CN106520951A - 一种乳房链球菌pauA基因的特异性PCR检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种乳房链球菌pauA基因的特异性PCR检测方法，包括以下步骤：1)设计引物对：根据乳房链球菌的pauA基因序列设计引物对；2)提取样品：提取样品DNA；3)PCR扩增：采用步骤1)中得到的引物对，以步骤2)中提取的样品DNA为模板，进行PCR扩增；4)检测：琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物；采用本发明利用乳房链球菌pauA基因进行对乳房链球菌的检测，具有检测时间短、成本低、特异性高以及结果判定简单的特点，在临床上更具有实用性。

Description

一种乳房链球菌pauA基因的特异性PCR检测方法
技术领域
本发明涉及一种乳房链球菌pauA基因的特异性PCR检测方法,属于微生物检测技术领域。
背景技术
乳房链球菌(Streptococcus.uberis)属于革兰氏阳性，能够引起奶牛乳房炎。纤溶酶原激酶A(pauA)是该菌重要的毒力因子，能分解血浆酶原，具有高度的保守性，广泛存在并有很强的免疫原性。奶牛乳房炎是危害奶牛业最重要的疾病之一，在世界范围内流行。奶牛乳房炎能引起产奶量及其品质下降，造成严重的经济损失。中国奶牛乳房炎的检出率在40％-65％之间，根据临床症状可以分为临床型乳房炎和隐性型乳房炎，临床型乳房炎的主要表现为乳房局部肿胀、纤维化和发热，乳汁色泽异常，出现絮片、凝块或脓汁，甚至血染，出现体温升高、精神沉郁、食欲下降等全身症状，而隐性型乳房炎症状不明显，不易察觉。乳房链球菌则是奶牛乳房炎的主要致病菌之一。
传统的鉴定乳房链球菌的方法主要是通过细菌分离鉴定、生化鉴定、GAMP试验等经典方法，但经典方法操作繁琐、耗时长、检出率低，对该菌准确检测和疾病及时治疗十分不利。至二十世纪八十年代末聚合链式反应技术诞生，极大地推动了分子生物学科技的发展，并促进了病原微生物核酸水平检测技术的长足发展，成为最重要的检测技术之一。现有检测乳房链球菌的PCR技术有PCR、多重PCR、实时荧光定量PCR和LAMP法等。其中对于PCR的检测方法仍有较大的研究的空间。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种乳房链球菌pauA基因的特异性PCR检测方法，采用本发明利用乳房链球菌pauA基因进行对乳房链球菌的检测，具有检测时间短、成本低、特异性高以及结果判定简单的特点，在临床上更具有实用性。
实现本发明的目的可以通过采取如下技术方案达到：一种乳房链球菌pauA基因的特异性PCR检测方法，包括以下步骤：
1)设计引物对：根据乳房链球菌的pauA基因序列设计引物对；
2)提取样品：提取样品DNA；
3)PCR扩增：采用步骤1)中得到的引物对，以步骤2)中提取的样品DNA为模板，进行PCR扩增；
4)检测：琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。
作为优选，步骤1)中，所述引物对的序列为：
上游引物pauA-F的序列：TCCACCCACTACCTATTT；
下游引物pauA-R的序列：GAGTTTCACCGAGTTCTT。
再优选地，步骤3)中，PCR 25μL检测体系为：Taq酶0.75U，10×PCR缓冲液2.5μL，25mmol/L MgCl2 2μL，2.5mmol/L dNTP Mixture 2μL，引物对，DNA模板1μL，双蒸水补足到25μL；
PCR检测反应程序为：95℃5min，95℃30s，51℃30s，72℃30s，35个循环后72℃延伸10min，结束。
再优选地，所述PCR检测体系中，所述引物对为20μmol/L的上下游引物各1μL。
作为优选，步骤4)中，琼脂糖凝胶电泳的浓度为1.2％。
作为优选，步骤4)中，检测琼脂糖凝胶中是否存在273bp的单一条带；如果存在，则说明样品中含有乳房链球菌。
作为优选，所述PCR缓冲液为TaKaRa Ex Taq Buffer Mg2+Free。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
1、本发明利用乳房链球菌pauA基因检测乳房链球菌，检测时间短，成本低，特异性高以及结果判定简单，在临床上更具有实用性；
2、本发明通过设计的引物对，以样品DNA为模板进行PCR扩增，效率高，结果准确。
附图说明
图1为实施例2特异性评估试验检测结果；
图2为实施例3敏感性评估试验结果。
具体实施方式
下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述：
一种乳房链球菌pauA基因的特异性PCR检测方法，包括以下步骤：
1)设计引物对：根据乳房链球菌的pauA基因序列设计引物对，所述引物对的序列为：
上游引物pauA-F的序列：TCCACCCACTACCTATTT，
下游引物pauA-R的序列：GAGTTTCACCGAGTTCTT；
2)提取样品：提取样品DNA；
3)PCR扩增：采用步骤1)中得到的引物对，以步骤2)中提取的样品DNA为模板，进行PCR扩增，
PCR 25μL检测体系为：Taq酶0.75U，10×PCR缓冲液2.5μL，25mmol/L MgCl2 2μL，2.5mmol/L dNTP Mixture 2μL，20μmol/L的上下游引物各1μL，DNA模板1μL，双蒸水补足到25μL；
PCR检测反应程序为：95℃5min，95℃30s，51℃30s，72℃30s，35个循环后72℃延伸10min，结束；
其中PCR缓冲液为TaKaRa Ex Taq Buffer Mg2+Free，产品代码为RR01AM，其成分为10×Ex Taq Buffer(Mg2+Free)、dNTP Mixture(2.5mM each)和MgCl2(25mM)；
