CN102864221A

CN102864221A - 甘蔗赤腐病菌pcr检测方法

Info

Publication number: CN102864221A
Application number: CN2012103047072A
Authority: CN
Inventors: 阙友雄; 许莉萍; 黄宁; 徐景升; 袁照年; 罗俊
Original assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Current assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Priority date: 2012-08-25
Filing date: 2012-08-25
Publication date: 2013-01-09

Abstract

本发明涉及一种甘蔗赤腐病菌PCR检测方法，包括基因组DNA的提取、PCR检测体系建立和PCR产物的检测。本发明的甘蔗赤腐病菌PCR检测方法，具有灵敏度高，所需要的DNA用量少的特点；与常规的根据病菌培养后的孢子形态特征鉴定或根据田间种植后病害表型症状鉴定的方法相比，具有操作简便快速、准确性高和实用性好等优点。

Description

甘蔗赤腐病菌PCR检测方法

技术领域

本发明涉及一种甘蔗病原菌的检测方法，具体涉及甘蔗赤腐病菌PCR检测方法，属于生物技术领域。

背景技术

甘蔗赤腐病属真菌性病害，分布于世界各蔗区。病原无性阶段为镰孢炭疽菌（Colletotrichum falcatum），主要危害甘蔗蔗茎，也危害叶中脉和叶鞘，并可导致植株死亡。该病可造成甘蔗减产，因品种抗病性而不同，严重时减产可达30%以上，并导致蔗糖份显著下降，同时，蔗茎病部的红色素和蔗茎的腐烂都会严重影响糖的质量。

甘蔗赤腐病菌可以分生孢子盘和菌丝体在枯叶、宿根或蔗渣中，尽管甘蔗赤腐病菌不能由土壤传播，但在土壤中可存活1-2个月，因此，甘蔗种茎带菌和甘蔗收获后田间植株残材是病原最初的来源。蔗茎伤口、虫孔和生长裂缝等是病原侵入的主要通道，对于健康植株，病原主要由叶痕、根点、生长环和芽等侵入，病原借助雨水、重露水、灌溉和风进行传播。因此，在做好田间卫生的前提下，种茎是否带菌就成为该病害发生的关键，快速、准确判断种茎是否带菌就显得尤为重要。目前，一般采取两种方法判断种茎是否带菌：一种是采用分离培养技术，在建立纯培养物的基础上，根据培养物所产生孢子的形态特征进行鉴定；另一种是基于该病害表型症状，因为甘蔗发病后，叶片中脉、叶鞘可见赤斑，病害进一步发展后，蔗茎纵剖时，可见蔗肉红色，部分品种还会出现中部夹杂与蔗茎垂直的白色圆形或长形斑块，并发出酸味腐，因此，采用种茎种植后，观察是否发生甘蔗赤腐病进行鉴定。但是，上述的第一种方法由于分离培养以及最终建立纯培养物需要时间长，加上分离过程杂菌污染等，都会影响分离效果，检出效率不高；第二种方法则由于甘蔗、环境条件和病原菌三者之间的互作，可能导致即使种茎中存在该病原，病害也不一定会发生，何况还需要长达几个月的漫长时间。显然，目前已有的技术方法，对于判断种茎是否带菌是不适用的，急需建立一种能够实现“快速”与“准确”目标要求的甘蔗赤腐病菌检测方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种甘蔗赤腐病菌PCR检测方法，可用于田间甘蔗赤腐病菌的早期诊断及检测。

本发明的甘蔗赤腐病菌PCR检测方法，包括基因组DNA的提取、PCR检测体系建立和PCR扩增产物的检测，其特征在于：

1、PCR检测体系的建立： PCR扩增体系为总体积25 μl，内含2.5 μl 10×PCR缓冲液，2.5 μl 25 mmol/L MgCl₂，0.5 μl 10 mmol/L dNTP，10 mmol/L 的检测引物PCR-F和PCR-R各1.0 μl，1.25 U Taq DNA Polymerase，20-50 ng基因组DNA，ddH₂O补足到25 μl； PCR扩增程序如下：94 ℃ 4 min；94 ℃ 1 min，65 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃8 min；所述10×PCR缓冲液组成成分为100 mmol/L pH8.5 Tris-HCl，500 mmol/L KCl和15 mmol/L MgCl₂；

