CN105331714A

CN105331714A - 一种荔枝霜疫霉菌lamp引物及其快速检测方法

Info

Publication number: CN105331714A
Application number: CN201510820807.4A
Authority: CN
Inventors: 李本金; 陈庆河; 刘裴清; 刘小丽; 翁启勇
Original assignee: Institute of Plant Protection of FAAS
Current assignee: Institute of Plant Protection of FAAS
Priority date: 2015-11-24
Filing date: 2015-11-24
Publication date: 2016-02-17
Anticipated expiration: 2035-11-24
Also published as: CN105331714B

Abstract

本发明公开了一种荔枝霜疫霉菌LAMP引物及其快速检测方法，专用于荔枝霜疫霉菌特异检测。主要采用设计了一种荔枝霜疫霉菌的LAMP引物，经过恒温扩增肉眼观察或琼脂糖凝胶电泳检测，可观察到绿色荧光或出现LAMP特征性的梯形带。所发明的LAMP引物及其用法可被用于生产实践中荔枝霜疫霉菌感染的植株中荔枝霜疫霉菌的快速、灵敏、准确的检测，同时可用于田间病害的早期诊断和病菌的监测和鉴定，为荔枝霜疫霉菌引起的病害防治提供可靠的技术和理论依据。

Description

一种荔枝霜疫霉菌LAMP引物及其快速检测方法

技术领域

本发明涉及一种荔枝霜疫霉菌LAMP引物及其快速检测方法，专用于荔枝霜疫霉菌高灵敏度快速分子检测，同时可用于田间荔枝霜疫霉病的早期诊断和病菌的监测和鉴定，属于农作物病害检测、鉴定及防治技术领域。

背景技术

荔枝霜疫霉病是我国荔枝产区普遍发生且危害严重的病害，其病原菌为荔枝霜疫霉菌（peronophythoralitchii）。该病于1978年在我国台湾首次报道，目前在广东、广西、福建、海南台湾等地均有发生，不仅严重为害接近成熟的果实，也为害嫩梢、叶片、花穗、结果小枝、果柄及幼果，引起大量落花、落果、裂果和烂果，产量损失高达80%以上，甚至绝收，是造成荔枝长期单产低且不稳产的主要原因之一，此外，该病在荔枝果实贮运期仍继续危害，严重影响产量、品质以及鲜果的储运和外销，造成巨大的经济损失，影响荔枝产业可持续稳定发展。

目前对荔枝霜疫霉病的检测大多仍沿用传统培养和血清学鉴定方法。传统荔枝霜疫霉菌的分类鉴定主要是基于形态学特征、致病性测定、生理生化特性等，程序繁琐，所需时间较长且灵敏度较低，鉴定时还易受人为及环境等诸多因素的干扰，而且不能直接从植物组织中检测出病原菌，难以满足病害控制中快速、灵敏、稳定的检测要求，很容易错过病害防治的最佳时期，而免疫血清学鉴定方法虽已建立，但是血清的制备过程耗时耗力，常常受到抗血清质量的影响，且可能存在交叉反应，特异性较差，容易造成假阳性，因此这些方法的应用均受到一定的限制。

PCR技术为植物病原诊断提供了快速、灵敏、准确的优势，但由于目前PCR检测技术仍然需要PCR仪、电泳和凝胶成像系统等昂贵的专业仪器和分子生物学试剂，且需要分子生物学专业实验人员操作，限制了该检测方法的推广应用。环介导等温扩增技术(Loop-mediatedisothermalamplification，LAMP)具有简单、快速、高效、经济等特征。该技术可在60℃~65℃恒温条件下，利用高活性的链置换DNA聚合酶(BstDNApolymerase)对目的DNA片段进行特异性扩增。在1个小时内，能够将少量拷贝数的目的基因扩增至10⁹个拷贝数。LAMP反应产物不仅可以通过浊度仪、real-timePCR仪及凝胶电泳仪进行检测，而且还可以通过SYBRGreenⅠ、钙黄绿素、羟基萘酚蓝染色后，肉眼识别。由于LAMP反应简单、快速、高效、经济等特征，因而具有极为广泛的应用前景。目前LAMP检测主要应用于人畜病原物、食品安全和环境卫生的检测，在植物病原菌检测中报道较少，关于荔枝霜疫霉菌的LAMP检测国内外均未见报道。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中荔枝霜疫霉菌的生物学检测方法所需周期长、检测方法特异性差，灵敏度低的问题，提供一种荔枝霜疫霉菌的LAMP检测引物以及结果可靠、易于操作、特异性强、灵敏度高的荔枝霜疫霉菌的快速检测方法。

