CN101864484B - 一种番石榴焦腐病菌分子检测引物及其检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种番石榴焦腐病菌分子检测引物及其检测方法，专用于番石榴焦腐病特异分子检测。主要采用设计了一对番石榴焦腐病菌的特异引物(上游引物BF1：5′-TCCGGCCGCCAAAGGACC-3和下游引物BR1：5′-TCTTTGAGGCGCGTCCGCA-3′)，经过PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳，可在番石榴焦腐病菌纯DNA、带菌的发病组织特异性地扩增出片段长度为287bp的特异扩增产物。所发明的特异分子检测引物及其用法可被用于生产实践中焦腐病菌感染的植物组织中焦腐病菌的快速、灵敏、特异的检测，同时可用于田间病害的早期诊断和病菌的监测和鉴定，为焦腐病菌引起的病害的防治提供可靠的技术和理论依据。

Description

一种番石榴焦腐病菌分子检测引物及其检测方法

技术领域

本发明涉及番石榴焦腐病菌分子检测引物及其检测方法，属于农作物病害检测、鉴定及防治技术的领域。 

背景技术

番石榴焦腐病是由番石榴焦腐病菌(Botryosphaeria rhodina)侵染引起的一种毁灭性病害，由于番石榴果实采后生理代谢旺盛，鲜果易失水、褐变和腐烂。因此，采后番石榴的保鲜运输成为生产上亟待解决的问题。研究发现番石榴采后贮藏期真菌性病害主要是由于番石榴焦腐病采前病原真菌的潜伏侵染造成的，同时认为采后病害(特别是真菌性病害)是影响番石榴果实货架期的主要原因，而且番石榴焦腐病菌的分离频率最高。该病害给番石榴的品质和外观造成极大影响，严重降低其经济价值。因此，开展番石榴焦腐病菌检测，防止其从发病区向未发病区传播，以及在其发病初期进行诊断检测，对番石榴焦腐病的及时控制具有重要意义。 

传统的番石榴焦腐病菌检测方法是采用选择性培养基从植物组织中分离菌株，再对这些菌株的形态等进行鉴定，来确定是否存在番石榴焦腐病菌，或者用肉眼和借助显微镜技术对发病症状进行判定是否由番石榴焦腐病菌引起的病害。传统的检测方法不仅费时、准确度低，而且要求检测人员要有丰富的经验，最重要一点是它不能满足病害防治中制定最佳防治时期的需求，因此传统病原学检测方法已不能满足现代植物病理学研究的需要，因其很容易错过病害防治的最佳时期，且目前尚未见有关番石榴焦腐病菌快速检测方法技术的报道。 

随着分子生物学技术的发展，应用PCR技术对病原菌进行特异、灵敏的快速分子检测的成功例子已越来越多(Li et al，2003)。18S和28S间的ITS是较理想的真菌鉴定及检测的PCR引物区域。在相近的真菌中，由于ITS序列不需翻译，面临较小的进化选择压，在进化过程中可以将突变保留积累下来，从而ITS包含许多差异序列。利用ITS序列的多态性获得的特异性引物及PCR过程可以为病原菌的快速、准确检测提供可靠的分子检测工具，检测过程只需要简便的PCR和琼脂糖电泳操作，为植物病害的防治提供依据。 

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中番石榴焦腐病菌的生物学检测方法所需周期长、目前番石榴焦腐病菌分子检测方法特异性差，灵敏度低的问题，提供一种番石榴焦腐病菌的特异分子检测引物以及结果可靠、易于操作、特异性强、灵敏度高的番石榴焦腐病菌的快速分子检 测诊断的方法。该方法可用于带菌的植物组织的高灵敏度快速分子检测，此技术对于番石榴焦腐病菌引起病害显症之前的早期监测，确定病害防治最佳时期具有十分重要的意义。 

实现本发明的目的包括下列步骤： 

1.根据番石榴焦腐病核糖体rDNA-ITS序列的特异性，设计了对番石榴焦腐病菌具有特异扩增作用的一对PCR引物，即特异分子检测引物的序列为： 

上游引物BF1：5′-TCCGGCCGCCAAAGGACC-3′ 

下游引物BR1：5′-TCTTTGAGGCGCGTCCGCA-3′。 

2.番石榴焦腐病菌特异分子检测体系的建立 

(1)从发病的番石榴植物组织中采用CTAB法提取DNA； 

(2)以提取的DNA为模板上述的一对引物BF1/BR1通过PCR扩增；PCR反应体系25μl，包括2.5μl 10×PCR反应缓冲液，2.0mmol/L Mg²⁺，50μmol/L dNTPs，1.25U Taq DNA聚合酶，引物BF1/BR1各0.5μmol/L和10ng模板DNA，ddH₂O补足25μl；PCR反应条件为：95℃预变性1min，94℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸1min共30个循环；72℃延伸10min； 

