CN101475983B - 禾谷镰孢菌鉴定及其对多菌灵产生中等抗药性水平确认的一管检测法 - Google Patents

Abstract

本发明是禾谷镰孢菌(Gibberella zeae，无性态Fusarium graminearum)检测及其对多菌灵产生中等抗药性水平确认的一管检测法，专门用于禾谷镰孢菌菌株及其对多菌灵产生中等抗药性的特异性检测。该法可以从田间采集回来的病穗、病组织和病残体上的病原菌采用ASO-PCR检测，整个过程只需6h，检测准确率达99％。该法具有快速、简便、准确、灵敏的特点。

Description

禾谷镰孢菌鉴定及其对多菌灵产生中等抗药性水平确认的一管检测法

一、技术领域

本发明是禾谷镰孢菌鉴定及其是否对多菌灵产生中等抗药性(即，中抗)水平确认一管(即，在一个PCR反应管中)检测法，属于植物病原菌抗药性亚群体的检测方法，专用于检测抗多菌灵等苯并咪唑类杀菌剂的禾谷镰孢菌。 

二、技术背景 

小麦赤霉病是由禾谷镰孢菌(Gibberella zeae，无性态Fusarium graminearum)引起的一种世界性病害，严重影响小麦的产量和品质。长期以来采用苯并咪唑类杀菌剂或以这类药剂为主的复配剂进行化学防治。苯并咪唑类杀菌剂作为一类高效、广谱内吸性杀菌剂在生产上应用，解决了保护性杀菌剂的环境毒性问题，提高了人类控制该病害的能力。苯并咪唑类杀菌剂包括多菌灵、苯菌灵、噻菌灵、甲基硫菌灵等。这些杀菌剂具有相同的抗菌谱和抗菌机制，它们也具有相同的抗药性机制，相互之间存在正交互抗药性。由于这类药剂的高度专化性，作用位点单一，加上施用频率高，使用20年后许多植物病原真菌群体中就会出现抗药性亚群体，使药剂防治完全失去效果。对苯并咪唑类药剂的杀菌机制和抗药性机制研究表明，药剂主要是结合在病菌的β-微管蛋白上从而阻止细胞的有丝分裂，达到抑制病菌生长的目的。已有的对几种植物病原菌的分子生物学研究表明，病菌对苯并咪唑类杀菌剂的抗药性自然突变体主要是其β-微管蛋白196～202位氨基酸的改变，这些改变使该蛋白质的三维构象发生改变，从而阻止了药剂与靶标结合，使病菌表现抗药性。在人工诱变菌株中除上述位点外还涉及其它一些位点，如165，257等的氨基酸变异。通过定点突变也确认了198和200位氨基酸类型与抗感性密切相关。但是禾谷镰孢菌对多菌灵的抗药性机制并非像其它丝状真菌一样由β-微管蛋白198位等氨基酸突变所致。 

早期检测病原群体中抗药性亚群体/抗药性基因的频率，及早实施抗药性治理策略，是延缓抗药性亚群体的发展，防止抗药性病害流行危害最有效的措施。传统的检测方法需要分离培养病原菌，然后在含药培养基上培养，再根据药剂对菌丝生长的效应鉴别抗药性。这种对药剂的敏感性测定方法通常需要几周时间，工作量大，测定样本数量有限，难以早期发现抗药性亚群体的存在，也不能用于当年的抗药性短期预测。在抗药性机制研究基础上，根据基因点突变的原理，应用核酸技术如寡核苷酸一聚合酶链式反应(ASO-PCR技术)等检测病原真菌对多菌灵等苯并咪唑类杀菌剂的抗药性，则能快速、准确检测大量样本，使在早期检测低频率的抗药性基因成为可能。 

三、发明内容

技术问题  本发明的目的在于提供禾谷镰孢菌鉴定及其是否对多菌灵产生中等抗药性水平的一种快速检测方法。针对禾谷镰孢菌抗多菌灵的检测基因设计特异性引物检测，有时会因其他植物病原菌与该基因非特异性结合而误判。现有研究中尚没有在一个聚合酶链式反应(polymerase chainreaction，简称PCR)体系中，同时评价待测样品是否为禾谷镰孢菌及其是否对多菌灵产生中断抗药性水平的方法。 

技术方案  提取的基因组DNA或病粒可直接用于ASO-PCR禾谷镰孢菌对多菌灵中抗水平菌株的基因检测，其β2-微管蛋白基因，长度为1713bp，相应的编码β₂-微管蛋白的447个氨基酸，检测基因包含中抗菌株β2-微管蛋白基因编码的第167位氨基酸的抗药性突变位点Phe(TTT)密码字突变为Tyr(TAT)密码字。编码167位氨基酸的密码子发生点突变导致对多菌灵的中等抗药性水平，占田间突变类型的99.5％。 