所述检测引物：

PCR-F：5'-CTCTTGAGAGCAAGCTGCGC-3′，

PCR-R：5'-GATACTCGGTTGGGTAGG-3'；

2、PCR扩增产物的检测：琼脂糖凝胶电泳检测的PCR扩增图谱中，在分子量为440 bp的位置出现DNA条带，为甘蔗赤腐病菌存在的标志。

本发明的应用效果：

本发明的甘蔗赤腐病菌PCR检测方法，具有灵敏度高，所需要的DNA用量少的特点；与常规的根据病菌培养后的孢子形态特征鉴定或根据田间种植后病害表型症状鉴定的方法相比，具有操作简便快速、准确性高和实用性好等优点。

1、操作简便快速：应用本发明方法，提取待测植株DNA、PCR扩增和常规琼脂糖凝胶电泳即可判定检测结果，无须对病原菌进行培养或田间种植鉴定，一般检测过程可在5～6小时完成。

2、准确性高：传统的甘蔗赤腐病菌检测技术是根据病原物孢子的形态特征或者根据田间种植后病害表型症状鉴定来确定检疫对象，无法排除人为因素的干扰，很难区分形态相似种或容易受环境条件的影响，从而导致准确性不高；同时，形态学检测在近缘菌内的不同种之间可区别的特征较少，有些甚至没有什么差异，同时还需要判断者具有丰富的知识和经验，方可作出准确的判断。而本发明根据甘蔗赤腐病菌的特异性序列，选择甘蔗赤腐病菌特有的一段保守序列设计特异引物，能根据变异序列设计特异性引物进行扩增比较，为病原菌的检测和鉴定提供准确的靶标位点。经过与甘蔗赤腐病菌以及其它不同植物中近缘病原菌的比较，该引物的准确率高。

3、实用性好：直接从待测甘蔗品种中检测甘蔗赤腐病菌具有重要的实际应用价值。目前，在甘蔗品种及其种质资源交换过程中，甘蔗赤腐病菌的检测方法根据病菌培养物所产生孢子的形态特征鉴定或根据田间种植后病害表型症状鉴定，无法满足快速检疫的需要。为了使我们的检疫方法具有实际的应用价值，我们采用直接从待测甘蔗品种中提取DNA后直接进行PCR扩增，可在5～6小时内完成对甘蔗赤腐病菌的检测。因此本方法大大提高了检测的效率。

本发明为甘蔗赤腐病菌的鉴定，提供了高灵敏度的快速检测体系，可用于田间甘蔗赤腐病菌的早期诊断及检测，对我国抗赤腐病甘蔗育种和抗赤腐病甘蔗种质资源的保护具有重要的意义。

附图说明

图1为使用甘蔗PCR-F和PCR-R检测引物鉴定6个待检测甘蔗品种中是否受甘蔗赤腐病菌侵染（即是否含有甘蔗赤腐病菌）的PCR扩增图谱。其中各泳道中，M代表分子量标准；C代表空白对照；P代表对应甘蔗品种中含有甘蔗赤腐病菌；N代表对应甘蔗品种中不含甘蔗赤腐病菌；1-6代表6个甘蔗品种。

具体实施方式

为了进一步阐明本发明而不是限制本发明，以下结合实施例加以说明。

实施例1 甘蔗赤腐病菌PCR检测方法

甘蔗赤腐病菌PCR检测方法，包括以下步骤：

1、基因组DNA的提取

（1）取5克待检测甘蔗植株的茎节或蔗肉组织，置研钵，加入液氮磨碎成粉末，并在解冻前转入50 ml的离心管中；

（2）加入15 ml、65 ℃预热的SDS提取液，混匀后在65 ℃水浴保温40 min；

（3）加8 ml 3 mol/L KAC混匀后，冰浴30 min；

（4）25000 g，4 ℃离心，20 min；收集上清液，并加入12 ml于4 ℃预冷的异丙醇；

（5）-20 ℃放置30 min后，钩出漂浮在液面的DNA，置于一干净的1.5 ml 离心管中，晾干后加入750 μl TE溶液；加等体积的平衡饱和酚，摇匀，12000 g，4 ℃离心，10 min；

（6）转移上清至另一干净的1.5 ml 离心管中，加等体积的氯仿，12000 g，4 ℃，离心10 min后移出上层水相；

（7）在水相中加2倍体积的无水乙醇，12000 g，4 ℃离心10 min，留沉淀，用体积浓度为70 %的乙醇清洗2次，并晾干；

（8）加灭菌后的TE溶液200 μl溶解后，置-20 ℃冰箱中保存备用。

2、PCR检测体系的建立

PCR扩增体系为总体积25 μl，内含2.5 μl 10×PCR缓冲液，2.5 μl 25 mmol/L MgCl₂，0.5 μl 10 mmol/L dNTP，10 mmol/L 的检测引物PCR-F和PCR-R各1.0 μl，1.25 U Taq DNA Polymerase，20-50 ng基因组DNA，ddH₂O补足到25 μl。

