CN105274102A - 辅助鉴定猪链球菌2型、猪链球菌7型和猪链球菌9型的引物组及其应用 - Google Patents

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刘琪
周如月
甘振磊
王贵平
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Abstract

一种辅助鉴定猪链球菌2型、猪链球菌7型和猪链球菌9型的引物组及其应用，该引物组由如下引物对组成：由如SEQIDNO.1所示的核苷酸序列和如SEQIDNO.2所示的核苷酸序列组成的用于辅助鉴定猪链球菌2型的引物对；由如SEQIDNO.3所示的核苷酸序列和如SEQIDNO.4所示的核苷酸序列组成的用于辅助鉴定猪链球菌7型的引物对；由如SEQIDNO.5所示的核苷酸序列和如SEQIDNO.6所示的核苷酸序列组成的用于辅助鉴定猪链球菌9型的引物对。本发明将引物组制备成试剂盒，建立了猪链球菌2、7、9型PCR定型方法，实现了1次PCR同时检测3个血清型，大大缩短了工作内容。

Description

辅助鉴定猪链球菌2型、猪链球菌7型和猪链球菌9型的引物组及其应用
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，更具体地说，涉及一种辅助鉴定猪链球菌2型、猪链球菌7型和猪链球菌9型的引物组及其应用，尤其在利用该引物组来辅助检测来自死亡动物的样品中是否携带猪链球菌2型、猪链球菌7型和猪链球菌9型的试剂盒及其检测方法。
背景技术
猪链球菌(Streptococcussuis,SS)是一种世界性的可引起猪重大疾病的重要病原菌之一，同时它也是一种人兽共患病病原体。人感染猪链球菌的途径主要是接触病死猪，致病菌经破损皮肤和黏膜侵入，或食入未煮熟的病死猪肉而感染。近年来，人感染猪链球菌的报道大量增加，而这些病例主要来自亚洲国家。我国于2005年在四川省爆发的猪链球菌疫情共感染215人，病死率将近20％。
血清分型不仅是了解猪链球菌某一次特定爆发的流行情况或监测血清型流行情况的一种很重要的辅助监控方法，而且对疫苗的研制有着重要的指导意义。目前，猪链球菌的血清型主要通过凝集实验来检测，这种方法既耗时，又费力，且标准血清较为昂贵，结果判读主观差异较大，常常引起误判。此外，还有相当一部分自凝菌株的血清型无法鉴定。因此，迫切的需要一种既简单快速，又可靠的方法来进行血清型的鉴定。
猪链球菌的血清型主要取决于其荚膜的抗原性，而荚膜的产生又受控于基因组中的荚膜合成基因簇(cps)。与传统的用抗血清检测血清型的方法比较，基于血清型特异性基因cps的PCR方法是一种简单、可靠，且经济的方法。
目前公认的猪链球菌的血清型有33种(1-31，33，1/2)，经流行病学分析，临床上猪链球菌主要以2、7、9型是引起猪感染的重要流行血清型，且其致病力较强，而2型猪链球菌极易感染人。虽然之前有文献报道过2、7、9型的3重PCR方法，但其中用到的引物与我们的不同，另外文献中的3条引物扩增的目的条带间隔距离太小，很难进行肉眼的区分。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于，针对现有技术的上述缺陷，以2、7、9型的荚膜多糖合成基因簇为模板设计了特异性引物组，利用该引物组来辅助检测来自死亡动物的样品中是否携带猪链球菌2型、猪链球菌7型和猪链球菌9型的试剂盒及其检测方法。从中建立了猪链球菌2、7、9型PCR定型方法，实现了1次PCR同时检测多个血清型，减少了繁琐的工作内容。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：提供一种辅助鉴定猪链球菌2型、猪链球菌7型和猪链球菌9型的引物组，由如下引物对组成：由如SEQIDNO.1所示的核苷酸序列和如SEQIDNO.2所示的核苷酸序列组成的用于辅助鉴定猪链球菌2型的引物对；由如SEQIDNO.3所示的核苷酸序列和如SEQIDNO.4所示的核苷酸序列组成的用于辅助鉴定猪链球菌7型的引物对；由如SEQIDNO.5所示的核苷酸序列和如SEQIDNO.6所示的核苷酸序列组成的用于辅助鉴定猪链球菌9型的引物对。