4)检测：浓度为1.2％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，检测琼脂糖凝胶中是否存在273bp的单一条带；如果存在，则说明样品中含有乳房链球菌。
实施例1
pMD-18T-pauA重组载体的构建：
根据乳房链球菌的保守基因pauA序列设计引物对，
以基因组DNA为模板，扩增pauA全长序列，目的片段连接pMD-18T载体，经PCR鉴定，阳性克隆送至英潍捷基(上海)贸易有限公司测序，序列经Blast比对，与pauA基因序列的相似性为100％，说明成功获得了pauA基因，应用于后续试验。
实施例2
特异性评估试验：
对临床分离并由本实验室保存的乳房链球菌、无乳链球菌、停乳链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和沙门氏菌进行PCR扩增反应，设置实施例1中的pMD-18T-pauA重组载体和无菌ddH2O分别作为阳性和阴性对照。PCR反应体系与具体实施方式相同，浓度为1.2％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。
特异性评估试验检测结果如图1所示，图中泳道1-8分别为乳房链球菌、无乳链球菌、停乳链球菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌、阴性对照和阳性对照，泳道M：DL1,000DNA Marker。从图1中可以看出，除对乳房链球菌样品(泳道1)及阳性对照(泳道8)外，其余样品的扩增结果均未见单一的目的条带，表明该方法特异性良好。
实施例3
敏感性评估试验
提取实施例1中的pMD-18T-pauA重组载体，用无菌ddH2O做10倍梯度稀释，取拷贝数为108、107、106、105、104、103、102、101的8个浓度梯度分别为模板，设置无菌ddH2O为阴性对照。PCR反应体系与具体实施方式相同，浓度为1.2％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。
敏感性评估试验结果如图2所示，图中泳道1-8分别为：拷贝数为108、107、106、105、104、103、102、101的重组载体，泳道9为无菌ddH2O阴性对照，泳道M：DL1,000DNA Marker。从图2中可以看出，PCR的检测限为103拷贝数，说明该PCR方法具有较好的灵敏性。
通过上述实施证明，所建立的一种基于乳房链球菌pauA基因的特异性PCR检测方法有良好的特异性和较好的灵敏性，该方法具有非常高的可靠性。
实施例4
无菌采集100份奶牛乳样，分别提取样品DNA，采用引物对：
上游引物pauA-F的序列：TCCACCCACTACCTATTT，
下游引物pauA-R的序列：GAGTTTCACCGAGTTCTT；
以样品DNA为模板，进行PCR扩增：
PCR 25μL检测体系为：Taq酶0.75U，10×PCR缓冲液2.5μL，25mmol/L MgCl2 2μL，2.5mmol/L dNTP Mixture 2μL，20μmol/L的上下游引物各1μL，DNA模板1μL，双蒸水补足到25μL；
PCR检测反应程序为：95℃5min，95℃30s，51℃30s，72℃30s，35个循环后72℃延伸10min，结束。
检测：浓度为1.2％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，检测到其中14个样品的琼脂糖凝胶中存在273bp的单一条带，说明样品中含有乳房链球菌。
对于本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及变形，而所有的这些改变以及变形都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种乳房链球菌pauA基因的特异性PCR检测方法，其特征在于包括以下步骤：
1)设计引物对：根据乳房链球菌的pauA基因序列设计引物对；
2)提取样品：提取样品DNA；
3)PCR扩增：采用步骤1)中得到的引物对，以步骤2)中提取的样品DNA为模板，进行PCR扩增；
4)检测：琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。
2.如权利要求1所述的乳房链球菌pauA基因的特异性PCR检测方法，其特征在于：步骤1)中，所述引物对的序列为：
上游引物pauA-F的序列：TCCACCCACTACCTATTT；
下游引物pauA-R的序列：GAGTTTCACCGAGTTCTT。
3.如权利要求2所述的乳房链球菌pauA基因的特异性PCR检测方法，其特征在于：步骤3)中，PCR 25μL检测体系为：Taq酶0.75U，10×PCR缓冲液2.5μL，25mmol/L MgCl2 2μL，2.5mmol/L dNTP Mixture 2μL，引物对，DNA模板1μL，双蒸水补足到25μL；
PCR检测反应程序为：95℃5min，95℃30s，51℃30s，72℃30s，35个循环后72℃延伸10min，结束。
4.如权利要求3所述的乳房链球菌pauA基因的特异性PCR检测方法，其特征在于：所述PCR检测体系中，所述引物对为20μmol/L的上下游引物各1μL。
5.如权利要求1所述的乳房链球菌pauA基因的特异性PCR检测方法，其特征在于：步骤4)中，琼脂糖凝胶电泳的浓度为1.2％。
6.如权利要求1所述的乳房链球菌pauA基因的特异性PCR检测方法，其特征在于：步骤4)中，检测琼脂糖凝胶中是否存在273bp的单一条带；如果存在，则说明样品中含有乳房链球菌。
7.如权利要求1所述的乳房链球菌pauA基因的特异性PCR检测方法，其特征在于：所述PCR缓冲液为TaKaRa Ex Taq Buffer Mg2+Free。
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