实现本发明的目的包括下列步骤：

1．LAMP引物的设计

对荔枝霜疫霉菌Ypt1序列进行扩增、克隆、测序，获得的荔枝霜疫霉菌Ypt1序列，应用在线LAMP引物设计软件primersoftwarePrimerExplorerV4(http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html;EikenChemicalCo.,Japan)设计一套LAMP检测引物，包括1对外引物(F3和B3)和1对内引物(FIP和BIP)，引物序列分别为：

外侧引物：

F3：5’-CCGTACGATCGAGCTGGA-3’；

B3：5’-CCGTCACGTCGTACACCA-3’；

内侧引物：

FIP：5’-TCGACTCAAGGTTACAGAACGCTGCAAGACCATCAAGCTCCA-3’；

BIP：5’-GTGCTTTTATAGTGGGACACCGCCGCGGTAGTAGCTGCTAGT-3’；

2．荔枝霜疫霉菌快速检测体系的建立

所述的LAMP反应体系为25.0μL：包括F3与B3各0.2μM，FIP与BIP各1.6μM，1×ThermopolBuffer，1.0mMdNTPs，0.8M甜菜碱，6.0mM硫酸镁，0.1%Tween-20，

8UBstDNA聚合酶为，50ng模板DNA，50μM钙黄绿素，500μM氯化锰，不足部分用无菌双蒸水补足。

所述的LAMP反应条件为在63℃温育60min，80℃保温5min。

所述的检测方法为荧光染料目测观察法和琼脂糖凝胶电泳法。所述荧光染料目测观察法：在LAMP反应体系中以50μM钙黄绿素-500μM氯化锰为显色剂，显色结果观察到绿色荧光判断为阳性，橘黄色判断为阴性。所述琼脂糖凝胶电泳法：取2uLLAMP产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，如果出现LAMP特征性的梯形带判断为阳性，没有出现扩增条带判断为阴性。

该方法可用于带菌植株的高灵敏度快速检测。建立荔枝霜疫霉菌快速、简便、特异性强、灵敏度高的监测技术体系，对于荔枝霜疫霉菌引起病害显症之前的早期监测，确定病害防治最佳时期具有十分重要的意义。

本发明的关键性技术是荔枝霜疫霉菌的高效特异扩增的引物序列及其扩增方法。为了验证荔枝霜疫霉菌的特异引物序列，本发明以我国福建、广东、广西、台湾等省的21株荔枝霜疫霉菌和其它13种不同卵菌及9种真菌为供试材料，采用CTAB法提取供试菌株基因组DNA，具体方法如下：取0.1g冷冻干燥后的菌丝粉于5.0mL离心管中，加入2mL65℃预热的2%CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)提取液（提取液的配方为：2%CTAB；100mmol/LTris-HCl（三羟甲基氨基甲烷盐酸盐），pH8.0；20mmol/LEDTA（乙二胺四乙酸二钠），pH8.0；1.4mol/LNaCl）和0.2%巯基乙醇）充分混匀后，于65℃水浴1h，每10min振荡混匀一次。水浴结束后取出，放至室温。加入等体积的酚/氯仿/异戊醇（酚、氯仿和异戊醇的体积比为25:24:1），充分颠倒混合，将提取液中含有的蛋白杂质变性，分装至2.0mL离心管中，室温下12,000rpm离心10min。将上清液（水相）转移到新1.5mL离心管中，向上清中加入1倍体积异丙醇，充分颠倒混匀，使DNA从溶液中析出，形成絮状沉淀（可室温或-20℃放置1-2h促进DNA沉淀），4℃离心，12,000rpm，20min。弃上清，加入500μL70%乙醇洗涤，颠倒混匀，至沉淀悬起，4℃，12,000rpm离心5min。重复洗涤一次，弃酒精，在超净工作台上自然晾干无酒精味后加入适量无菌双蒸水溶解DNA，DNA溶解后，按样品体积加入1/10体积的RNaseA（10mg/mL）并在37℃处理10min，去除RNA，得到DNA溶液，用NanoDrop检测DNA浓度并稀释备用。

经对供试菌株和21株荔枝霜疫霉菌的特异性进行LAMP验证。

LAMP反应体系为25uL：包括F3与B3各0.2μM，FIP与BIP各1.6μM，1×ThermopolBuffer，1.0mMdNTPs，0.8M甜菜碱，6.0mM硫酸镁，0.1%Tween-20，

所述的LAMP反应条件为在63℃温育60min，80℃保温5min。

除了来自我国福建、广东、广西、台湾等省的21株荔枝霜疫霉菌显色结果可观察到绿色荧光或琼脂糖凝胶电泳检测出现LAMP特征性的梯形带，检测了其它13种不同卵菌及9种真菌显色结果为橘黄色或琼脂糖凝胶电泳没有出现扩增条带。这说明该引物可被用于生产实践中发病组织及土壤中荔枝霜疫霉菌快速可靠的检测和鉴定。

