CN114755406B - 一种猪链球菌9型elisa抗体检测方法及其试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种猪链球菌9型抗体间接ELISA检测方法，涉及抗体的检测领域，尤其涉及利用猪链球菌9型荚膜多糖检测猪链球菌9型抗体的间接ELISA检测方法及其试剂盒。这种猪链球菌9型间接ELISA检测方法通过酸沉淀法提取荚膜多糖，并以其作为包被抗原，并通过对ELISA反应条件、检测方式和临界值确定方式的优化；能够实现对副猪嗜血杆菌抗体的准确检测，具有较好的特异性和敏感性；有效解决了目前临床上猪链球菌9型抗体没有特定检验方法的问题。
Description
技术领域
本发明涉及兽医学领域。具体而言，本发明涉及一种快速检测猪链球菌9型(Streptococcus suis type9,SS9)抗体的ELISA检测方法及其检测试剂盒。
背景技术
猪链球菌病是一种重要的人畜共患病，猪发病后临床症状以脑膜炎、败血症和关节炎为主要特征。该病在世界范围内流行，给全球养猪业带来了巨大的经济损失。猪链球菌根据荚膜多糖分型，共分为29种血清型，根据其菌株不同毒力，它们可以分为高致病性，低致病性和无致病性菌株。近年来，猪链球菌9型(Streptococcus suis serotype 9，SS9)在中国、澳大利亚、比利时、荷兰和德国等国家猪场分离比率逐渐升高，现已成为猪链球菌的优势血清型之一。(王治方等，猪链球菌流行优势菌株的调查及耐药性，中国兽医学报.2020,40(12)；石大丽等，广西部分地区猪链球菌血清型及其毒力因子流行性调查分析.中国畜牧兽医.2019,46(04)；Evgueny Vinogradov，Structure determination ofStreptococcus suis serotype 9capsular polysaccharide and assignment offunctions of the cps locus genes involved in its biosynthesis.CarbohydrateResearch Volume 433,4October 2016,Pages 25-30)。
间接ELISA检测方法具有敏感性高，特异性强等特点，是目前血清抗体检测的最主要的方法。孙智远等建立了一种基于猪链球菌9型全菌上清蛋白的ELISA检册方法(孙智远等，猪链球菌9型抗体的PPA-ELISA检测试剂盒及其制备方法)，但是该方法制备的抗原特异性差，容易跟猪的其他病原发生非特异性反应。目前，市场上没有商品化的检测猪链球菌9型抗体的试剂盒。为了有效预防和控制猪链球菌9型病，在加强免疫预防的同时，建立一种特异、敏感、稳定、快速、方便的抗体诊断工具。本发明使用提纯的猪链球菌9型荚膜多糖及ELISA检测技术，且经过改良，使用磷酸沉淀法提纯荚膜多糖，比传统的冷酚法毒性更小，操作更简便，更便于工业生产，且能够使试剂盒具有很好的敏感性和特异性，能高通量检测猪血清中的猪链球菌9型抗体。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测猪链球菌9型抗体的间接ELISA检测方法及其试剂盒，能够解决目前国内没有商品化猪链球菌9型抗体检测试剂盒的现状。
本发明具体技术方案如下：
本发明的第一个目的是提供一种检测猪链球菌9型抗体的间接ELISA检测试剂盒，所述试剂盒的抗原包被板为采用猪链球菌9型荚膜多糖作为包被抗原包被得到。
进一步的，所述猪链球菌9型荚膜多糖的制备方法如下：
(1)荚膜多糖粗提：将猪链球菌9型菌离心，取沉淀，将沉淀加入含有33mmol/L磷酸盐和145mmol/L NaCl pH 8.0的缓冲液中，获得细菌悬液；将细菌悬液离心，取上清液，将上清液除去核酸，离心，收集上清，加入80％的乙醇，2～8℃作用12小时，离心，沉淀即为粗制荚膜多糖；