本发明所述引物组在制备辅助鉴定猪链球菌2型、猪链球菌7型和猪链球菌9型的试剂盒中的应用。
本发明还提供一种辅助鉴定猪链球菌2型、猪链球菌7型和猪链球菌9型的试剂盒，包括PCR预混液、阳性对照以及阴性对照，所述PCR预混液包括Taq聚合酶、dNTPs、上述的引物组以及双蒸水。
本发明所述的试剂盒，其中，所述阳性对照为猪链球菌2型、猪链球菌7型、猪链球菌9型的质粒组，阴性对照为无菌双蒸水。
本发明还提供一种检测来自死亡动物的样品中是否携带猪链球菌2型、猪链球菌7型和猪链球菌9型的方法，包括如下步骤：
(1)样品核酸提取：
从死亡动物选取样品组织，提取样品组织的DNA基因组作为DNA模板，并溶于灭菌超纯水中，-20℃保存，备用；
(2)PCR扩增：
以步骤(1)提取的DNA基因组为DNA模板分别用如权利要求1中所述的引物组对2、7、9型猪链球菌的cps2I、cps7L、cps9J进行PCR扩增，得到PCR产物；
(3)结果分析：
将步骤(2)得到的PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后，紫外灯下观察目的条带。
其中，所述步骤(2)中的PCR扩增中PCR反应液包括18μLPCR预混液、1μL步骤(1)制备得到的DNA模板、2μL阳性对照和2μL阴性对照；扩增反应条件为：94℃10min预变性；94℃30s，60℃60s，72℃90s，35个循环；72℃延伸10min。
实施本发明的辅助鉴定猪链球菌2型、7型和9型的引物组及其应用，具有以下有益效果：
(1)本发明以2、7、9型的荚膜多糖合成基因簇为模板设计了特异性引物组，将引物组制备成试剂盒，建立了猪链球菌2、7、9型PCR定型方法，实现了1次PCR同时检测3个血清型，大大缩短了临床中的工作量与工作时间；同时我们对试剂盒的各项条件进行了优化，操作特别简单易行，只需在试剂盒中加入待测样本直接进行PCR扩增即可，不需进行试剂的配制等繁琐工作。
(2)本发明的试剂盒及其检测方法，三对引物对PCR扩增的目的条带间隔距离较大，容易区分出猪链球菌2型、猪链球菌7型和猪链球菌9型，该试剂盒具有操作简单、快速、结果判定方便、特异性强、灵敏度高的优点。
附图说明
下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，附图中：
图1为2、7、9型猪链球菌cps2I、cps7L和cps9J基因PCR结果图；其中，1代表DL2000DNAMarker；2代表cps2IPCR结果；3代表cps7LPCR结果；4代表cps9JPCR结果；
图2为质粒p02的构建路线；
图3为质粒p07的构建路线；
图4为质粒p09的构建路线；
图5为重组质粒p02、p07和p09PCR扩增及质粒酶切鉴定结果图；其中，1为p02/BamHI+SalI；2为cps2IPCR产物；3为p07/BamHI+SalI；4为cps7LPCR产物；5为p09/BamHI+SalI；6为cps9JPCR产物；M为DL15000DNAMarker；
图6为检测待测样品中是否携带2、7、9型猪链球菌的多重PCR的检测结果；其中，1-20：临床样品；21：阳性对照；M：DL2000DNAMarker；22：阴性对照；
图7为本发明的试剂盒其特异性检测结果；其中，1-24为SS1-24；M为DL2000DNAMarker；
图8为本发明的试剂盒其特异性检测结果；其中，25-31为SS25-31；32为SS33；33为SS2；34为SS7；35为SS9；36为阳性对照；37为阴性对照；M为DL2000DNAMarker；38为副猪嗜血杆菌；39为猪大肠杆菌；40为猪巴氏杆菌；41为猪波氏杆菌；42为猪沙门氏菌；
图9为本发明的试剂盒对2型猪链球菌的敏感性检测结果；其中，1为3×105CFU；2为3×104CFU；3为3×103CFU；4为3×102CFU；5为3×101CFU；6为3CFU；7为3×10-1CFU；8为3×10-2CFU；9为3×10-3CFU；10为3×10-4CFU；—为阴性对照；+为阳性对照；M为DL2000DNAMarker；
