.5的MRS液体培养基中生长试验及其在pH3.0人工胃液中的存活率测定实验，其结果见表1。

表1 Lactobacillus casei Zhang在pH3.5及pH3.0人工胃液中生长情况

注：表中菌数均为两次实验的平均值。

L.casei Zhang，经过pH2.0、pH3.0和pH4.0的人工胃液作用3小时后，随即分别接入pH8.0的人工肠液，作用0小时、3小时、6小时、24小时后的活菌数变化结果，如图2所示。

将本发明的L.casei Zhang，接种到10％脱脂乳中，置37℃培养凝乳后，按比例与不同pH值的人工胃液混合，于37℃处理3小时，然后，转接到pH8.0的人工肠液中，随时间推移测定其活菌数变化，如图3所示。

结果显示，L.casei Zhang具有极强的耐酸特性和耐受人工胃肠液的能力，尤其在脱脂乳中时能够耐受pH2.0的人工胃液而存活率未见降低。

实施例2：L.casei Zhang中H⁺-ATP酶基因α亚单位的部分基因——H⁺-ATP酶耐酸基因atpA’的克隆和测序。

α亚单位在H⁺-ATP酶基因的构成结构中是高度保守的，可通过对于该目的片段的扩增得到所需基因。

本发明测序得到的片段，经过同源性比较证实为H⁺-ATP酶基因α亚单位的部分编码片段。

1、实验方法

1.1PCR引物设计与合成

PCR引物根据GeneBank提供的相关序列(Accession No：NZ_AAGR01000077)采用Primer Primer 5.0自行设计，由上海桑尼生物 科技有限公司合成。

F：5′-ATGGTGCGATGGATTAT-3′；

R：5′-AACACGGGAAACAGAAG-3′。

1.2干酪乳杆菌DNA的提取。

采用CTAB法提取菌株基因组DNA(图4)。

将冷冻保存的菌株L.casei Zhang接种于MRS液体培养基中，置37℃培养24小时，经MRS培养液传代培养2～3次后，取1.5ml对数生长末期的菌体培养物，5,000rpm离心1分钟收集菌体，去尽培养液。在沉淀中加入500μl的TE缓冲液，用吸管反复吹打，使之重悬。然后加入50μl10％SDS(w/v)和10μl 10mg/ml蛋白酶K，混匀，于55℃摇床过夜消化。再加入100μl 10mol/L CTAB溶液(4.1g NaCl溶于80ml水中缓慢加入CTAB 10g)及100μl浓度为5mol/L NaCl溶液，混匀，65℃水浴保温10分钟，得到粗提取液。在此粗提取液中加入等体积(一般为700μl)的苯酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1，v/v)，颠倒混匀，12,000rpm离心5分钟；取上清，并加入等体积氯仿/异戊醇(24∶1，v/v)，颠倒混匀，12,000rpm离心5分钟，弃下层。在所得到的上清液中，加入500μl预冷异丙醇，轻轻混合，直到DNA沉淀下来，室温下静止10分钟，12000rpm离心5分钟，弃去上清，得到DNA沉淀。用1ml 70％的乙醇(v/v)洗涤DNA沉淀1次。清除酒精，吸干DNA，加100μl TE缓冲液溶解DNA，于55℃保温助溶，20分钟后取出冷却。加入5μl 4mg/ml RNase于37℃水浴30分钟。而后加入400μl TE缓冲液以及500μl苯酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1，v/v)，颠倒混匀，12，000rpm离心5分钟；取上清，并加入等体积氯仿/异戊醇(24∶1，v/v)，颠倒混匀，12,000rpm离心5分钟，弃下层。在所得到的上清液中，加入0.1倍体积3M NaAC，轻轻混匀后加入500μl预冷异丙醇，轻轻混合，直到DNA沉淀下来，室温下静止10分钟，12000rpm离心5分钟，弃去上清，得到DNA沉淀。用1ml 70％的乙醇(v/v) 洗涤DNA沉淀1次。清除酒精，吸干DNA。最后用30～50μl灭菌去离子水溶解DNA，于55℃，保温20分钟，助溶后，置于-20℃保存。

1.3目的片段的PCR扩增

PCR扩增体系：0.2μl Taq聚合酶(5U/μl，Takara Tokyo，Japan)，2.5μl10×PCR缓冲液(不含Mg²⁺)，2μl dNTP(各2.5mM)，2μl MgCl₂(25mM)，0.2μl正向引物(50pM)，0.2μl反向引物(50pM)，1μl DNA产物(100ng/μl)和17.4μl ddH₂O。