在某个特殊的实施例中，(1)荚膜多糖粗提：将猪链球菌9型菌10000g下离心40分钟，取沉淀，将沉淀加入含有33mmol/L磷酸盐和145mmol/L NaCl pH 8.0的缓冲液中，获得细菌悬液；将细菌悬液在121℃高压灭菌15分钟，在9000g下离心50分钟，取上清液，所述上清液中含有粗荚膜多糖，将上清液除去核酸，10000g离心30分钟，收集上清，加入80％的乙醇，2～8℃作用12小时，10000g离心30分钟，沉淀即为粗制荚膜多糖；
(2)酸沉淀法纯化荚膜多糖：将步骤(1)得到的粗制荚膜多糖溶解于水后，磷酸调pH至3.5，静置过夜；离心，收集上清，100KD超滤后，加入终浓度25％(V/V)的乙醇进行沉淀，并冷冻干燥，获得所述猪链球菌9型荚膜多糖。
进一步的，步骤(1)所述除去核酸为将上清液加入终浓度25％的无水乙醇，混匀，然后再加入终浓度0.1g/L的氯化钙溶液。
进一步的，所述试剂盒还包含猪链球菌9型阳性对照血清、猪链球菌9型阴性对照血清、样品稀释液、酶标抗体、20倍浓缩的洗涤液、底物溶液A、底物溶液B和终止液。进一步的，所述样品稀释液为5％(M/V)BSA-PBST溶液，酶标抗体为以加有5％BSA和2％蔗糖的PBST作10000倍稀释的HRP标记的山羊抗猪IgG，洗涤液为20倍浓缩PBST，底物溶液A为含有50mg/mL过氧化脲的柠檬酸盐缓冲液，底物溶液B为含有0.2mg/mL TMB pH5.0的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液，终止液为2mol/L的硫酸溶液。
本发明的第二个目的是提供一种检测猪链球菌9型抗体的间接ELISA检测试剂盒的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
(1)荚膜多糖粗提：将猪链球菌9型菌离心，取沉淀，将沉淀加入含有33mmol/L磷酸盐和145mmol/L NaCl pH 8.0的缓冲液中，获得细菌悬液；将细菌悬液离心，取上清液，将上清液除去核酸，离心，收集上清，加入80％的乙醇，2～8℃作用12小时，离心，沉淀即为粗制荚膜多糖；
在某个特殊的实施例中，(1)荚膜多糖粗提：将猪链球菌9型菌10000g下离心40分钟，取沉淀，将沉淀加入含有33mmol/L磷酸盐和145mmol/L NaCl pH 8.0的缓冲液中，获得细菌悬液；将细菌悬液在121℃高压灭菌15分钟，在9000g下离心50分钟，取上清液，所述上清液中含有粗荚膜多糖，将上清液除去核酸，10000g离心30分钟，收集上清，加入80％的乙醇，2～8℃作用12小时，10000g离心30分钟，沉淀即为粗制荚膜多糖；
(2)酸沉淀法纯化荚膜多糖：将步骤(1)得到的粗制荚膜多糖溶解于水后，磷酸调pH至3.5，静置过夜；离心，收集上清，100KD超滤后，加入终浓度25％(V/V)的乙醇沉淀，并冷冻干燥，获得所述猪链球菌9型荚膜多糖；
(3)包被：以包被液将步骤(2)得到的猪链球菌9型荚膜多糖稀释为0.2μg/mL，得到抗原稀释液，在酶标板各孔均加入抗原稀释液100μL，室温包被；优选的，所述包被液为pH9.6的0.05mol/L的碳酸盐缓冲液，所述包被时间为12-16h；
(4)封闭：甩干酶标板中的液体，用PBST清洗各孔后向每孔中加入150μL-200μL的封闭液，37℃封闭2h，在37℃干燥箱干燥，获得所述检测猪链球菌9型抗体的间接ELISA检测试剂盒的抗原包被板；优选的，所述封闭液为5％(M/V)的BSA-PBS缓冲液。
进一步的，所述方法还包括(5)组装：将(4)得到的抗原包被板与猪链球菌9型阳性对照血清、猪链球菌9型阴性对照血清、样品稀释液、酶标抗体、20倍浓缩的洗涤液、底物溶液A、底物溶液B和终止液组装获得所述检测猪链球菌9型抗体的间接ELISA检测试剂盒。
