CN103571910B - 用于检测油菜菌核病菌的方法和培养基 - Google Patents

Abstract

本发明提供了3-(2-吡啶基)甲基-2-(4-氯苯基)亚氨基噻唑烷或其含亚氨基噻唑烷结构的衍生物用于特异性地检测油菜菌核病菌的方法和培养基。在含有0.1～100.0μg/mL该类检测试剂的培养基摇瓶或平板中能特异性地诱导油菜菌核病菌的菌丝体内产生显著的绿色色素，具有特异性强、灵敏性和稳定性高的特点。绿色菌丝体用90%乙醇超声浸提，再用0.1M HCl调节至pH3.0，即可获得绿色色素，该色素在波长为610-630nm区域内有特征吸收峰。该类检测试剂对油菜菌核病还具有一定的防控作用。

Description

用于检测油菜菌核病菌的方法和培养基

技术领域

本申请涉及植物保护、生物技术、农药学等领域，尤其是植物保护领域。具体而言，本申请涉及农林植物菌核病菌的检测试剂及其检测方法。

背景技术

菌核病菌是危害油菜等十字花科、菊科、豆科、茄科、伞形花科、锦葵科等72科400种植物的重要农业病害。在长江中、下游及东南沿海主要油菜产区，包括江苏、安徽、上海、浙江、湖南、湖北、江西等地发生尤为突出，并已成为油菜的主要病害之一，严重影响了我国油料作物的生产。

该病菌主要以菌核在土壤、种子和病茎中越夏越冬。土壤中的菌核至少可存活7年。越夏菌核在秋季有少量萌发，产生子囊盘或菌丝侵染油菜幼苗。大多数菌核越夏越冬后，至翌年2-3月才萌发，主要产生子囊盘，51天后成熟，释放大量子囊孢子。条件不适宜，子囊孢子不会萌发，可存活一段时间，子囊孢子在田间的存活时间与气候条件有密切关系，特别是温度与水势。萌发后主要侵染油菜即将凋萎的花瓣和花药。子囊孢子萌发生出芽管，其顶端生出附着胞，附着胞的顶部形成侵染栓，通过角质层以机械压力直接侵入寄主，在角质层与表皮细胞之间形成扁平的颗粒的泡囊，泡囊放射状地长出侵染菌丝向细胞间伸展。被菌丝侵染后，细胞壁间的果胶层发生改变，积累大量液体和水，细胞渗透性和酶也发生变化。通过菌丝扩展至茎枝，菌丝也可通过枝叶接触再侵染近旁植株，最后在感染部位表面、茎髓、角果内形成新菌核。菌核可随排水沟或田间灌溉水流传播，在流水中可存活10-21天，混入种子或土中越夏越冬。

传统的检测方法如：应用分离培养、生物测定、血清学等技术等作为检测手段，但这些检测技术不但耗时而且昂贵，检测的结果也不够可靠。如在对病原菌分离鉴定出了耗费时间过长，而且由于所使用的培养条件，如培养基、温度、pH值、培养时间的不一致性，往往造成鉴定上常有因个人主观认定的不同而衍生出很多困扰，因而对农业上的指导有限。而早期ELISA检测由于植物病原菌的低免疫原性以及植物提取物中的抑制物质，给植物病原菌的检测带来较大的困难，虽然目前一些病原菌重组结构已经用于血清学检测，但只有少数被用于常规的ELISA检测。目前在植物病原菌的检测方法中使用较多的是分子生物学方法，如PCR-RFLP及PCR-SSCP技术，如Jansen和Wetze等就开始应用IC-RT-PCR检测了几种侵染水果树的病毒，只要病毒浓度在l0-100fg/ml之间，TMV或者ToMv这两种病毒就能被检测到，而且还能扩增出各自的分离物。Bertolini等报道了利用多聚RT-PCR能同时检测到侵染橄榄树的Cucumovirus，不仅能够保证检测的准确性，更能大大地提高检测效率。