图10为本发明的试剂盒对7型猪链球菌的敏感性检测结果；其中，1为4×105CFU；2为4×104CFU；3为4×103CFU；4为4×102CFU；5为4×101CFU；6为4CFU；7为4×10-1CFU；8为4×10-2CFU；9为4×10-3CFU；10为4×10-4CFU；+为阳性对照；—为阴性对照；M为DL2000DNAMarker；
图11为本发明的试剂盒对9型猪链球菌的敏感性检测结果；其中，1为5×105CFU；2为5×104CFU；3为5×103CFU；4为5×102CFU；5为5×101CFU；6为5CFU；7为5×10-1CFU；8为5×10-2CFU；9为5×10-3CFU；10为5×10-4CFU；—为阴性对照；+为阳性对照；M为DL2000DNAMarker。
具体实施方式
下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述：
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到。
实施例1
一种辅助鉴定猪链球菌2型、猪链球菌7型和猪链球菌9型的引物组，由如下引物对组成：
猪链球菌2型上游引物(cps2I-F)：
TTCGTATTAACTTACTTGGCGT(如SEQIDNO.1所示)
猪链球菌2型下游引物(cps2I-R)：
TAAATCCCCATATGCCAAATCC(如SEQIDNO.2所示)
猪链球菌7型上游引物(cps7L-F)：
AAAATTCGTTCCATTGTAGGTG(如SEQIDNO.3所示)
猪链球菌7型下游引物(cps7L-R)：
TGAAGTTGAAGCTGGTGATAAA(如SEQIDNO.4所示)
猪链球菌9型上游引物(cps9J-F)：
TGAAAGTAGGTATATCTCAGCA(如SEQIDNO.5所示)
猪链球菌9型下游引物(cps9J-R)：
AAAGAATTGAATCCCACCTGAG(如SEQIDNO.6所示)
实施例2
一种辅助鉴定猪链球菌2型、猪链球菌7型和猪链球菌9型的试剂盒，用于离体动物组织的2、7、9型猪链球菌分离株的血清型的辅助鉴定和间接反映猪链球菌流行病学调查。
该试剂盒包括PCR预混液、阳性对照以及阴性对照，所述PCR预混液包括Taq聚合酶、dNTPs、上述的引物组以及双蒸水。阴性对照为无菌双蒸水。
(1)PCR预混液的配制
试剂盒中PCR预混液按以下配方配制，反应体系为20μL，配制时可按照需求的量进行倍比扩增。配好后进行分装，为1mL/管，50次的用量，贴上标签，于-20℃保存备用。
表1猪链球菌2、7、9型PCR试剂盒的PCR预混液配方
试剂名称 用量/50次 终浓度
TaKaRa Taq聚合酶(5U/μL) 5μL 25U
dNTPs Mixture(2.5mM) 80μL 200μM
cps2I-F(10μM/mL) 10μL 0.1μM
cps2I-R(10μM/mL) 10μL 0.1μM
cps7L-F(10μM/mL) 20μL 0.2μM
cps7L-R(10μM/mL) 20μL 0.2μM
cps9J-F(10μM/mL) 7μL 0.07μM
cps9J-R(10μM/mL) 7μL 0.07μM
ddH2O(双蒸水) 732μL -
总体积 900μL -
(2)阳性对照的制备
阳性对照为猪链球菌2型、猪链球菌7型、猪链球菌9型的质粒组。阳性对照的制备包括如下步骤：
1)菌株培养猪链球菌2、7、9型标准菌株在THB培养基(BD公司)或含10％绵羊血的琼脂培养基上生长。大肠杆菌DH5α在LB琼脂平板上生长，添加氨苄(Amp)至终浓度为50g/mL。
2)DNA模板的准备挑取含10％绵羊血的琼脂培养基上生长过夜的猪链球菌2、7、9型菌株，分别接种于THB液体培养基，37℃静置培养过夜，取4mL菌液用TIANampBacteriaDNAKit(TIANGEN)按照说明书提取细菌的基因组DNA，并溶于灭菌超纯水中，-20℃保存备用。