进一步的，步骤(1)所述除去核酸为将上清液加入终浓度25％(V/V)的无水乙醇，混匀，然后再加入终浓度0.1g/L的氯化钙溶液。
本发明的第三个目的是提供一种基于权利要求1所述间接ELISA检测试剂盒的猪链球菌9型抗体间接ELISA检测方法，所述检测方法包括以下步骤：
(1)待检血清孵育：将抗原包被板用PBST清洗，分别设置阳性对照孔、阴性对照孔和待检血清孔；
阳性对照为以样品稀释液稀释50倍猪链球菌9型阳性血清；并向阳性对照孔中加入100μl阳性对照；
阴性对照为以样品稀释液稀释50倍猪阴性血清；并向阴性对照孔加入100μl阴性对照；
待检血清为以样品稀释液稀释50倍的待检血清，向待检血清孔中加入100μL待检血清；
所述样品稀释液为含有5％(M/V)BSA的PBST缓冲液；
上述样品37℃孵育30min；
(2)酶标抗体孵育：甩干抗原包被板中的液体，将抗原包被板用PBST清洗，向每孔中加入100μL的酶标抗体，37℃孵育30min；所述酶标抗体为以加有5％BSA和2％蔗糖的PBST作10000倍稀释的HRP标记的羊抗猪IgG，37℃孵育30min；
(5)显色：甩干抗原包被板中的液体，将抗原包被板用PBST清洗，向每孔中加入50μL的底物溶液A和50μL的底物溶液B，所述底物溶液A为含有50mg/mL过氧化脲的柠檬酸盐缓冲液，底物溶液B为含有0.2mg/mL TMB pH5.0的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液；37℃避光显色15min，再向各孔中分别加入50μL的终止液，所述终止液为2mol/L的硫酸溶液，15min以内在酶标仪上读其OD450nm数值；
当待检血清OD450nm≥0.257时，待检血清中的猪链球菌9型抗体检测结果判定为阳性；
当待检血清比率OD450nm＜0.257时，待检血清中的猪链球菌9型抗体检测结果判定为阴性。
进一步的，本发明所述用PBST清洗为向酶标板或抗原包被板各孔加入300μLPBST，静置5min，甩干孔中液体，重复5次。
本发明所述TMB是指3,3',5,5'-四甲基联苯胺。
本发明的有益效果是：
1.目前国内还没有猪链球菌9型的商业化产品；
2.本发明操作简单，检测时间短，两小时内即可出结果；
3.本发明的检测猪链球菌9型抗体的检测方法及其试剂盒，可诊断动物是否受到猪链球菌9型感染，也可以判断猪链球菌9型疫苗的免疫保护效果，该试剂盒具有较高的特异性、敏感性和重复性，本发明可最大限度降低假阳性出现率，避免肠杆菌科其他细菌抗原给检测带来的干扰。
附图说明
图1苯酚-硫酸法测定荚膜多糖浓度时绘制的标准曲线示意图。其中横坐标为多糖浓度，纵坐标为OD值。
图2使用分光光度计对荚膜多糖进行纯度检测的示意图。其中横坐标为波长，纵坐标为吸光值。
图3绘制的ROC曲线示意图。
图4敏感性试验结果。其中横轴为血清稀释倍数，纵轴为检测OD值。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，而决不对本发明的内容和保护范围构成任何限制。除另有说明外，本申请中的所有科技术语都具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解相同的含义。本申请中引用的任一专利、专利申请和出版物在此引入作为参考。
实施例1：猪链球菌9型荚膜多糖的提取
1.1细菌培养
将实验室保存的猪链球菌9型菌种GZ0565接种于THB固体培养基，37℃下培育24h至平板上长出清晰可见的单菌落，挑取单菌落于含有10mL的THB液体培养基中，37℃180rpm震荡培养过夜，次日将培养所得的10mL菌液接种于装有1L THB液体培养基的锥形瓶中扩大培养，在37℃摇床中以180rpm的速度震荡培养7h，标准细菌比浊管测菌浓度为1.5×109/mL时终止培养。加入千分之三的甲醛，37℃摇床灭活过夜。