有关菌核病菌检测诊断的报道较少。李红霞等发现通过PCR扩增和ThaI酶能直接检测油菜菌核病菌的多菌灵抗性和敏感菌株，结果与传统菌落直径法相吻合，而后根据菌核病菌β-微管蛋白基因的突变位点设计了2对等位基因特异性寡核苷酸，直接以菌核的基因组DNA为模板扩增，所需时间约为6h，抗药性检出率为l00%，与传统菌丝直径法的测定结果相比检测准确率为96%，而传统的检测方法至少需要1-2周。但此方法也有缺陷。如聚合酶的类型、缓冲液的组成、dNTP浓度、起始模板的纯度以及PCR扩增参数等均可以影响到结果的准确性。对于常规PCR而言，在RNA或者DNA的初提物中通常会含有高浓度的酚类化合物以及多糖类化合物，在一定条件下这些化合物会抑制聚合酶活性，因而降低了检测的灵敏性和精确度，还会造成假阴性的结果。另外由于引物设计不合适、靶序列或扩增产物的交叉污染等造成非特异性扩增带、片状拖带或涂抹带等。此外，利用PCR技术检测植物病原菌，需要耗费大量的实验材料和繁重的实验操作，这就限制了PCR技术应用于高通量样本的检测，另外在对PCR产物进行电泳和染色的后处理过程中，需要利用硝酸银或者溴化乙锭染色，容易危害人体健康以及可能对环境造成污染.并且利用硝酸银染色，容易产生较高的背景色，而不利于观察实验结果。

然而，目前本领域还未见有对菌核病菌特异性检测和诊断试剂的报道。

发明内容

本发明的目的是解决现有技术对菌核病菌检测和鉴定主要基于形态学特征、耗时长、灵敏度低、特异性低及经验型强，难以在做到对菌核病害的发生进行及时监测和控制病原菌的传播、流行的问题，提供一种对油菜菌核病菌进行快速检测的试剂和检测方法，特异性强、灵敏度高、准确性强。

本发明人发现18种不同的植物病原菌在存在3-(2-吡啶基)甲基-2-(4-氯苯基)亚氨基噻唑烷下只有油菜菌核病菌的菌丝内特异性地产生一种显著的绿色色素，而其余的供试病原菌菌丝内并没有绿色色素的产生，而菌核病菌在正常条件下生长时其菌丝内并不会产生绿色色素。另外，本发明人还发现在存在亚氨基噻唑烷结构其他衍生物的条件下油菜菌核病菌的菌丝内均特异性地产生显著的绿色色素，所以本发明人利用这一发现完成了本发明。

本发明首先提供一种检测样品中油菜菌核病菌的方法，包括：（a）将样品接入含有特异性检测试剂的固体培养基或液体培养基中，置于适宜条件下培养，其中所述特异性检测试剂为3-(2-吡啶基)甲基-2-(4-氯苯基)亚氨基噻唑烷或其含亚氨基噻唑烷结构的衍生物；和（b）目测观察培养所得菌落或镜检观察所得菌丝体的颜色，如观察到绿色菌落或菌丝体，则表明样品中含有油菜菌核病菌。

在本发明方法的一实施例中，其中所述特异性检测试剂的结构式如下：

其中，R₁表示4-Cl、2-Cl、2-CH₃、2-F、2,4-F或4-CF₃，且R₂表示4-CH₃或4-Cl。R₁表示4-Cl时，所述特异性检测试剂为3-(2-吡啶基)甲基-2-(4-氯苯基)亚氨基噻唑烷。