3)2、7、9型猪链球菌的荚膜多糖合成基因簇保守序列的克隆以上述基因组为模板分别用引物cps2I-F/cps2I-R、cps7L-F/cps7L-R、cps9J-F/cps9J-R对2、7、9型猪链球菌的cps2I或cps7L或cps9J进行PCR扩增，PCR产物分别经琼脂糖凝胶电泳后，紫外灯下切下目的条带(如图1所示)，然后用UNIQ-10柱式DNA凝胶回收试剂盒(上海生工生物有限公司)回收目的片段，具体步骤按试剂盒说明书操作。回收产物-20℃保存备用。
4)质粒构建将回收的cps2I或cps7L或cps9J分别连接克隆载体pMD-18T中，反应体系如下：
16℃连接过夜后，各取5μL连接产物分别加入200μL大肠杆菌感受态细胞DH5α中，混匀，冰上放置30min；42℃热激90s，迅速转移至冰上放置2min，加入800μLLB液体培养基，37℃120rpm振荡培养1h后，3000rpm离心5min，弃上清800μL，用剩余液体重悬细胞，分别均匀涂布于含Amp的LB平板上，分别标记为02、07和09，于37℃振荡培养过夜。三种质粒分别命名为p02、p07、p09。
质粒构建的技术路线如图2-4。
5)克隆质粒酶切鉴定将步骤4)中培养的菌液进行质粒提取，提取步骤按照质粒小量提取试剂盒(TAKARA)的说明书进行。纯化后的质粒于37℃酶切3小时后琼脂糖凝胶电泳观察结果，如图5所示，为重组质粒p02、p07和p09PCR扩增及质粒酶切鉴定结果。酶切体系如下：
6)序列测定将PCR鉴定和酶切鉴定均正确的大肠杆菌重组菌送上海生工生物技术有限公司进行测序。所得序列与NCBI数据库中已有猪链球菌的序列数据进行比对分析。测序结果见序列表7-9，其中，重组质粒p02测序结果如SEQIDNO.7所示，重组质粒p07测序结果如SEQIDNO.8所示，重组质粒p09测序结果如SEQIDNO.9所示。
7)阳性对照的配制上述测序正确后的质粒分别提取纯化质粒，纯化后的质粒用紫外分光光度计测定在280nm和260nm波长时的光吸收值(OD)，按公式拷贝数/mL＝(amount(ng/μL×10-9)×6.022×1023)/(DNAlength×660)分别计算质粒p02、p07、p09的浓度(拷贝数)。
分别将质粒p02、p07、p09的浓度用ddH2O稀释至浓度为3×106拷贝数/mL、3×104拷贝数/mL、3×106拷贝数/mL。最后按1：1：1的比例将3种质粒混合在一起，充分混匀，即为试剂盒中的阳性对照样品。将阳性对照分装至1.5mL样品管中，贴上标签，-20℃保存备用。
(3)阴性对照的制备选取双蒸水进行121℃，30min高压灭菌后，分装至EP管中，分装量为0.1mL或0.04mL，贴上标签，-20℃保存备用。
实施例3
一种检测来自死亡动物的样品中是否携带猪链球菌2型、猪链球菌7型和猪链球菌9型的方法，包括如下步骤：
(1)样品核酸提取：
从20只同种类的死亡动物选取样品组织，分别命名为待测样品1-20，然后分别提取样品组织的DNA基因组作为DNA模板，并溶于灭菌超纯水中，-20℃保存，备用；
(2)PCR扩增：
以步骤(1)提取的DNA基因组为DNA模板分别用所述的引物组cps2I-F/cps2I-R、cps7L-F/cps7L-R、cps9J-F/cps9J-R对2、7、9型猪链球菌的cps2I、cps7L、cps9J进行PCR扩增，得到PCR产物；
其中，PCR扩增中使用的PCR反应液配方为：每份PCR反应液包括
扩增反应条件为：
(3)结果分析：
PCR扩增结束后取10μLPCR产物于1％琼脂糖凝胶中，以100V电压电泳30min，紫外灯下观察结果，如图6-7所示。从图中可见，待测样品1-20中能检测出待测样品1-10中携带2或7或9型猪链球菌，而待测样品11-20均为检出的2或7或9型猪链球菌；此外，从待测样品1-10的检测结果可以看出，2或7或9型猪链球菌的条带之间的间距较宽，能够清楚判断待测样品携带的是何种猪链球菌的血清型。