1.2荚膜多糖的粗提
细菌通过在10000g下离心40分钟进行沉淀，通过移液器将其悬浮在含有33mmol/L磷酸盐和145mmol/L NaCl pH 8.0的缓冲液中，获得细菌悬液并冷却。将细菌悬液在121℃高压灭菌15分钟，在9000g下离心50分钟回收含有粗荚膜多糖的上清液。通过加入0.1mol/L的CaCl2和25％的乙醇，2～8℃作用2小时，去除上清液中的核酸，然后在室温下以10000g离心30分钟。加入80％(V/V)的乙醇，2～8℃作用12小时，10000g离心30分钟，即为粗制荚膜多糖。
1.3酸沉淀法纯化荚膜多糖
将粗制的荚膜多糖溶解于水后，磷酸调pH至3.5，静置过夜；12000rpm离心30min，100KD半透膜超滤48小时后，加入终浓度25％(V/V)的乙醇，2～8℃作用12小时，10000g离心30分钟，干燥后即为猪链球菌9型荚膜多糖。
1.4荚膜多糖浓度的测定
采用苯酚-硫酸法测定荚膜多糖浓度，称取葡萄糖100mg，加水定容到100mL容量瓶中，此即为葡萄糖储备液，分别吸取0、2、4、6、8、10、12、14mL储备液到容量瓶中加水定容到100mL，摇匀，此即为浓度分别为0％、2％、4％、6％、8％、10％、12％、14％的葡萄糖应用液，分别吸取1mL上述应用液于试管中，加入8％(V/V)的苯酚溶液1mL，摇匀，再迅速加入浓硫酸5mL，摇匀，在水浴锅中40～50℃下作用30min，以1号管为对照管在490nm处测定数值并绘制标准曲线。将提取的荚膜多糖样品，按上述方法测定吸光度，然后根据标准曲线计算出荚膜多糖最终浓度，浓度应大于10μg/mL。
1.5荚膜多糖纯度的测定
为检测上述提取物中是否含有荚膜多糖并观察蛋白、核酸含量，将纯化后的多糖溶解于PBS中，用分光光度计对多糖进行全波长扫描，观察多糖、蛋白、核酸的吸收峰。
2结果
2.1荚膜多糖浓度
用Excel 2016软件分析处理数据，根据结果得到回归方程，并要求相关系数R2≥0.985.得到标准曲线的线性方程为y＝0.0032x+0.0546(R2＝0.9976)(见附图1)。
2.2荚膜多糖纯度
用紫外分光光度计对纯化后多糖进行全波长扫描(见附图2)。扫描图显示在200nm处有单一的最大吸收峰，这是多糖的特征吸收峰，证明有多糖的存在；而260、280nm处没有吸收峰，说明获得的荚膜多糖样品中杂蛋白和残留的核酸含量较低，荚膜多糖纯度较高。
实施例2：猪链球菌9型抗体间接ELISA检测方法反应条件的优化
2.1抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释度的确定
采用方阵滴定法，用包被液(pH 9.6的0.05mol/L的碳酸盐缓冲液)将提取的猪链球菌9型荚膜多糖进行2倍比稀释，终浓度分别为0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2μg/mL，每孔加入100μL，每个稀释度重复两排，置于4℃包被过夜；然后用洗涤液(pH 7.4的PBST溶液)洗涤5次，每次每孔300μL，5min，甩干；每孔加入150μL封闭液(5％的BSA-PBS缓冲液)于37℃封闭2h；同上方法进行洗涤；将猪链球菌9型阴性血清和阳性血清用5％的BSA-PBST(M/V)分别作1:50、1:100、1:200、1:400倍比稀释，取100μL分别加入各孔中，于37℃孵育30min；同之前方法洗涤；将加有5％BSA(M/V)和2％蔗糖(M/V)的PBST稀释的HRP标记山羊抗猪IgG(1:10000稀释)加入到各孔中，每孔100μL，37℃孵育30min；用同之前方法洗涤；最后每孔加入50μL底物溶液A和50μL底物溶液B，于37℃避光显色15min，并向每孔加入50μL的反应终止液(2mol/L的H2SO4溶液)，用酶标仪读取在450nm波长处的吸光度值(OD450nm)。
