CN101985653B

CN101985653B - 禾谷镰孢菌对多菌灵的中等抗性水平菌株的分子检测方法

Info

Publication number: CN101985653B
Application number: CN 201010247027
Authority: CN
Inventors: 周明国; 陈长军; 王建新; 罗卿权
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2010-08-06
Filing date: 2010-08-06
Publication date: 2013-08-14
Anticipated expiration: 2030-08-06
Also published as: CN101985653A

Abstract

本发明属于禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)对多菌灵产生中等抗性水平菌株的分子检测方法，可用于引起小麦赤霉病的禾谷镰孢菌对多菌灵的抗药性监测和流行预警。该检测方法共分3个主要步骤，(1)分别提取待测菌株的核基因组DNA；(2)运用内外引物对进行巢式PCR反应，获得目标片段；(3)将目标片段用限制性内切酶HindIII和TaaI(Tsp4CI)分别酶切，从酶切产物电泳图谱可以准确鉴定中等抗性菌株基因型。采用PIRA-PCR(Primer-introduced restriction analysis PCR)技术可以快速、准确地检测出田间中等抗药性禾谷镰孢菌的数量及其在群体中的比例。检测准确率达95％以上。

Description

禾谷镰孢菌对多菌灵的中等抗性水平菌株的分子检测方法

一、技术领域

本发明属于一种禾谷镰孢菌对多菌灵产生中等抗药性水平菌株的分子检测方法，可用于监测苯并咪唑类杀菌剂(多菌灵)抗性禾谷镰孢菌群体发展动态，进行抗药性小麦赤霉病的流行预测。

二、技术背景

小麦赤霉病是由禾谷镰孢菌Fusarium graminearum Schwabe引起的一种世界性病害，严重影响小麦的产量和品质。长期以来采用苯并咪唑类杀菌剂或以这类药剂为主的复配剂进行化学防治。苯并咪唑类杀菌剂作为一类高效、广谱内吸性杀菌剂在生产上应用，解决了保护性杀菌剂的环境毒性问题，提高了人类控制该病害的能力。苯并咪唑类杀菌剂包括多菌灵、苯菌灵、噻菌灵、硫菌灵等。这些杀菌剂具有相同的抗菌谱和抗菌机制，他们也具有相同的抗药性机制，相互之间存在正交互抗药性。由于这类药剂的高度专化性，作用位点单一，加上施用频率高，使用多年后许多植物病原真菌群体中就会出现抗药性优势生理小种，使药剂防治完全失去效果。经过近几年的努力，南京农业大学杀菌剂实验室研究发现小麦赤霉病菌对多菌灵的抗药性菌株主要是由于禾谷镰孢菌β2-微管蛋白基因(FGSG 06611.3)突变造成，该基因第167位和第200位氨基酸密码子的突变分别为TTT(Phe)→TAT(Tyr)和TTC(Phe)→TAC(Tyr)。第167位或者第200位氨基酸密码子的突变均可引起禾谷镰孢菌对多菌灵中等抗药性的产生，其中第167位突变占所有突变类型总量的97％以上。成为病原菌产生田间抗药性的主要原因。

由于病原菌在自然界的数量巨大，抗药性个体在群体中的比例很低时(3％～5％)即可引起抗药性病害流行，使药剂防治失败。传统的检测方法需要分离培养病原菌，然后在含药培养基上培养，再根据药剂对菌丝生长的效应鉴别抗药性。本发明在抗药性机制研究基础上，根据基因点突变类型应用PIRA-PCR技术检测病原真菌对多菌灵等苯并咪唑类杀菌剂的抗药性，则能快速、准确检测样本。PIRA-PCR技术较等位基因特异性PCR(ASO-PCR)更为准确，不会有假阳性结果。它具有(1)快速、准确检测出禾谷镰孢菌群体中的中等抗性菌株；(2)准确鉴定菌株的抗药性基因型；(3)耗时短，仅需5～8小时。

三、发明内容

技术问题本发明的目的在于提供禾谷镰孢菌对多菌灵产生中抗水平菌株一种快速诊断和检测方法。现有技术首次利用PIRA-PCR，根据抗性菌株发生突变的特点，结合了巢式PCR技术成功实现了快速、准确地对小麦赤霉病菌抗多菌灵中抗群体的分子检测，检测准确率达到95％以上，对及时采取有效措施控制当季抗药性病害流行，具有实用价值。

技术方案禾谷镰孢菌抗多菌灵的中抗菌株β₂-微管蛋白基因(FGSG_06611.3)，其第167位氨基酸密码子发生点突变TTT(Phe)→TAT(Tyr)或第200位氨基酸密码子发生点突变TTC(Phe)→TAC(Tyr)。