(1)设计特异性的引物检测禾谷镰孢菌； 

(2)设计特异性的引物检测对多菌灵中等抗性的引物； 

(3)在一个聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，简称PCR)体系中(即，在一个PCR反应管中)，同时加入特异性检测禾谷镰孢菌种类和多菌灵抗药性水平的两对引物，在同一个PCR反应程序控制下与待测样品的核基因组结合，扩增，电泳检测，可同时评价待测样品是否为禾谷镰孢菌及其是否对多菌灵产生中等抗药性水平。 

有益效果  本发明禾谷镰孢菌鉴定及其对多菌灵产生中等抗药性水平确认一管检测法，具有如下优点和积极效果： 

(1)本发明是国际上首次报道在一个聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，简称PCR)体系中，同时加入特异性检测禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum，有性态Gibberellazeae)种类和多菌灵抗药性水平的两对引物，与待测样品的核基因组结合，扩增，电泳检测，可同时评价待测样品是否为禾谷镰孢菌及其是否产生对多菌灵中等抗药性水平，为今后禾谷镰孢菌的多菌灵抗药性菌株检测提供技术支撑。 

(2)目前国内其他研究单位均采用菌丝生长法检测禾谷镰孢菌抗药性，但该方法涉及采样、分离培养需要3d和室内大量的药剂敏感性测定实验至少要6天，周期较长，工作繁琐，费时费力。 

(3)随着杀菌剂抗药性分子机制研究的深入，利用分子生物学技术的检测方法快速、简便、有效地检测杀菌剂抗性成为研究热点。本发明从基因组的提取到ASO-PCR整个检测过程只需6h即可，且操作简单易学。因此ASO-PCR技术使快速、简便地检测和监测田间抗药性菌株 成为可能，且方法简便便于基层工作人员掌握。这对及时了解抗药性病原群体的发展动态，及时、合理地指导科学用药，有效治理抗药性，以及降低成本和减少环境污染具有现实意义。 

(4)直接从田间采集回来的病穗用ASO-PCR检测整个过程只需6h，检测准确率达99％，达到对多菌灵中等抗药性菌株的快速、简便、准确、灵敏的检测。 

五、具体实施方式

实施例1  采用PCR方法对禾谷镰孢菌对多菌灵抗药性中抗菌株检测 

扩增体系：50μL中含dNTP0.2μM，上游引物和下游引物均为1μM，Taq(申能博彩生物技术有限公司)2.5U，模板DNA100ng，10×buffer(10μM Tris-HCl，50mM KCl)5μL，用d₂H₂O补足至50μL。扩增条件：94℃5min；94℃60s，56℃60s，72℃60s，35次循环；72℃15min。 

通过设计特异性的探针上游引物MBCF(5′-TCCCCGATCGCATGATGGCCACCTA-3′)下游引物MBCR(5′-CTTTCGCAGATCCGAGTTGAGCTGT-3′)，对田间中抗菌株(Codon¹⁶⁷TTT→TAT)进行了检测(图1)，该探针对中抗菌株具有很好的特异性。 

实施例  2对禾谷镰孢菌特异性检测的结果与分析 

扩增体系：50μL中含dNTP0.2μM，上游引物和下游引物均为1μM，Taq(申能博彩生物技术有限公司)2.5U，模板DNA100ng，10×buffer(10μMTris-HCl，50mMKCl)5μL，用d2H2O补足至50μL。扩增条件：为94℃5min；94℃45s，56℃45s，72℃45s，35次循环；72℃15min。 

引物对FGa/FGb对禾谷镰孢菌具有很强的特异性。将引物对FGa(5’-AGTCCAAAATGTCCCGATGC-3’)/FGb(5’-GCTGGGACCTGAGAAGTA-3’)用于26种其他不同菌种菌株后，均无条带(图2)。 

实施例3  采用一管法进行禾谷镰孢菌及其对多菌灵的敏感性的测试 

50μL扩增体系中含上述两对引物FGa/FGb和MBCR/MBCF使反应体系中引物浓度均为1μM，dNTP0.2μM，Taq(申能博彩生物技术有限公司)2.5U，模板DNA100ng，10×buffer(10μM Tris-HCl，50mM KCl)5μL，用d2H2O补足至50μL。扩增条件为94℃5min；94℃45s，56℃45s，72℃45s，35次循环；72℃15min。取5μLPCR产物于1.5％琼脂糖TBE胶上电泳，通过荧光成像系统观察(图3)。 