计算相同稀释度的阳性血清和阴性血清检测值之比，根据比值绘制折线图，选择阳性血清测定值在1.0左右，阴性血清测定值在0.1左右，且阴阳性值差值在连续两个稀释度之间变化最大时的上一个稀释度为最佳稀释度，确定为最适抗原包被浓度和血清稀释度。
当猪链球菌9型荚膜多糖包被浓度为0.2μg/mL，血清稀50。
2.2封闭液的确定
按照最佳抗原浓度包被酶标板，4℃过夜且洗涤后，分别加入5组不同的封闭液：组1为2％的BSA、组2为5％的BSA、组3为1％的FBS、组4为5％的脱脂奶粉、组5为2％的明胶(均为质量比体积)。封闭后用最适血清稀释度进行反应，洗涤后再加入稀释后的HRP标记的山羊抗猪IgG，最后加入底物溶液A和底物溶液B，并加入终止液。读取OD450nm，比较各组的值以及P/N值，选择P/N值最大时的封闭液最为最适封闭液。
经5％BSA-PBS(M/V)封闭后的ELISA板洗涤后P/N值最大，因此将5％BSA-PBS(M/V)其作为最佳封闭液。
2.3血清最佳反应时间的确定
按照最佳抗原浓度包被酶标板，4℃包被过夜且洗涤后，加入最适封闭液封闭2h，分别加入经过最适稀释倍数稀释的阴性、阳性血清，按照37℃孵育时间不同分成4组：组1为15min、组2为30min、组3为45min、组4为60min。洗涤后再加入HRP标记的山羊抗猪IgG，最后加入底物溶液A和底物溶液B，并加入终止液。读取OD450nm，比较各组的值以及P/N值，选择P/N值最大时的血清反应时间为最适血清反应时间。
当一抗血清在37℃作用30min时P/N值最高，因此确定待检血清最佳作用时间为30min。
2.4酶标抗体反应浓度及时间的确定
按照最佳抗原浓度包被酶标板，4℃包被过夜且洗涤后，加入最适封闭液封闭2h，分别加入经过最适稀释倍数稀释的阴性、阳性血清作用最佳反应时间，按酶标抗体的稀释倍数不同分成4组：组1为1:2500、组2为1:5000、组3为1:10000、组4为1:10000，各组用5％BSA(M/V)和2％蔗糖(M/V)的PBST作稀释。保持其他条件不变，读取并比较各组阴阳性血清的值和P/N值，选择P/N值最大时的稀释倍数作为酶标抗体的最佳反应浓度。
按照最佳抗原浓度包被抗原包被板，4℃包被过夜且洗涤后，加入最适封闭液封闭2h，分别加入经过最适稀释倍数稀释的阴性、阳性血清作用最佳反应时间，按酶标抗体在37℃反应时间不同分为4组：组1为30min、组2为45min、组3为60min、组4为90min。保持其他条件不变，读取并比较各组阴阳性血清的值和P/N值，选择P/N值最大时的反应时间作为酶标抗体的最佳反应时间。
当酶标抗体的稀释度为1:10000时，其P/N值最大，因此确定1:10000为酶标抗体最适稀释度。当酶标抗体的反应时间为30min时，P/N值最大，因此确定当酶标抗体的最佳反应时间为30min。
2.5底物反应时间的确定
按照最佳抗原浓度包被酶标板，4℃包被过夜且洗涤后，加入最适封闭液封闭2h，分别加入经过最适稀释倍数稀释的阴性、阳性血清作用最佳反应时间，按照确定的酶标抗体最佳稀释倍数和反应时间进行实验，加入底物溶液A和B后的反应时间分为5组：组1为5min、组2为10min、组3为10min、组4为20min，组5为30min。保持其他条件不变，读取并比较各组阴阳性血清的值和P/N值，选择P/N值最大时的反应时间作为底物的最佳反应时间。
当底物反应时间为15min时，其P/N值最大，因此确定底物最佳反应时间为15min。
2.6临界值的确定