(3)然后取步骤(2)的PCR扩增产物用琼脂糖电泳分离，经溴化乙锭染色后于紫外灯下观察，根据扩增产物的大小判定结果；如果能特异性地扩增出287bp的产物，即可判断所述的植物组织中存在了番石榴焦腐病菌。 

本发明的关键性技术是番石榴焦腐病菌的高效特异扩增的引物序列及其扩增方法。为了获得番石榴焦腐病菌的特异引物序列，本发明以我国福建、海南等省的11株番石榴焦腐病菌和多个焦腐病菌属近缘种以及常见的几种病原真菌为供试材料，采用CTAB法提取供试菌株基因组DNA，具体方法如下：取50mg冷冻干燥后的菌丝粉于1.5ml离心管中，加入1500μl 2％CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)提取液(2％CTAB；100m mol/L Tris-HCl，PH 8.0；20mmol/LEDTA，pH8.0；1.4mol/L NaCl)和150μl 10％SDS(十二烷基苯磺酸钠)后混匀，于55～60℃水浴1.5h，每10min振荡混匀一次，水浴1.5h后离心(12,000rpm)15min，取上清液加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)，离心(12,000rpm)5min，取上清液(水相)，加入等体积氯仿抽提一次(12,000rpm离心5min)，吸上清，加0.1体积的3mol/L NaAC溶液和2体积的冰无水乙醇，-20℃下沉淀30min后12,000rpm离心5min，轻轻地倒去上清液，加入700μl冰70％乙醇进行洗涤(稍离心，倾掉上清)，在超净工作台上自然晾干无酒精味后用1×TE(10mmol/LTris-HCL，0.1mmol/LEDTA，pH8.0)溶液进行溶解，得到DNA溶液，用紫外分光光度计检测DNA浓度并稀释至50ng/μl待用。在焦腐病菌特异rDNA-ITS片段序列的基础上应用ClustalX软件比对设计特异引物，经对供试菌株和11株番石榴焦腐病菌株的特异性进行 PCR验证(具体的反应体系是PCR反应体系25μl，包括2.5μl 10×PCR反应缓冲液，2.0mmol/LMg²⁺，50μmol/L dNTPs，1.25U Taq DNA聚合酶，引物BF1/BR1各0.5μmol/L和10ng模板DNA，ddH₂O补足25μl。PCR反应条件为：95℃预变性1min；94℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸1min共30个循环；72℃延伸10min，此特异引物在焦腐病菌上特异性地扩增出287bp的产物。这说明该引物可被用于生产实践中发病植物组织焦腐病菌快速可靠的检测和鉴定。 

本发明有益效果：本发明方法适用于植物组织中焦腐病菌的快速可靠的检测和鉴定，对于农业生产中番石榴焦腐病菌引起的病害的防治具有重要的实用价值。本发明与现有技术相比，具有以下的技术优势和积极效果： 

1、特异性强：本发明检测方法已经对源于来自我国福建、海南等不同地区的番石榴焦腐病菌和焦腐病菌近缘种及其它半知菌的验证，结果具有很强的特异性； 

2、实用性好：本发明所设计出的一对特异性引物，可用于带焦腐病菌的植物组织的高灵敏度快速分子检测，因此本方法的实用性强，可满足对发病植物组织中存在的番石榴焦腐病菌进行快速可靠的检测和鉴定的需要； 

3、操作简便快速：应用本发明方法，对番石榴带焦腐病菌的植物组织进行病菌DNA提取、PCR扩增和常规的琼脂糖电泳后即可判定结果，无需对扩增产物进行限制性内切酶酶切。一般整个检测过程可在5小时内完成。 

附图说明

图1为本发明所要检测的番石榴焦腐病菌的特异PCR扩增图。图中：泳道M为100bp ladder分子量marker，泳道1-11为番石榴焦腐病菌，泳道12为炭疽病菌，泳道13为腐霉病菌，泳道14为辣椒疫霉菌，泳道15为甘薯青枯菌，泳道16为镰刀菌，泳道17为香蕉枯萎病菌，泳道18为黄瓜疫霉菌，泳道19为阴性对照。 

图2为本发明对番石榴焦腐病发病组织检测结果图。图中：泳道M为100bp ladder分子量marker，泳道1为番石榴焦腐病菌基因组，泳道2为阴性对照，泳道3-11为番石榴病组织稀释1倍、10倍、50倍、100倍、500倍、1000倍、10⁴倍、10⁵倍、10⁶倍的基因组DNA，泳道12为番石榴健康组织的基因组DNA。 