当在用于荔枝组织中存在荔枝霜疫霉菌时，采用NaOH快速裂解法提取荔枝霜疫霉菌的DNA，具体过程如下：(1)将荔枝病叶或病茎洗净、晾干，剪取发病部位；(2)按1mg病叶加入10uL（0.5mol/LNaOH，0.5%PVP）计量，将组织充分磨碎成糊，在12,000g离心机中离心5min；(3)取上清20uL与等体积的0.1mol/L的Tris-HCl（pH8.0）混合；(4)稀释10倍、100倍、1000倍，分别取1μL原液、10倍、100倍、1000倍液作为LAMP模板进行等温扩增。

按如下LAMP反应体系和反应条件用所设计的引物进行检测：

①LAMP反应体系为25uL：包括F3与B3各0.2μM，FIP与BIP各1.6μM，1×ThermopolBuffer，1.0mMdNTPs，0.8M甜菜碱，6.0mM硫酸镁，0.1%Tween-20，

8UBstDNA聚合酶为，1μL模板DNA，50μM钙黄绿素，500μM氯化锰，不足部分用无菌双蒸水补足。

所述的LAMP反应条件为在63℃温育60min，80℃保温5min。

②LAMP反应结束后，显色结果观察到绿色荧光，或取2uL扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，结果出现LAMP特征性的梯形带，即可判断所述的荔枝组织中存在荔枝霜疫霉菌；否则所述的荔枝组织中不存在荔枝霜疫霉菌。

本发明有益效果：本发明方法适用于发病组织中荔枝霜疫霉菌的快速可靠的检测和鉴定，对于农业生产中荔枝霜疫霉菌引起的病害防治具有重要的实用价值。本发明与现有技术相比，具有以下的技术优势和积极效果：

1、结果可靠：本发明所设计出的LAMP检测引物，已经对源于我国福建、广东、广西、台湾等地的荔枝霜疫霉菌和带荔枝霜疫霉菌的植物组织进行了测试验证，因此结果可靠性具有充分的保证；

2、特异性强：本发明所采用的LAMP引物是针对荔枝霜疫霉菌Ypt1基因序列中6个不同区域设计出4条特异性引物，6个区域中任何区域与引物不匹配均不能进行核酸扩增，故特异性高。

3、灵敏度高：LAMP对荔枝霜疫霉菌的检测灵敏度在DNA水平上可达到10fg/25μL。

4、实用性好：本发明所设计出的LAMP引物，可用于带荔枝霜疫霉菌的组织中高灵敏度快速检测，因此本方法的实用性强，可满足对带菌组织中存在的荔枝霜疫霉菌进行快速可靠的检测和鉴定的需要；

5、操作简便快速：应用本发明方法，对带荔枝霜疫霉菌的组织进行检测可在数小时内完成，且LAMP核酸扩增是在等温条件下进行，只需一个水浴锅即可，不需要复杂的仪器设备和昂贵的分子试剂，结果肉眼直接可见。

附图说明

图1为本发明荔枝霜疫霉菌的特异LAMP检测结果图。其中：泳道M为DL2000DNAmarker，泳道1为阴性对照，泳道2-5为不同来源荔枝霜疫霉菌；泳道6-12为其他卵菌和真菌菌株。

图2为本发明荔枝霜疫霉菌的LAMP灵敏度检测结果图。其中：泳道M为DL2000

DNAmarker，泳道1为阴性对照，泳道2–9分别为：1ng/μL，100pg/μL，10pg/μL，1pg/μL，100fg/μL，10fg/μL，1fg/μL、100ag/μL的不同浓度荔枝霜疫霉菌DNA。

图3为本发明发病植株的检测结果图。其中：泳道M为DL2000DNAmarker，泳道1为阴性对照，泳道2为阳性对照；泳道3-5,7-9为发病的荔枝霜疫病植株；6、10为健康的荔枝植株。

具体实施方式

本发明的技术内容包括荔枝霜疫霉菌的LAMP检测引物，LAMP引物及其序列分别为：

F3：5’-CCGTACGATCGAGCTGGA-3’

B3：5’-CCGTCACGTCGTACACCA-3’

FIP：5’-TCGACTCAAGGTTACAGAACGCTGCAAGACCATCAAGCTCCA-3’

BIP：5’-GTGCTTTTATAGTGGGACACCGCCGCGGTAGTAGCTGCTAGT-3’

利用LAMP引物检测荔枝霜疫霉菌显色结果可观察到绿色荧光或琼脂糖凝胶电泳出现LAMP特征性的梯形带。

实施例1：LAMP引物对荔枝霜疫霉菌的特异性扩增

1．荔枝霜疫霉菌的LAMP特异检测

①LAMP反应体系为25.0μL：包括F3与B3各0.2μM，FIP与BIP各1.6μM，1×ThermopolBuffer，1.0mMdNTPs，0.8M甜菜碱，6.0mM硫酸镁，0.1%Tween-20，