选择60份猪链球菌9型免疫阳性血清和60份健康猪血清即猪链球菌9型阴性血清，利用建立的ELISA方法检测其结果，用软件Medcal绘制ROC曲线(接受者操作特征曲线)，确定其临界值为，当OD450nm≥0.257时判定为阳性，当OD450nm＜0.257时判定为阴性。当规定为该临界值时，该检测方法的敏感性为93.33％，特异性为88.33％，另外该ROC曲线的AUC值为0.9222，说明此检测方法效果很好。ROC曲线如图3所示。
本实施例和以下实施例具体操作步骤如下：
(1)包被：以0.05mol/L碳酸盐缓冲液(pH9.6)为包被液将实施例1得到的猪链球菌9型荚膜多糖稀释为0.2μg/mL，得到稀释液，在酶标板各孔均加入100μL稀释液，室温包被过夜(12-16h)。
(2)封闭：甩干酶标板中的液体，用PBST洗1遍，每孔均加入300μL，静置5min，甩干孔中液体，向每孔中加入150μL的5％BSA-PBS(M/V)封闭液，37℃封闭2h；获得所述检测猪链球菌9型抗体的间接ELISA检测试剂盒的抗原包被板。
(3)待检血清孵育：甩干抗原包被板中的液体，用PBST洗5遍，每遍每孔均加入300μL，静置5min，最后一遍后甩干孔中液体。
A1和B1孔作为阳性对照孔，向A1和B1中分别加入以样品稀释液作50倍稀释的猪链球菌9型阳性对照血清100μL；
C1和D1孔作为阴性对照孔，向C1和D1孔中分别加入以样品稀释液作50倍稀释的猪阴性对照血清100μL；
其余孔为待检血清孔，向其余孔中加入相应的100μL作100倍稀释的待检血清；
所述样品稀释液为含有5％BSA(M/V)的PBST缓冲液。上述各孔样品37℃孵育30min。
(4)酶标抗体孵育：甩干抗原包被板中的液体，用PBST洗5遍，每遍每孔均加入300μL，静置5min，最后一遍后甩干孔中液体，向每孔中加入100μL的酶标抗体，所述酶标抗体为以加有5％BSA(M/V)和2％蔗糖(M/V)的PBST进行10000倍稀释的山羊抗猪IgG，37℃孵育30min。
(5)显色：甩干抗原包被板中的液体，用PBST洗5遍，每遍每孔均加入300μL，静置5min，最后一遍后甩干孔中液体，向每孔中加入底物溶液A和底物溶液B各50μL，37℃避光显色15min，再向各孔中分别加入50μL的终止液，15min以内在酶标仪上读其OD450nm数值。所述底物溶液A为含有50mg/mL过氧化脲的柠檬酸盐缓冲液，底物溶液B为含有0.2mg/mL TMB的pH5.0的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液，所述终止液为2mol/L的硫酸溶液；
(6)结果判定：通过各孔的OD450nm的大小判定样品阴阳性，当OD450nm≥0.257时，判定为猪链球菌9型抗体阳性，当OD450nm＜0.257时，判定为猪链球菌9型抗体阴性。
实施例3：猪链球菌9型抗体间接ELISA检测试剂盒的组装
一种猪链球菌9型荚膜多糖抗体ELISA检测试剂盒，包括猪链球菌9型荚膜多糖抗原作为包被抗原包被的抗原包被板，所述试剂盒还包括猪链球菌9型阳性对照血清、猪链球菌9型阴性对照血清、样品稀释液、酶标抗体、20倍浓缩的洗涤液、底物溶液A、底物溶液B和终止液。
所述的抗原包被板是以纯化的猪链球菌9型荚膜多糖作为抗原，包被液为0.1mol/L，pH9.6的碳酸盐缓冲液。所述的荚膜多糖是从猪链球菌9型GZ0565株中提取所得。
所述的阳性对照为猪链球菌9型免疫过的阳性血清，所述的阴性对照为为感染过猪链球菌的健康猪阴性血清。
所述的样品稀释液为含有5％BSA(M/V)的PBST溶液；所述的洗涤液为20倍浓缩的PBST溶液；所述的底物溶液A为含有50mg/mL过氧化脲的柠檬酸盐缓冲液，底物溶液B为含有0.2mg/mL TMB pH5.0的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液；所述的终止液为2M的硫酸溶液。
试剂盒的组装含：