PCR扩增条件：97℃变性5分钟；95℃30秒→55℃30秒→72℃1分钟，如此进行35次循环；72℃延伸10分钟，4℃保存。

1.4琼脂糖凝胶电泳检测

取PCR产物5μl，与1μl上样缓冲液混合均匀，点样于琼脂糖凝胶孔中，在另一孔中加入5μl DL2000Marker，5V/cm电压下，电泳30分钟。电泳结束后，在凝胶成像系统GDS-8000 System(UVP Biomaging Systems)上留取照片。

1.5目的基因片段回收与鉴定

片段回收按上海华舜小量胶回收试剂盒说明进行(图5)。

在紫外灯下迅速将含目的片段条带的琼脂糖块割下，放入1.5ml的离心管中。按每100mg琼脂糖加入300-600μl S1液的比例加入S1液，置55℃水浴中10分钟，使琼脂糖块完全溶化，每2分钟颠倒混匀一次。加入1/3S1体积的异丙醇，混匀，55℃温浴1分钟。将溶化后的琼脂糖块移入吸附柱，离心1分钟。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。在吸附柱中加入450μl W1液，静置1分钟后，离心15秒。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。在吸附柱中加入450μlW1液，离心15秒后倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。离心1分钟。将吸附柱放入一个干净的1.5ml的离心管中，在吸附柱的中央加30μl T1液，静置1分钟后，离心1分钟。最后吸取2-4μl溶液， 在紫外分光光度计上测定比值和浓度后，将1.5离心管中DNA贮存于-20℃下。

1.6目的基因片段的克隆与鉴定

1.6.1感受态细胞的制备

挑取JM109大肠杆菌原种，LB琼脂板上划线。过夜培养后挑取新鲜单菌落，接种到100ml LB培养基中，37℃摇菌培养2-3小时(160转/分钟)，至OD₆₀₀达到0.4-0.5时将菌液移至灭菌预冷的100ml离心管中，冰浴10-15分钟。4,000rpm，4℃离心10分钟，回收细菌沉淀。加入20ml经过过滤除菌并经预冷的0.1M CaCl₂，悬浮细菌沉淀。冰浴10-15分钟后于4,000rpm，4℃离心10分钟，回收细菌沉淀。加入4ml 0.1M CaCl₂悬浮细菌沉淀。该细胞可直接用于转化实验。加甘油至终浓度为15％-20％，混匀，每份分装成100μl于1.5ml EP管中，冻存于-70℃冰箱中(图6)。

1.6.2回收片段与T载体的连接

连接用TaKaRa pMD 18-T Vector试剂盒。

操作过程如下：

首先在EP管中制备下列连接反应液：

pMD 18-T Vector(50ng/μl)    0.5μl

DNA                          20-40ng

溶液1                        5μl

加dH₂O至                     10μl

总计                         10μl

将上述反应液在16℃反应过夜，产物用于转化感受态细胞。

1.6.3质粒的转化

从-70℃冰箱中取出保存的感受态细胞，冰浴助溶。将100μl感受态细胞加入10μl连接产物，冰浴30分钟后于42℃水浴热应激90秒钟，立即置入冰浴中2分钟。加入400μl液体LB培养基，37℃复活50分钟后 取100μl铺于LB平板上，平板含0.1(V/V)的氨苄青霉Amp(100mg/ml)、X-gal(100μg/ml)和IPTG(1mM)。最后于37℃恒温培养10-15小时。白色菌斑应含重组质粒(图7)。

1.6.4转化菌落的PCR鉴定与培养

用记号笔标记转化培养的单菌落，用灭菌的牙签蘸取白色单菌落。

将牙签头放入在加有PCR反应液(不含模板)的EP管中晃动，进行PCR扩增。将PCR产物同标记物(Marker)一起进行琼脂糖凝胶电泳，鉴别T载体上是否含有目的片段。得到目的片段后，用灭菌枪头挑取在平板上的与之对应的单菌落，放入40ml含0.1％(V/V)青霉素钠(100mg/ml)的LB液体培养基中，37℃过夜摇菌培养，用于质粒回收和测序(图8)。

2、实验结果

经过测序得到图9所示编码H⁺-ATP酶基因α亚单位的部分DNA和核苷酸序列，该序列与GeneBank中所公布的基因序列的同源性为88.61％。

3、结论

克隆测序得到的基因片段为H⁺-ATP酶基因的α亚单位。

实施例3：酸胁迫对干酪乳杆菌H⁺-ATP酶耐酸基因atpA’表达的影响

1、实验方法

酸胁迫是益生菌群面临的首要挑战，同时也是进行益生菌筛选的首要条件。因此，找到与益生菌酸耐受力(acid tolerance)相关的基因，在今后进行益生菌改造方面具有积极的作用。