一种禾谷镰孢菌对多菌灵产生中抗水平菌株检测方法，共分三步：

第一步：采用常规的苯酚·氯仿·异戊醇法，分别提取待测样品的核基因组DNA。

第二步：运用内外引物对，进行巢式PCR反应，获得164bp的目标片段。

用于PIRA-PCR技术引物具有特异性，该引物对能为β₂-微管蛋白167位未突变菌株人为引入HindIII酶切识别位点；巢式PCR技术的设计用于提高反应效率。设计的依据是抗药性菌株在β₂-微管蛋白第167位由Phe(TTT)→Tyr(TAT)，200位由Phe(TTC)→Tyr(TAC)。

①扩增禾谷镰孢菌β₂-微管蛋白基因片断的外引物对

上游引物NoF 5′-AAGCCATTGATGTTGTTCG-3′

下游引物NoR 5′-CATGACGGTAGAAATCAGGTAG-3′

②扩增含人为引入错配碱基β₂-微管蛋白基因片段的内引物对

上游引物Hind3F 5′-CGATCGCATAATGGC

A CT-3′

下游引物Hind3R 5′-GGGTCCTCTCGTAGATATCGTACA-3′

巢式PCR反应体系及其扩增程序：

(1)外引物扩增：

反应体系：

PCR buffer(10×) 2.5μL

dNTP(2.5mM each) 2μL

MgCl₂(25mM) 1.5μL

NoF(10μM) 0.5μL

NoR(10μM) 0.5μL

dH₂O(灭菌蒸馏水) 16.8μL

Taq(5U/μL) 0.2μL

DNA模板 1.0μL

总体积 25μL

扩增条件：

预变性：94℃ 5min

↓

变性：94℃ 15s

退火：58℃ 30s

延伸：72℃ 30s

35个循环

↓

延伸：72℃ 5min

(2)内引物扩增：

反应体系：

PCR buffer(10×) 2.5μL

dNTP(2.5mM each) 2μL

MgCl₂(25mM) 1.5μL

NoF(10μM) 0.5μL

NoR(10μM) 0.5μL

dH₂O(灭菌蒸馏水) 16.8μL

Taq(5U/μL) 0.2μL

DNA模板* 1.0μL

总体积 25μL

*DNA模版为外引物扩增产物稀释50～100倍量浓度

扩增条件：

预变性：94℃ 5min

↓

变性：94℃ 15s

退火：56℃ 30s

延伸：72℃ 30s

35个循环

↓

延伸：72℃ 5min

第三步：将巢式PCR获得的目的条带(164bp)限制性内切酶HindIII和TaaI(Tsp4CI)分别酶切，根据PIRA-PCR原理示意图，从酶切产物电泳图谱(3％琼脂糖凝胶)可以准确鉴定中等抗性菌株基因型，并以此判断菌株抗性水平。

(1)HindIII酶切体系：

10×Buffer R 2μL

HindIII(10unit/μL) 1μL

PCR产物 8μL

dH₂O(灭菌蒸馏水) 9μL

总体积 20μL

37℃孵育1～3小时完全酶切

(2)TaaI酶切体系：

10×Buffer Tango 2μL

TaaI(10unit/μL) 1μL

PCR产物 8μL

dH₂O(灭菌蒸馏水) 9μL

总体积 20μL

65℃孵育1～3小时完全酶切

有益效果本发明禾谷镰孢菌抗多菌灵的中抗菌株分子检测方法，与现有技术相比有如下优点。

1.目前国内外研究单位均采用菌丝生长抑制法检测禾谷镰孢菌抗药性，它涉及采样、分离培养和室内大量的药剂敏感性测定实验，至少两周，周期较长。目前尚无成熟的抗多菌灵小麦赤霉病菌分子检测技术，因此，PIRA-PCR技术的研究应用填补了这一空白，能够在发病前期进行检测，对及时、合理地指导科学用药，有效治理抗药性，以及降低成本和减少环境污染具有现实意义。

2.在所测定的50株小麦赤霉病菌田间菌株中，PIRA-PCR技术抗性检测结果与传统的菌落直径法测定结果完全一致(表2)，且能够100％准确鉴定出所测样品的抗药性基因型(表3)。

四、附图说明

图1PCR巢式扩增电泳结果

图2PIRA-PCR技术示意图

图3限制性内切酶酶切片段电泳结果

五、具体实施方式

实施例1、适用于PIRA-PCR技术中的退火温度

PCR反应过程中，退火温度Tm值是反应正常进行与特异性的重要保证。如果退火温度过低就会产生非特异性扩增。我们参考内外引物的Tm值，从50℃到65℃进行梯度PCR，分别确定了外引物最佳退火温度为58℃，内引物最佳退火温度为56℃。