实施例4：猪链球菌9型抗体间接ELISA检测试剂盒的敏感性试验
对4份SS9阳性血清进行1:25、1:50、1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600、1:3200倍比稀释，用该试剂盒进行检测，以验证该方法的敏感性。
结果：SS9阳性血清连续倍比稀释后进行间接ELISA检测，如图4所示，当血清以1:800稀释时检测结果仍然为阳性，说明所建立的检测方法具有较强的敏感性。
实施例5：猪链球菌9型抗体间接ELISA检测试剂盒的特异性试验
用已试制的试剂盒分别对猪胸膜肺炎放线杆菌(APP)、猪支原体肺炎(MHP)、副猪嗜血杆菌(HPS)、肠炎沙门氏菌(SE)、大肠杆菌(E.coli)、猪链球菌1型(SS1)、2(SS2)型和7型(SS3)、马链球菌兽疫亚种(SEZ)等猪细菌性病原的阳性血清进行检测，并设置猪链球菌9型阴阳性对照，看是否有交叉反应，确定该检测方法的特异性。
结果：12种血清结果均判定为阴性，见表1。
表1特异性试验结果
由此可知：该试剂盒具有较高的特异性。
实施例6：猪链球菌9型抗体间接ELISA检测试剂盒的重复性试验
6.1批内重复性试验
取同一批次制备的猪链球菌9型抗体间接ELISA检测试剂盒分别检测相同的5份阳性血清和5份猪阴性血清，进行批内重复性检验。结果表明，不同血清检测结果的变异系数在4.25％-8.94％之间，该试剂盒批内重复性良好。
表2批内重复性试验结果
6.2批间重复性试验
取不同批次制备的猪链球菌9型抗体间接ELISA检测试剂盒(批号分别为210901、210902、210903和210904)，在相同条件下检测5份阳性血清和5份猪阴性血清，进行批间重复性检验。结果表明，不同批次试剂盒的检测结果的变异系数在6.42％-9.19％之间，该试剂盒批间重复性良好。
表3批间重复性试验结果
上述研究结果表明：本试剂盒具有良好的重复性。
Claims (9)
1.一种检测猪链球菌9型抗体的间接ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的抗原包被板为采用猪链球菌9型荚膜多糖作为包被抗原包被得到，所述猪链球菌9型荚膜多糖的制备方法如下：
（1）荚膜多糖粗提：将猪链球菌9型菌离心，取沉淀，将沉淀加入含有33 mmol/L 磷酸盐和145 mmol/L NaCl pH 8.0的缓冲液中，获得细菌悬液；将细菌悬液离心，取上清液，将上清液除去核酸，离心，收集上清，加入80%的乙醇，2~8℃作用12小时，离心，沉淀即为粗制荚膜多糖；
（2）酸沉淀法纯化荚膜多糖：将步骤（1）得到的粗制荚膜多糖溶解于水后，磷酸调pH至3.5，静置过夜；12000rpm，30min离心，收集上清，100KD超滤后，加入25%乙醇进行沉淀，并冷冻干燥，获得所述猪链球菌9型荚膜多糖；
所述猪链球菌9型荚膜多糖的包被浓度为0.2μg/mL。
2.根据权利要求1所述的检测猪链球菌9型抗体的间接ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含猪链球菌9型阳性对照血清、猪链球菌9型阴性对照血清、样品稀释液、酶标抗体、20倍浓缩的洗涤液、底物溶液A、底物溶液B和终止液。
3.根据权利要求1所述的检测猪链球菌9型抗体的间接ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒具体操作方法包括以下步骤：
（1）待检血清孵育：将抗原包被板用PBST清洗，分别设置阳性对照孔、阴性对照孔和待检血清孔，
阳性对照为以样品稀释液稀释50倍猪链球菌9型阳性血清；并向阳性对照孔中加入100μl阳性对照；
阴性对照为以样品稀释液稀释50倍猪阴性血清；并向阴性对照孔加入100μl阴性对照；
