CN101724705A - 猪f18大肠杆菌抗性分子检测试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种猪F18大肠杆菌抗性的准确快速检测分子试剂盒及检测方法，使用本发明的7种工作液和提供的检测方法，基于分析α(1，2)岩藻糖基转移酶(FUT1)基因M307的多态性，可以简便准确地确定猪F18大肠杆菌抗性，实现对样本的大规模检测。本发明还提供了阳性对照，可以达到高敏感性和特异性鉴定猪F18大肠杆菌抗性的目的，操作简便，准确性高，重复性强，对于猪抗断奶仔猪腹泻和水肿病抗病育种以及流行病学研究和诊断具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及一种猪F18大肠杆菌抗性的快速检测器具及检测方法，属于分子生物学技术领域。
背景技术
在猪病中，断奶前后仔猪腹泻和水肿病是由肠毒素大肠杆菌
(Enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC)F18引起的最常见的急性、致死性传染病，该病发病率和死亡率均较高，治愈率很低。ETEC F18能否致病直接取决于仔猪小肠黏膜上皮细胞刷状缘有无与F18黏附粘素相应的受体，即E.coli F18受体(ETEC F18R)。因此研究ETEC F18R的候选基因，对今后通过标记辅助选择抗性个体并实现抗病育种具有重要意义。Vogeli等(1997)研究表明，FUT1基因是ETEC F18受体蛋白基因，位于猪染色体6q11区段，开放阅读框(ORF)的长度为1098bp；FUTI基因开放阅读框架第307bp的G-A碱基转换(M307G-A)导致其编码产物-FUT1酶第103氨基酸由丙氨酸(Ala)替换为苏氨酸(Thr)，改变了FUT1酶的活性，进而阻抑了ETEC F18对仔猪小肠的粘附。因此，FUT1基因型为AA型的猪抗大肠杆菌F18(ETEC F18)的侵染，而AG与GG型猪对ETECF18易感。Meijerink等(2000)研究也表明，α1岩藻糖转移酶基因(FUT1)开放阅读框架M307存在G/A突变位点，并且在M307处G对A为显性，即AA型为ETECF18R抗性猪，GG型为易感猪，杂合子AG型也同样为易感猪，因此可以基于分析α(1，2)岩藻糖基转移酶(FUT1)基因M307的多态性，通过分子生物学的手段，简便准确地确定猪F18大肠杆菌抗性，为实现抗病育种提供指导奠定基础。
鉴于F18大肠杆菌在养猪生产中引起的巨大危害，人们一直在寻求一种在养猪生产实践中准确快速的鉴定F18大肠杆菌抗性的检测方法，目前已有的方法主要基于大肠杆菌血清型和毒力因子的检测，取样困难，操作比较复杂，而且存在一定的主观性，在育种实践以及流行病学研究和诊断中的应用有很大的局限性。
发明内容
本发明涉及一种猪F18大肠杆菌抗性的准确快速检测分子试剂盒及检测方法。
本发明所述用于检测猪F18大肠杆菌抗性试剂盒包括①-⑦号试剂瓶：①特异性PCR引物(F：5′-CCAACGCCTCCGATTCCTGT-3′，R：5′-GTGCATGGCAGGCTGGATGA-3′10μmoL/L)、②10×Buffer、③dNTP混合物，④Taq酶(5U/μL)、⑤限制性内切酶Hin6 I(10U/μL)、⑥ddH2O、⑦阳性对照猪FUT1基因M307PCR产物。
通过检测α(1，2)岩藻糖基转移酶(FUT1)基因M307的DNA多态性区分个体对F18大肠杆菌抗性，高敏感性和特异性鉴定猪F18大肠杆菌抗性，使用本发明的产品和方法可以达到高敏感性和特异性鉴定猪F18大肠杆菌抗性的目的，操作简便，准确性高，重复性强，对于猪抗断奶仔猪腹泻和水肿病抗病育种以及流行病学研究和诊断具有重要意义。
本发明试剂盒的使用方法是：预先采用常规酚/氯仿抽提法获得猪基因组DNA后，利用本试剂盒①-④和⑥进行α(1，2)岩藻糖基转移酶(FUT1)基因的PCR扩增，PCR产物在1％琼脂糖凝胶中电泳，结束后用UVP凝胶成像系统分析检测扩增结果；再使用②、⑤和⑥，将⑦作为阳性对照，进行PCR产物酶切反应后，经8％的聚丙烯酰胺凝胶电泳银染分析，对照⑦呈现的带型判定测定个体对F18大肠杆菌的抗性。
本发明的优点：
1)本发明基于分子生物学原理和研究结果设计，试剂盒中的所有试剂均为可以直接使用的工作液，使用本发明只需要采集少量猪的耳组织和具有基本的分子生物学实验条件，按照本发明提供的检测方法就可以简便准确地确定猪F18大肠杆菌抗性，而且可以实现对样本的大规模检测。
2)本发明还提供了阳性对照猪FUT1基因M307 PCR产物，通过被测试样本和阳性对照同时检测并对结果进行对照，可以达到高敏感性和特异性鉴定猪F18大肠杆菌抗性的目的。
所述的检测方法包括：
1)猪基因组DNA FUT1基因M307的PCR扩增
2)FUT1基因M307扩增产物的酶切分析