下面，对实施例2中的试剂盒进行特异性试验以及敏感性试验的分析。
(1)试剂盒的特异性试验
分别以大肠杆菌、巴氏杆菌、波氏杆菌、沙门氏菌和副猪嗜血杆菌为模板用上述PCR预混液进行PCR反应；同时分别以猪链球菌1、3-6、8、9-31、33型猪链球菌的基因组为模板进行PCR反应，反应体系和反应程序同上，鉴定该试剂盒的特异性。
结果如图8所示，从图中可见，显示该试剂盒具有较好的特异性，与大肠杆菌、巴氏杆菌、波氏杆菌、沙门氏菌和副猪嗜血杆菌以及猪链球菌1、3-6、8、9-31、33型猪链球菌都没有交叉反应。
(2)试剂盒敏感性试验
将培养过夜的2、7、9型菌液分别10倍稀释至10-7次方，ddH2O为阴性对照，和原浓度的菌液对多重PCR的敏感性进行检测。并将菌液10-6-10-4次方稀释的菌液分别涂布平板，37℃过夜培养后，分别计算每个型菌株的菌液浓度。
将培养过夜的各型模板稀释至10-8次方，ddH2O为阴性对照，分别以各稀释度的菌液为模板进行多重PCR的敏感性检测。
如图9-11所示，试验结果显示，2型的检出限为3cfu，7型的检出限为4cfu，9型的检出限可达5cfu。
使用本发明的试剂盒通过对样品简单的处理便可快速检测样品中否携带猪链球菌2型、猪链球菌7型和猪链球菌9型；本发明的试剂盒具有操作简单、快速、结果判定方便、特异性强、灵敏度高的优点。
对本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及形变，而所有的这些改变以及形变都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种辅助鉴定猪链球菌2型、猪链球菌7型和猪链球菌9型的引物组，其特征在于，由如下引物对组成：由如SEQIDNO.1所示的核苷酸序列和如SEQIDNO.2所示的核苷酸序列组成的用于辅助鉴定猪链球菌2型的引物对；由如SEQIDNO.3所示的核苷酸序列和如SEQIDNO.4所示的核苷酸序列组成的用于辅助鉴定猪链球菌7型的引物对；由如SEQIDNO.5所示的核苷酸序列和如SEQIDNO.6所示的核苷酸序列组成的用于辅助鉴定猪链球菌9型的引物对。
2.权利要求1所述引物组在制备辅助鉴定猪链球菌2型、猪链球菌7型和猪链球菌9型的试剂盒中的应用。
3.一种辅助鉴定猪链球菌2型、猪链球菌7型和猪链球菌9型的试剂盒，其特征在于，包括PCR预混液、阳性对照以及阴性对照，所述PCR预混液包括Taq聚合酶、dNTPs、如权利要求1所述的引物组以及双蒸水。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照为猪链球菌2型、猪链球菌7型、猪链球菌9型的质粒组，阴性对照为无菌双蒸水。
5.一种检测来自死亡动物的样品中是否携带猪链球菌2型、猪链球菌7型和猪链球菌9型的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)样品核酸提取：
从死亡动物选取样品组织，提取样品组织的DNA基因组作为DNA模板，并溶于灭菌超纯水中，-20℃保存，备用；
(2)PCR扩增：
以步骤(1)提取的DNA基因组为DNA模板分别用如权利要求1中所述的引物组对2、7、9型猪链球菌的cps2I、cps7L、cps9J进行PCR扩增，得到PCR产物；
(3)结果分析：
将步骤(2)得到的PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后，紫外灯下观察目的条带。
6.根据权利要求5所述的检测来自死亡动物的样品中是否携带猪链球菌2型、猪链球菌7型和猪链球菌9型的方法，其特征在于，所述步骤(2)中的PCR扩增中PCR反应液包括18μLPCR预混液、1μL步骤(1)制备得到的DNA模板、2μL阳性对照和2μL阴性对照；扩增反应条件为：94℃10min预变性；94℃30s，60℃60s，72℃90s，35个循环；72℃延伸10min。
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