待检血清为以样品稀释液稀释50倍的待检血清，向待检血清孔中加入100μL待检血清；
所述样品稀释液为含有5% BSA的PBST缓冲液；
上述样品37℃孵育30min；
（2）酶标抗体孵育：甩干抗原包被板中的液体，将抗原包被板用PBST清洗，向每孔中加入100μL酶标抗体，37℃孵育30min；所述酶标抗体为以加有5%BSA和2%蔗糖的PBST作10000倍稀释的HRP标记的羊抗猪IgG，37℃孵育30min；
（3）显色：甩干抗原包被板中的液体，将抗原包被板用PBST清洗，向每孔中加入50μL的底物溶液A和50μL的底物溶液B，所述底物溶液A为含有50mg/mL过氧化脲的柠檬酸盐缓冲液，底物溶液B为含有0.2mg/mL TMB，pH5.0的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液；37℃避光显色15min，再向各孔中分别加入50μL的终止液，所述终止液为2mol/L的硫酸溶液，15min以内在酶标仪上读其OD450nm数值；
当待检血清OD450nm≥0.257时，待检血清中的猪链球菌9型抗体检测结果判定为阳性；
当待检血清OD450nm＜0.257时，待检血清中的猪链球菌9型抗体检测结果判定为阴性。
4.一种检测猪链球菌9型抗体的间接ELISA检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：
（1）荚膜多糖粗提：将猪链球菌9型菌离心，取沉淀，将沉淀加入含有33 mmol/L 磷酸盐和145 mmol/L NaCl pH 8.0的缓冲液中，获得细菌悬液；将细菌悬液离心，取上清液，将上清液除去核酸，离心，收集上清，加入80%的乙醇，2~8℃作用12小时，离心，沉淀即为粗制荚膜多糖；
（2）酸沉淀法纯化荚膜多糖：将步骤（1）得到的粗制荚膜多糖溶解于水后，磷酸调pH至3.5，静置过夜；12000rpm，30min离心，收集上清，100KD超滤后，加入25%乙醇沉淀并冷冻干燥，获得所述猪链球菌9型荚膜多糖；
（3）包被：包被液将步骤（2）得到的猪链球菌9型荚膜多糖稀释为0.2μg/mL，得到抗原稀释液，在酶标板各孔均加入抗原稀释液100μL，室温包被；
（4）封闭：甩干酶标板中的液体，用PBST清洗各孔后向每孔中加入150μL-200μL的封闭液，37℃封闭2h，获得所述检测猪链球菌9型抗体的间接ELISA检测试剂盒的抗原包被板。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）所述包被液为pH 9.6的0.05mol/L的碳酸盐缓冲液，所述包被时间为12-16h。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤（4）所述封闭液为5%的BSA-PBS缓冲液。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述方法还包括（5）组装：将（4）得到的抗原包被板与猪链球菌9型阳性对照血清、猪链球菌9型阴性对照血清、样品稀释液、酶标抗体、20倍浓缩的洗涤液、底物溶液A、底物溶液B和终止液组装获得所述检测猪链球菌9型抗体的间接ELISA检测试剂盒。
8.根据权利要求2所述的间接ELISA检测试剂盒或权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）所述除去核酸为将上清液加入终浓度25%的无水乙醇，混匀，然后再加入终浓度0.1g/L的氯化钙溶液。
9.根据权利要求3的试剂盒，其特征在于，所述用PBST清洗为向酶标板或抗原包被板各孔加入300μL PBST，静置5min，甩干孔中液体，重复5次。
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