3)FUT1基因M307的PCR-RFLP分型
附图说明
图1为猪基因组DNA FUT1基因M307扩增产物图
其中，M为DL2000标准分子量；1～6为PCR扩增产物
图2为FUT1基因M307扩增产物Hin6 I酶切图
其中，泳道6-8为AA型(带型I)，泳道1、3、5为AG型(带型II)，泳道2、4为GG型(带型III)，M为pUC19 DNA/Msp I(Hpa II)marker
具体实施方式
7种工作液的来源或制备：
①特异性PCR引物(F：5′-CCAACGCCTCCGATTCCTGT-3′，R：5′-GTGCATGGCAGGCTGGATGA-3′10μmoL/L)
引物送上海生工生物技术有限公司合成，新合成的引物为固体粉末状，将装有粉末引物的离心管进行瞬间离心，加入灭菌双蒸水，充分混匀后，4℃过夜，然后置于-20℃保存。
V＝(OD×33)/(C×MW)
其中：V为加入双蒸水的体积(μL)；MW为所合成引物的分子量(道尔顿)；C为引物的浓度，一般配成100pM的储存液。制备试剂盒时然后再用双蒸灭菌水稀释到10μmoL/L。
②10×Buffer
上海生工生物技术有限公司购买Taq酶时配套赠送
③dNTP混合物
上海生工生物技术有限公司购买浓度为10μmoL/L，制备试剂盒时再用双蒸灭菌水稀释到2.5μmoL/L
④Taq酶(5U/μL)
大连宝生物技术有限公司购买
⑤限制性内切酶Hin6 I(10U/μL)
上海生工生物技术有限公司购买
⑥ddH2O
实验室超纯水仪制备
⑦阳性对照猪FUT1基因M307 PCR产物。
选择前期进行FUT1基因M307基因型检测后获得的AA基因型个体，饲养于本实验室动物房，经过F18大肠杆菌体内和体外攻毒试验验证后，确定为阳性对照猪，每个个体取耳组织块约1.0g，按常规酚-氯仿法提取DNA。根据本试剂盒的材料和使用方法进行PCR扩增(具体方法见实施例一)。PCR产物在1％琼脂糖凝胶中电泳，结束后用UVP凝胶成像系统分析检测扩增结果，将扩增片断大小在161b并且条带清晰的M307 PCR产物配置于试剂盒。
实施例一：
1)基因组DNA FUT1基因M307的PCR扩增
每个测试个体采耳组织块约1.0g，放入1.5mL的Eppendoff管内于冰盒中，按常规酚-氯仿法提取基因组DNA。利用本试剂盒①-④和⑥进行α(1，2)岩藻糖基转移酶(FUT1)基因的PCR扩增，PCR最终反应体系建立如下：
反应条件：样品经94℃变性5min后，按照下列程序进行扩增：94℃40s，60℃40s，72℃45s，32个循环后，72℃延伸10min，4℃保存。PCR产物在1％琼脂糖凝胶中电泳，结束后用UVP凝胶成像系统分析检测扩增结果，扩增片断大小应为161bp(图1)。
2)FUT1基因M307扩增产物的酶切分析
酶切消化反应体系建立如下：
置37℃恒温反应3h后，经10％的聚丙烯酰胺凝胶电泳银染分析。
3)FUT1基因M307的PCR-RFLP分型
FUT1基因M307扩增产物经限制性内切酶Hin6 I酶切后产生3种带型(带型I、带型II和带型III)，其基因型分别定义为AA、AG和GG(图2)，等位基因GG存在一个Hin6 I酶切位点，当该位点未发生G→A突变时，扩增产物能被内切酶完全消化，产生117bp/44bp(带型III)的条带；当等位基因G发生突变后，由于该等位基因上酶切位点的丢失，Hin6 I不能对其消化，形成带型I(161bp)，在GA杂合等位基因时可显示带型II。
试剂盒中提供的⑦阳性对照猪FUT1基因M307 PCR产物酶切后的带型即为带型I，为F18大肠杆菌抗性基因型(AA基因型)，凡是呈现带型I的个体即为F18大肠杆菌抗性型，带型II和带型III的个体为F18大肠杆菌易感型。
Claims (2)
1.一种用于检测猪F18大肠杆菌抗性的试剂盒，其特征在于，包括以下7种试剂：
①特异性PCR引物：F：5′-CCAACGCCTCCGATTCCTGT-3′，R：5′-GTGCATGGCAGGCTGGATGA-3′，5pmoL/L
②10×Buffer
③dNTP混合物
④Taq酶(5U/μL)
⑤限制性内切酶Hin6 I(10U/μL)
⑥ddH2O
⑦阳性对照猪FUT1基因M307PCR产物。
2.一种采用权利要求1所述的试剂盒检测猪F18大肠杆菌抗性的方法，其特征在于，包括：将预先获得猪基因组DNA利用本试剂盒①-④和⑥进行α(1，2)岩藻糖基转移酶基因的PCR扩增，PCR产物在1％琼脂糖凝胶中电泳，电泳结束后用UVP凝胶成像系统分析检测扩增结果；再使用②、⑤和⑥，将⑦作为阳性对照，进行PCR产物酶切反应后，经8％的聚丙烯酰胺凝胶电泳银染分析，依据对照⑦呈现的带型判定测定个体对F18大肠杆菌的抗性。
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