本发明利用RT-PCR技术，发现H⁺-ATP酶基因表达与干酪乳杆菌的耐酸性能是有一定关系的。

1.1PCR引物设计与合成

PCR引物根据GeneBank提供的相关序列(Accession No：NZ_AAGR01000077)采用Primer Primer 5.0自行设计，由上海桑尼生物科技有限公司合成。

H⁺-ATP酶基因PCR引物：

F：5′-ATGGTGCGATGGATTAT-3′；

R：5′-AACACGGGAAACAGAAG-3′。

GAPDH基因PCR引物：

F：5′-CTTTCCCTGGTGAAGTTAG-3′；

R：5′-GTTCAGGAAGTAAGCCATT-3′。

1.2干酪乳杆菌(L.casei Zhang)生长曲线的确定

将在液体MRS培养基中37℃培养过夜的干酪乳杆菌悬液3,000g离心10分钟，弃去上清液。用灭菌生理盐水(0.8％)洗涤菌体，3,000g离心10分钟，重复3次，收集菌体。每管加入生理盐水，将菌体稀释到适当浊度(A_600nm＝0.8～0.9)。将供试菌液以2％的量加入不同酸度条件的三角瓶中，以每管5mL的量分装试管。置于37℃恒温培养箱中培养29小时。每隔1小时取出3支试管用分光光度计测量其600nm处的吸光值，以不含菌液的空白培养基管为空白，平行实验重复3次，取平均值。以吸光度为纵坐标，培养时间为横坐标，绘制生长曲线。

1.3总RNA提取

对照菌株：L.casei ZL3-1，L.casei ZL3-2(在pH3.5条件时均可生长)。

将L.casei Zhang，L.casei ZL3-1，L.casei ZL3-2分别同时生长于pH4.0，pH5.0，pH6.5的MRS培养基中，在37℃条件下培养到其对数生长期。取上述处于对数生长期的乳酸菌细胞，在2％溶菌酶中作用20分钟后，收取约50mg菌体沉淀。总RNA提取采用Trizol法(Invetrogen，USA)，具体操作按照TRIzol试剂盒说明书进行(图10)。在生物分光 光度计(Biophotomater，Eppendorf)上测OD值，调整各组织样总RNA浓度至100ng/μl。备用总RNA于-70℃保存。

1.4确定RT-PCR反应循环次数

取同一样本cDNA分别作目的基因H⁺-ATP酶22，25，28，31，34个循环扩增，1％琼脂糖电泳产物，紫外成像分析条带灰度确定扩增平台期前的循环次数为反转录实验循环参数。反应体系为25μl。扩增条件：97℃预变性5分钟，95℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分钟，循环34次，最后一个循环结束后72℃延伸10分钟。

1.5RT-PCR扩增

按反转录试剂盒TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0要求进行反转录。反转录反应液组成：1μl 10×RT缓冲液，2μl 25mmol/L MgCl₂，1μl dNTP混合物，0.25μl RNase抑制剂(40U/μl)，0.5μl AMV反转录酶XL(5U/μl)，0.5μl Oligo dT-Adaptor Primer(2.5pmol/μl)，3μl RNA模板，1.75μl无RNase的dH₂O，总体系为10μl。

反转录反应条件：30℃10分钟，42℃30分钟，99℃5分钟，5℃5分钟。PCR扩增条件：97℃变性5分钟；95℃30秒→55℃30秒→72℃1分钟，如此进行30次循环；72℃延伸10分钟，4℃保存。

1.6琼脂糖凝胶电泳检测

取每个组织样品的目的基因RT-PCR产物5μL，对照GAPDH基因RT-PCR产物2μL，同1μL上样缓冲液混合均匀，分别点样于琼脂糖凝胶孔中，在另一孔中加入5μL DL2000 Marker，5V/cm电压下电泳30分钟。

电泳结束后，在凝胶成像系统GDS-8000 System(UVP BiomagingSystems)上留取照片。应用系统软件(Gelpro Analyzer)进行吸光值比较分析，确定目的基因在组织样品中表达量的相对值。

2、实验结果

通过对L.casei Zhang生长曲线的绘制发现，所述干酪乳杆菌在pH5.0 和pH6.5条件下于3小时进入对数生长期，在10小时进入平台期；在pH4.0条件下于3小时进入一个迟滞期后，在6小时左右进入对数生长期，在17小时左右进入平台期。测定结果显示，随着培养基酸度增加，干酪乳杆菌的生长受到抑制，pH5.0和pH6.5条件下已表现出这种趋势，到pH4.0条件时，干酪乳杆菌的生长受到强烈的抑制(图11)。

为了准确反映不同酸度条件下H⁺-ATP酶基因表达，在进行半定量PCR时，要求PCR扩增不进入平台期。实验结果显示，当H⁺-ATP酶基因和GAPDH基因达到31循环时，条带的吸光值基本达到恒定。因此30循环被共同RT-PCR扩增所采用(如图12所示，其中1-5泳道分别为H⁺-ATP酶扩增22、25、28、31、34循环，6-10泳道分别为GAPDH扩增22、25、28、31、34循环)。