经引物对FGa/FGb扩增后，模板NT-21、NT-29均有明显条带(小的电泳条带)，而水稻恶苗病(G.fujikuroi)无条带，说明NT-21、NT-29均属禾谷镰孢菌，而水稻恶苗病(G.fujikuroi)非禾谷镰孢菌。经引物对MBCR/MBCF扩增后，NT-29有明显条带，而NT-21无条带(大的电泳条带)，说明NT-21对多菌灵抗药性基因Codon167存在突变，而NT-29无突变，但引物对MBCR/MBCF能够与水稻恶苗病(G.fujikuroi)非特异性结合，出现条带。因此表明，在一个PCR反应管及同一个控制程序下，引物对FGa/FGb、MBCR/MBCF可同时用于测试禾谷镰孢菌及其对多菌灵的敏感性。图1禾谷镰孢菌对多菌灵抗药性基因Codon¹⁶⁷(TTT→TAT)突变的检测结果。泳道1～11为中抗菌株，12～17为敏感菌株。 

图2禾谷镰孢菌特异性检测结果。 

(引物对均为FGa/FGb，泳道1～27分别对应水稻恶苗病(G.fujikuroi)、辣椒黑点病(C.capsici)、小麦全蚀病(G.graminisvar)、西瓜枯萎病(F.oxysporum)、柑桔干腐病(F.moniliforme)、棉花枯萎病(F.oxysporum)、番茄早疫病(A.solani)、油菜菌核病(S.sclerotiorum)、番茄灰霉病(B.cinerea Pers)、梨腐烂病(C.carphosperma)、苹果斑点落叶病(P.mali)、青菜黑斑病(A brassicae)、香蕉炭疽病(C.musae)、梨轮纹病(M.kawatsukai)、葡萄灰霉病(B.cinerea)、水稻黑霉病(N.oryzae)、西瓜蔓枯病(M.melonis)、芦笋茎枯病(P.asparagi)、黄瓜黑星病(C.cucumerinum)、柑桔青霉病(P.hicotianae)、辣椒根腐病(F.solani)、黄瓜立枯病(R.solani)、大蒜叶枯病(S.botryopsu)、茄子褐纹病(P.vexans)、香蕉炭疽病(C.musae)、甜菜褐斑病(C.beticola)、稻瘟病(P.grisea)) 

图3采用一管法测试禾谷镰孢菌及其对多菌灵的敏感性 

(泳道1～3分别对应模板水稻恶苗病(G.fujikuroi)、和禾谷镰孢菌对多菌灵的抗药性菌株NT-29和禾谷镰孢菌对多菌灵的敏感菌株NT-21) 

附图说明

图1禾谷镰孢菌对多菌灵抗药性基因Codon¹⁶⁷(TTT→TAT)突变的检测结果。泳道1～11为中抗菌株，12～17为敏感菌株。 

图2禾谷镰孢菌特异性检测结果。 

(引物对均为FGa/FGb，泳道1～27分别对应水稻恶苗病(G.fujikuroi)、辣椒黑点病(C.capsici)、小麦全蚀病(G.graminisvar)、西瓜枯萎病(F.oxysporum)、柑桔干腐病(F.moniliforme)、棉花枯萎病(F.oxysporum)、番茄早疫病(A.solani)、油菜菌核病(S.sclerotiorum)、番茄灰霉病(B.cinerea Pers)、梨腐烂病(C.carphosperma)、苹果斑点落叶病(P.mali)、青菜黑斑病(A brassicae)、香蕉炭疽病(C.musae)、梨轮纹病(M.kawatsukai)、葡萄灰霉病(B.cinerea)、水稻黑霉病(N.oryzae)、西瓜蔓枯病(M.melonis)、芦笋茎枯病(P.asparagi)、黄瓜黑星病(C.cucumerinum)、柑桔青霉病(P.hicotianae)、辣椒根腐病(F.solani)、黄瓜立枯病(R.solani)、大蒜叶枯病(S.botryopsu)、茄子褐纹病(P.vexans)、香蕉炭疽病(C.musae)、甜菜褐斑病(C.beticola)、稻瘟病(P.grisea)) 

图3采用一管法测试禾谷镰孢菌及其对多菌灵的敏感性 

(泳道1～3分别对应模板水稻恶苗病(G.fujikuroi)、和禾谷镰孢菌对多菌灵的抗药性菌株NT-29和禾谷镰孢菌对多菌灵的敏感菌株NT-21) 

Claims (1)

1.在一个聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，简称PCR)体系中，同时加入能够特异性检测禾谷镰孢菌(Gibberella zeae，无性态Fusarium graminearum)及其是否对多菌灵产生中等抗药性水平的两对引物，以待测样品的核基因组为模板，扩增，电泳，电泳结果可同时评价待测样品是否为禾谷镰孢菌及其是否对多菌灵产生中等抗药性水平；

特异性检测禾谷镰孢菌的引物：

FGa 5′-AGTCCAAAATGTCCCGATGC-3′和FGb 5′-GCTGGGACCTGAGAAGTA-3′。

特异性检禾谷镰孢菌样品对多菌灵产生中等抗药性水平的引物：

MBCF  5′-TCCCCGATCGCATGATGGCCACCTA-3′和MBCR  5′-CTTTCGCAGATCCGAGTTGAGCTGT-3′。

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