具体实施方式

本发明的技术内容包括番石榴焦腐病菌的特异检测引物，所设计的引物及其序列为：引物BF1：5′-TCCGGCCGCCAAAGGACC-3′和BR1：5′-TCTTTGAGGCGCGTCCGCA-3′。利用该引物可从番石榴焦腐病菌上特异扩增出287bp的产物。 

实施例1：引物对番石榴焦腐病菌的特异性扩增 

1.焦腐病菌的特异检测 

以福建、海南等省份的11株番石榴焦腐病菌以及炭疽病菌、腐霉病菌、辣椒疫霉菌、甘薯青枯菌、镰刀菌、香蕉枯萎病菌、黄瓜疫霉菌为样品(以上菌种均为福建农业科学院植物保护研究所分子植物病理实验室保存)，采用CTAB法提取DNA，进行PCR扩增。PCR反应体系25μl，包括2.5μl 10×PCR反应缓冲液，2.0mmol/L Mg²⁺，50μmol/L dNTPs，1.25U TaqDNA聚合酶，引物BF1/BR1各0.5μmol/L和10ng模板DNA，ddH₂O补足25μl。PCR反应条件为：95℃预变性1min；94℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸1min共30个循环；72℃延伸10min。然后将5μl PCR产物用0.8％琼脂糖电泳分离，经溴化乙锭染色后于紫外灯下根据扩增产物的大小判定结果。 

2.检测结果 

结果见图1，检测的特异性：除了来自我国福建、海南等省份的焦腐病菌DNA可特异地扩增出287bp的产物外，检测了半知菌的其它种、炭疽菌、腐霉菌及其它的真菌和细菌等菌株DNA均未能扩增出任何产物，具有很强的特异性。 

实施例2：发病植物组织中焦腐病菌的检测。 

1.样品采集：植物组织样品采自福建省漳州龙海市东园镇番石榴产区 

2.DNA提取及检测 

发病植物组织采用CTAB法提取DNA，按实施例1所述的方法进行PCR扩增，PCR反应体系25μl，包括2.5μl 10×PCR反应缓冲液，2.0mmol/L Mg²⁺，50μmol/L dNTPs，1.25U TaqDNA聚合酶，引物BF1/BR1各0.5μmol/L和10ng模板DNA，ddH₂O补足25μl。PCR反应条件为：95℃预变性2min；94℃变性1min，60℃退火30sec，72℃延伸1min共30个循环；72℃延伸10min。然后将5μl PCR产物用0.8％琼脂糖电泳分离，经溴化乙锭染色后于紫外灯下根据扩增产物的大小判定结果。 

3.检测结果 

结果见图2，见到一条清晰的分子量为287bp的特异条带，因而判断发病组织感染番石榴焦腐病菌。 

序列表

<110>福建省农业科学院植物保护研究所

<120>一种番石榴焦腐病菌分子检测引物及其检测方法

<160>2

<210>1

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_difference

<223>根据番石榴焦腐病核糖体rDNA-ITS序列的特异性而设计的上游引物

<400>1

tccggccgcc aaaggacc 18

<210>2

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_difference

<223>根据番石榴焦腐病核糖体rDNA-ITS序列的特异性而设计的下游引物

<400>2

tctttgaggc gcgtccgca 19

Claims (2)

1.一种用于番石榴焦腐病菌分子检测的PCR引物，引物序列为：

上游引物BF1：5′-TCCGGCCGCCAAAGGACC-3′

下游引物BR1：5′-TCTTTGAGGCGCGTCCGCA-3′。

2.一种利用权利要求1所述PCR引物检测番石榴焦腐病菌的方法，包括：

(1)从发病的番石榴植物组织中采用CTAB法提取DNA；

(2)以提取的DNA为模板用权利要求1所述的一对引物BF1/BR1通过PCR扩增；PCR反应体系25μl，包括2.5μl 10×PCR反应缓冲液，2.0mmol/L Mg²⁺，50μmol/L dNTPs，1.25U TaqDNA聚合酶，引物BF1/BR1各0.5μmol/L和10ng模板DNA，ddH₂O补足25μl；PCR反应条件为：95℃预变性1min，94℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸1min共30个循环；72℃延伸10min；

(3)然后取步骤(2)的PCR扩增产物用琼脂糖电泳分离，经溴化乙锭染色后于紫外灯下观察，根据扩增产物的大小判定结果；如果能特异性地扩增出287bp的产物，即可判断所述的植物组织中存在了番石榴焦腐病菌。

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