在菌体进入对数生长末期，即培养8小时，回收菌体并提取总RNA。进行RT-PCR扩增(如图13所示，其中1-6泳道为L.casei ZL 3-1；7-12泳道为L.casei ZL 3-2；13-18泳道为L.casei Zhang；奇数泳道为H⁺-ATP酶；偶数泳道为GAPDH；1、2、7、8、13、14泳道为pH4.0；3、4、9、10、11、12泳道为pH5.0；5、6、11、12、17、18泳道为pH6.5)，并根据各电泳条带的吸光值比较绘制柱状图(图14)。随着干酪乳杆菌培养基酸度的增加，H⁺-ATP酶的表达呈上升趋势，其中，pH4.0和pH5.0时的表达量分别是pH6.5时的3.3倍和2.8倍。对Lactobacillus casei Zhang作了三次平行实验，根据其电泳条带吸光值绘制柱状图。

3、结论

表明干酪乳杆菌(Lactobacillus casei Zhang)的H⁺-ATP酶耐酸基因atpA’同菌体细胞酸调节间有一定关系。

Claims (6)

1.一种干酪乳杆菌(Lactobacillus casei Zhang)，其特征在于所述干酪乳杆菌菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心的保藏号为CGMCC No.1697。

2.如权利要求1所述的干酪乳杆菌，其特征在于它是从酸马奶中分离的耐酸型益生菌。

3.如权利要求1所述的干酪乳杆菌，其特征在于它包括耐酸基因。

4.如权利要求1、2或3所述的干酪乳杆菌用作食品发酵剂的用途。

5.一种H⁺-ATP酶耐酸基因atpA’，其特征在于所述基因的序列如下：

1

CTTTGTTTTCTTGGTTTCTTGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACGATTAT

GCGATGGAT

                                     G  A  M  D

61

TATACCATCGTGCTGACTGCTGGCCCATCTGAACCTGCACCAATGCTGTATATCGCGCCT

 Y  T  I  V  L  T  A  G  P  S  E  P  A  P  M  L  Y  I  A  P

121

TATGCCGGTGCAGCGATGGGTGAAGAGTTCATGTATAACGGCAAGCACGTCTTGATCGTG

 Y  A  G  A  A  M  G  E  E  F  M  Y  N  G  K  H  V  L  I  V

181

TATGATGATTTGAGCAAACAGGCAACCTCATATCGTGAGCTGTCCTTGCTGCTCCGTCGT

 Y  D  D  L  S  K  Q  A  T  S  Y  R  E  L  S  L  L  L  R  R

241

CCGCCTGGTCGTGAAGCCTATCCTGGGGATATTTTCTATACCCACAGTCGCTTGTTGGAA

 P  P  G  R  E  A  Y  P  G  D  I  F  Y  T  H  S  R  L  L  E

301

CGCGCTGCTAAATTGAGTGATAAACTCGGCGGCGGTTCTATGACGGCGTTGCCGGTTATT

 R  A  A  K  L  S  D  K  L  G  G  G  S  M  T  A  L  P  V  I

361

GAAACTCAGGCAGGCGATATTTCCGCGTACATCCCGACTAACGTTATTTCTATCACGGAT

 E  T  Q  A  G  D  I  S  A  Y  I  P  T  N  V  I  S  I  T  D

421

GGTCAGATCTTCTTACAAAGCGATCTGTTCTATGCGGGTACACGTCCAGCCATTGATGCC

 G  Q  I  F  L  Q  S  D  L  F  Y  A  G  T  R  P  A  I  D  A

481

GGTGCT

GTTTCCCGTGTTAATCTCTAGAGGATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATTCGT

 G  A  *

541

AATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACA

601

TACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACAT

661

TAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATT

721

 AATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCT

781

 CGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCAAGCGGTATCAGCTCACTCAA

841

AGGCGGTAATACGGTTTATCACAGAATCAGGGGTAACGCAGGATAGAACATGTGAGCAAA

901

GGCCCTGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGTCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCT

961

 CCGCCCCCTGACGAGCATCACAATATCGACGCTCCAGTCAAAGGTGGCGAACCCGACAGG

1021

 ATTATAAGATACCAGGGGTTCCCCCTGGAACATCCTCATGGGTCTCCCTGTTCGACCTTG

1081    CGCTTAACGGATACTGTCCACTTTTCTCCCTTCGGGATAC。

6.如权利要求5的H⁺-ATP酶耐酸基因atpA’用于筛选益生菌的用途。

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