所述的LAMP反应条件为在63℃温育60min，80℃保温5min。

②LAMP反应结束后，显色结果观察到绿色荧光判断为阳性，橘黄色判断为阴性；或取2μL扩增产物用2.0%琼脂糖凝胶电泳检测，如果出现LAMP特征性的梯形带判断为阳性，没有出现扩增条带判断为阴性。

2．检测结果

检测的特异性：除了来自我国福建、广东、广西、台湾等省的21株荔枝霜疫霉菌显色结果可观察到绿色荧光或琼脂糖凝胶电泳出现LAMP特征性的梯形带外，检测了其它13种不同卵菌及8种真菌菌株显色结果为橘黄色或琼脂糖凝胶电泳没有出现扩增条带，说明此引物具有很强的特异性。

实施例2：LAMP引物对荔枝霜疫霉菌的灵敏度检测

1．荔枝霜疫霉菌的LAMP灵敏性检测

采用10倍浓度系列稀释法将提取的荔枝霜疫霉菌DNA稀释成1ng/μL，100pg/μL，10pg/μL，1pg/μL，100fg/μL，10fg/μL，1fg/μL、100ag/μL共8个不同浓度梯度。

所述的LAMP反应条件为在63℃温育60min，80℃保温5min。

2．检测结果：荔枝霜疫霉菌LAMP灵敏度检测，显色结果可观察到绿色荧光或琼脂糖凝胶电泳出现LAMP特征性的梯形带，检测灵敏度可达10fg/25μL。

实施例3：发病组织中荔枝霜疫霉菌的检测

1．样品采集：植物组织样品采自福建福州市荔枝生产基地。

2．DNA提取及检测

发病植物组织采用NaOH快速裂解法提取荔枝霜疫霉菌DNA。

按下述方法进行LAMP检测：

①LAMP反应体系为25μL：包括F3与B3各0.2μM，FIP与BIP各1.6μM，1×ThermopolBuffer，1.0mMdNTPs，0.8M甜菜碱，6.0mM硫酸镁，0.1%Tween-20，

所述的LAMP反应条件为在63℃温育60min，80℃保温5min。

②LAMP反应结束后，显色结果观察到绿色荧光判断为阳性，橘黄色判断为阴性；或取2μL扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，如果出现LAMP特征性的梯形带判断为阳性，没有出现扩增条带判断为阴性。

3．检测结果

显色结果观察到绿色荧光或琼脂糖凝胶电泳出现LAMP特征性的梯形带，判断发病组织中感染荔枝霜疫霉菌。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCELISTING

<110>福建省农业科学院植物保护研究所

<120>一种荔枝霜疫霉菌LAMP引物及其快速检测方法

<130>4

<160>4

<170>PatentInversion3.3

<210>1

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

ccgtacgatcgagctgga18

<210>2

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

ccgtcacgtcgtacacca18

<210>3

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

tcgactcaaggttacagaacgctgcaagaccatcaagctcca42

<210>4

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

gtgcttttatagtgggacaccgccgcggtagtagctgctagt42

Claims

1.一种荔枝霜疫霉菌的LAMP引物，其特征在于：所述LAMP引物如下：

外侧引物：

F3：5’-CCGTACGATCGAGCTGGA-3’；

B3：5’-CCGTCACGTCGTACACCA-3’；

内侧引物：

FIP：5’-TCGACTCAAGGTTACAGAACGCTGCAAGACCATCAAGCTCCA-3’；

BIP：5’-GTGCTTTTATAGTGGGACACCGCCGCGGTAGTAGCTGCTAGT-3’。

2.一种荔枝霜疫霉菌的LAMP检测方法，其特征在于：利用权利要求1中所述的LAMP引物进行检测；LAMP反应体系为25μL：包括F3与B3各0.2μM，FIP与BIP各1.6μM，1×ThermopolBuffer，1.0mMdNTPs，0.8M甜菜碱，6.0mM硫酸镁，0.1%Tween-20，8UBstDNA聚合酶为，50ng模板DNA，50μM钙黄绿素，500μM氯化锰，不足部分用无菌双蒸水补足；所述的LAMP反应条件为在63℃温育60min，80℃保温5min。

3.根据权利要求2所述的荔枝霜疫霉菌的LAMP检测方法，其特征在于：在LAMP反应体系中，以50μMCalcein-500μMMnCl₂为显色剂，显色结果观察到绿色荧光判断为阳性，橘黄色判断为阴性；或取2uL扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，如出现梯形条带判断为阳性，没有出现则判断为阴性。

4.如权利要求1所述的荔枝霜疫霉菌的LAMP引物用于田间荔枝霜疫霉病的早期诊断和病菌的监测和鉴定。