实施例2、检测已知抗性水平和基因型菌株

提取菌株ZF43，ZF52，NT-7(表1)基因组DNA，用内外引物扩增，得到扩增图谱(图1)。扩增产物分别用HindIII和TaaI酶切，酶切图谱见图3，检测结果与理论结果一致(图2)。

实施例3、江苏田间菌株检测

从江苏省小麦田间随机采取50个小麦赤霉菌株，用传统菌落直径法和PIRA-PCR分别检测对多菌灵抗药性，并根据PIRA-PCR检测结果，从各种基因型菌株分别随机抽取3个进行测序验证。

结果由表2所示，两种检测抗药性方法的结果完全一致。同传统的菌落直径法比较，引物引入限制性内切酶分析聚合酶链式反应(PIRA-PCR)只需要几个小时就可完成检测，操作简便、快捷，准确性高；还能对突变位点SNP分析，准确分型。而传统的菌落直径法从分离培养到检测需要两周左右的时间。PIRA-PCR分型结果如表3所示，从各基因型菌株中分别随机抽取三个菌株测序，测序结果与酶切片段电泳分型结果完全一致。

表1本研究中小麦赤霉病菌来源、对多菌灵抗药性表型及抗药性表型与β₂-微管蛋白基因突变的关系

表2两种检测小麦赤霉病菌对多菌灵抗性方法的结果比较

表3PIRA-PCR酶切法抗药性基因型鉴定结果

Table 3 Genotype of F.graminearum by using PIRA-PCR

禾谷镰孢菌对多菌灵的中等抗性水平菌株的分子检测方法.txt

SEQUENCE LISTING

<110>南京农业大学

<120>禾谷镰孢菌对多菌灵的中等抗性水平菌株的分子检测方法

<140>201010247027.2

<141>2010-08-06

<160>4

<210>1

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于扩增禾谷镰孢菌β2-微管蛋白基因片断的外引物对的上游引物NoF

<400>1

aagccattga tgttgttcg

<210>2

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于扩增禾谷镰孢菌β2-微管蛋白基因片断的外引物对的下游引物NoR

<400>2

catgacggta gaaatcaggt ag

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>含人为引入错配碱基β2-微管蛋白基因片段的内引物对的上游引物Hind3F

<400>3

cgatcgcata atggcaagct

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>含人为引入错配碱基β2-微管蛋白基因片段的内引物对的下游引物Hind3R

<400>4

gggtcctctc gtagatatcg

Claims

1.禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)对多菌灵产生中等抗性水平菌株的分子检测方法，其特征在于采用PIRA-PCR(Primer-introduced restriction analysis PCR)技术检测禾谷镰孢菌群体中存在的对苯并咪唑类杀菌剂的中等抗性菌株，并以此计算抗性比例，

一种禾谷镰孢菌对多菌灵产生中等抗性水平菌株的分子检测方法，共分三步：

第一步：采用常规的苯酚·氯仿·异戊醇法，分别提取待测样品的核基因组DNA，

第二步：运用内外引物对，进行巢式PCR反应，获得164bp的目标片段，

巢式PCR反应体系及其扩增程序：

(1)外引物扩增：

反应体系：

扩增条件：

(2)内引物扩增：

反应体系：

^*DNA模版为外引物扩增产物稀释50～100倍量浓度

扩增条件：

第三步：将巢式PCR获得的目的条带(164bp)限制性内切酶HindIII和TaaI(Tsp4CI)分别酶切，从酶切产物电泳图谱可以准确鉴定中等抗性菌株基因型，并以此判断菌株抗性水平，

(1)HindIII酶切体系：

37℃孵育1～3小时完全酶切

(2)TaaI酶切体系：

65℃孵育1～3小时完全酶切。

2.根据权利要求1，禾谷镰孢菌对多菌灵产生中抗水平菌株的检测方法其特征在于：用于PIRA-PCR反应的引物引入了HindIII酶切识别位点特异性地识别抗药性菌株在β₂-微管蛋白第167位密码子由TTT→TAT，第200位密码子由TTC→TAC的突变；巢式PCR技术的设计用于提高反应效率，

①扩增禾谷镰孢菌β₂-微管蛋白基因片断的外引物对，即为用于权利要求1中外引物扩增的外引物对，序列如下：

外引物对上游引物5′-AAGCCATTGATGTTGTTCG-3′

外引物对下游引物5′-CATGACGGTAGAAATCAGGTAG-3′

②扩增含人为引入错配碱基β₂-微管蛋白基因片段的内引物对，即为用于权利要求1中内引物扩增的内引物对，序列如下：

内引物对上游引物5′-CGATCGCATAATGGCACT-3′

内引物对下游引物5′-GGGTCCTCTCGTAGATATCG-3′。