PCR扩增程序如下：94 ℃ 4 min；94 ℃ 1 min，65 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃8 min；所述10×PCR缓冲液组成成分为100 mmol/L pH8.5 Tris-HCl，500 mmol/L KCl和15 mmol/L MgCl₂。

所述检测引物：

PCR-F：5'-CTCTTGAGAGCAAGCTGCGC-3′，

PCR-R：5'-GATACTCGGTTGGGTAGG-3'。

3、PCR扩增产物的检测

具体的检测方法为，取PCR扩增产物10 μl，加5 μl含有溴酚蓝的上样缓冲液，混匀后点样于含有0.5 μg/ml溴化乙锭的1.5 %琼脂糖凝胶上，于0.5×TBE缓冲液中，10 V/cm恒定电压下电泳1.5 h，结束后在凝胶成像系统上成像并进行凝胶分析。

PCR产物的检测结果：采用检测引物PCR-F和PCR-R对待检测甘蔗品种的基因组DNA进行PCR扩增，结果如图1所示，受甘蔗赤腐病菌侵染（即含有甘蔗赤腐病菌）的甘蔗品种出现440 bp的DNA条带，而没有受到甘蔗赤腐病菌侵染（即不含甘蔗赤腐病菌）的甘蔗品种则不出现440 bp的DNA条带。

我们取6个待检测甘蔗品种用PCR检测和病原菌分离培养后的形态特征判别方法鉴定的结果进行比较，结果是一致的。如图1所示，出现分子量为440 bp的DNA条带的甘蔗品种，经病原菌培养后的孢子形态特征鉴定均含甘蔗赤腐病菌；未出现分子量为440 bp的DNA条带的甘蔗品种，经病原菌培养后的孢子形态特征鉴定结果显示均不含甘蔗赤腐病菌。

本发明采用的主要试剂如下（所有化学试剂均为分析纯）

1、SDS提取液：NaCl 8 g、KCl 0.2 g、Na₂HPO₄ 1.44 g、KH₂PO₄ 0.24 g、SDS 2 g、甘油50 ml, 灭菌去离子1 L，pH 值7.4；

2、TE溶液：10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA；

3、上样缓冲液：0.1 %溴酚蓝，40 %蔗糖；

4、0.5×TBE缓冲液：44.5 mmol/L Tris，50 mmol/L HBO₃，1 mmol/L EDTA；

5、PCR扩增试剂购自大连宝生物公司。

本发明所使用的仪器主要如下：

1、PCR扩增仪：德国Eppendorf 5331 PCR扩增仪；

2、电泳仪：北京六一仪器厂DYCZ-20A DNA序列分析电泳仪；

3、离心机：德国Eppendorf 5810/5810R多功能台式离心机；

4、凝胶成像系统：美国BIO-RAD Gel Doc 2000凝胶成像系统。

Claims

1.一种甘蔗赤腐病菌PCR检测方法，包括基因组DNA的提取、PCR检测体系建立和PCR扩增产物的检测，其特征在于：

（1）PCR检测体系的建立： PCR扩增体系为总体积25 μl，内含2.5 μl 10×PCR缓冲液，2.5 μl 25 mmol/L MgCl₂，0.5 μl 10 mmol/L dNTP，10 mmol/L 的检测引物PCR-F和PCR-R各1.0 μl，1.25 U Taq DNA Polymerase，20-50 ng基因组DNA，ddH₂O补足到25 μl； PCR扩增程序如下：94 ℃ 4 min；94 ℃ 1 min，65 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃8 min；所述10×PCR缓冲液组成成分为100 mmol/L pH8.5 Tris-HCl，500 mmol/L KCl和15 mmol/L MgCl₂；

所述检测引物：

PCR-F：5'-CTCTTGAGAGCAAGCTGCGC-3′，

PCR-R：5'-GATACTCGGTTGGGTAGG-3'；

（2）PCR扩增产物的检测：琼脂糖凝胶电泳检测的PCR扩增图谱中，在分子量为440 bp的位置出现DNA条带，为甘蔗赤腐病菌存在的标志。