在本发明方法的一实施例中，其中培养基中所述特异性检测试剂的含量为0.1～100.0μg/mL。

本发明还提供一种从油菜菌核病菌菌丝体中提取绿色色素的方法，包括以低级醇在酸性条件下浸提菌丝体以提取绿色素。

本发明还提供一种用于培养和检测油菜菌核病菌的培养基，包括3-(2-吡啶基)甲基-2-(4-氯苯基)亚氨基噻唑烷或其含亚氨基噻唑烷结构的衍生物。

本发明还提供3-(2-吡啶基)甲基-2-(4-氯苯基)亚氨基噻唑烷或其含亚氨基噻唑烷结构的衍生物在特异性检测油菜菌核病菌中的用途。

本发明还提供3-(2-吡啶基)甲基-2-(4-氯苯基)亚氨基噻唑烷或其含亚氨基噻唑烷结构的衍生物在降低油菜菌核病菌致病力中的用途。

与现有技术相比，本发明技术方案的优点和积极效果表现在：

1、实用性强

菌核病菌的早期检测，具有重要的实际应用价值。菌核病菌是一种土传性病害，其菌核常年存活在土壤中，待条件如：温度、水分等适宜时才发病，条件不适宜时继续在土壤中存活，所以要在其未发病或发病早期对其进行监测具有一定的困难。传统的菌核病菌检测方法一般是在农作物出现症状后，借助其发病症状，病原菌的分离、纯化、鉴定等一系列繁琐的过程，给快速而精确的检测病原菌增加了难度。而且病原菌在分离时也存在一定的困难，由于各人的操作等往往造成了结果的经验性，不可靠。由于过程的繁琐使得检测结果出来后，已经失去了油菜菌核病菌的最佳防治时期，给农业上造成了巨大的损失。同时由于不能及时进行田间的群体动态监测，也给农业生产上的病害控制延误时机。而今年来流行的PCR等分子生物学手段检测，虽说快速准确，但过程的繁重、假阴性的结果、对环境造成的污染等又限制了其应用，尤其是早期检测方面，一直还得不到良好的解决。采用本发明，在没有病症出现的情况下，就可以进行检测，而且结果准确、特异性强，为病害的有效防治创造了良好的机会。

2、特异性强

本发明利用18种不同的植物病原菌对检测试剂在菌丝内产生的色素比较，结果发现只有菌核病菌的菌丝内特异性地产生一种显著的绿色色素，而其余的供试病原菌菌丝内并没有绿色色素的产生。由于菌核病菌在正常条件下生长时其菌丝内并不会产生绿色色素，所以本发明利用这一特异性变化，可以简捷快速准确的检测到土壤中或作物发病期间的菌核病菌。继而对色素进行提取检测后，可以得知病原菌的发病程度，便于农业生产上的防治。

3、灵敏度高

传统的农作物菌核病菌检测方法一般是待寄主植株出现症状后，借助其发病症状，进行病原菌的分离、纯化、鉴定等，需要病原菌产生足够的菌丝或孢子，一般需要每克植物组织或土壤中相当数量的菌丝体，才能分离出来。本发明提供的菌核病菌检测试剂及其检测方法需要的菌丝体极少，只要有菌丝存在，通过与检测试剂作用和镜检，就能发现菌丝内产生的绿色色素，灵敏度相当高。

4、准确性高

本发明对菌核病菌菌丝内产生的绿色色素置于紫外分光光度计进行全程扫描，获得了绿色色素在可见光下最大吸收峰的波长，另外将相同供试病原菌接种于健康油菜叶片，从而获得致病斑与绿色色素之间的关系，以此为标准，不仅能检测出样品中的油菜菌核病菌，而且对其发病程度也具有一定的指导作用。本发明对土壤中、植物叶片等多个样品进行了检测，结果发现，本发明的检测方法的准确率高达100%。

本发明的其他目的优点可从以下的详细描述结合附图后获知。

附图说明

图1显示了检测试剂对18种不同植物病原真菌的作用效果，其中：

图1（1）～图1（5）分别为油菜菌核病菌Ss01（室内敏感菌株）、Hm25（田间抗多菌灵菌株）、Hm10^I（田间抗异菌脲菌株）、Hm10^T（室内诱变的抗3,3’,4’,5-四氯水杨酰苯胺菌株）、Hm10^IT（室内诱变的抗异菌脲和3,3’,4’,5-四氯水杨酰苯胺的双抗菌株）在不含检测试剂培养基平板中的菌落照片；

图1（6）～图1（10）分别为油菜菌核病菌Ss01、Hm25、Hm10^I、Hm10^T、和Hm10^IT在含有检测试剂的培养基平板中的菌落照片；

图1（11）～图1（27）分别为立枯丝核病菌、西瓜菌核病菌、桑椹菌核病菌、白菜炭疽病菌、西瓜炭疽病菌、日本珊瑚炭疽病菌、龙须草炭疽病菌、甜椒炭疽病菌、木耳炭疽病菌、芦荟炭疽病菌、西瓜蔓枯病菌、苍兰根腐病菌、长柄链格孢病菌、烟草赤星链格孢病菌、水稻纹枯病菌、小麦灰霉病菌、小麦赤霉病菌在含有检测试剂的培养基平板中的菌落照片。

图2显示了加入本发明检测试剂前后呈不同颜色的油菜菌核病菌菌丝体，其中：图2（a）显示不加检测试剂的油菜菌核病菌菌丝体，图2（b）显示添加50μg/mL检测试剂处理后的菌丝体，图2（c）显示显微镜下不加检测试剂的油菜菌核病菌菌丝，图2d显示显微镜下添加50μg/mL检测试剂处理后的菌丝。

图3显示了绿色色素及其分析条件，其中：图3（a）显示了从经过50μg/mL检测试剂处理的菌丝中提取的绿色色素，图3（b）显示了绿色色素置于Bio-x分光光度计进行全波长范围（200-800nm）扫描，在波长为622nm附近处呈最大吸收峰。

图4显示了经50μg/mL3-(2-吡啶基)甲基-2-(4-氯苯基)亚氨基噻唑烷（PMAS）或其含亚氨基噻唑烷结构的衍生物如：P-1、P-2、P-3、P-4、P-5、P-6和P-7（具体见实施例八中所列结构式）等检测试剂处理后的油菜菌核病菌菌丝体内绿色色素的含量。

具体实施方式

本发明的油菜菌核病菌（Sclerotinia sp.）检测试剂及其检测方法属于农林业植物保护和植物检疫范畴。

本发明提供了一类含有亚氨基噻唑烷结构的化合物(下称检测试剂)用于特异性地检测油菜菌核病菌的方法和培养基。该类化合物的具体合成方法可参考李刚月论文（Gang-Yue Li,Xu-Hong Qian,Sheng-Gang Yan,Jing-Nan Cui,Qing-Chun Huang,Rong Zhang,Feng-Yu Liu&Da-Wei Cui(2006)Synthesis and Biological Activity ofNovel Symmetrical Bis-2-phenyliminothiazolidine Derivatives.Phosphorus,Sulfur,andSilicon and the Related Elements,181:12,2851-2861.)。18类常见植物致病菌菌落在含亚氨基噻唑烷结构的化合物的培养基中培养后，只有油菜菌核病菌的菌丝体内产生绿色色素。可通过观察菌丝体或平板菌落颜色即可判定为油菜菌核病菌，并可通过检测绿色菌落数来判断菌核病菌感染程度。

检测方法一：挑取菌丝接种于含检测试剂（例如3-(2-吡啶基)甲基-2-(4-氯苯基)亚氨基噻唑烷）的PSB培养基摇瓶中，置于适宜条件（如25℃、180rpm条件下恒温培养1-3d）培养后，肉眼观察菌丝颜色。如菌丝为绿色，即判定为油菜菌核病菌。

检测方法二：取菌碟接种于含检测试剂（例如3-(2-吡啶基)甲基-2-(4-氯苯基)亚氨基噻唑烷）的PDA培养基平板中，置于适宜条件（如25℃条件下恒温培养2-3d）培养后，肉眼观察菌丝颜色。如菌丝为绿色，即判定为油菜菌核病菌。

本发明还提供了油菜菌核病菌菌丝体内绿色色素的提取及检测方法。

绿色色素的提取方法：收集绿色菌丝，去除表面水分后在低级醇溶剂中，超声波处理，在酸性条件下，浸提绿色素。具体可按如下操作：吸干绿色菌丝表面水分，然后将绿色菌丝加入30mL（6mL×5）90%乙醇中，超声波处理120min，用0.1M HCl将乙醇浸提液pH值调节至3.0，获得绿色色素的乙醇浸提液。绿色色素在615-630nm处，尤其在622nm处呈最大吸收峰，可用于进一步绿色色素的定量分析。

本发明中菌核病菌培养、检测方法和绿色色素的提取方法条件均经过正交实验优化获得。但本发明不限于这些优化条件，只要能使菌核病菌菌丝体产生在610-630nm处有最大吸收的绿色色素的培养条件，能充分提取该绿色素的提取条件均使用本发明。对于检测病菌的培养基中检测试剂的含量，在实施例中为50.0μg/mL，但也可在的0.1μg/mL-100.0μg/mL范围内，优选在1.0μg/mL-100.0μg/mL，更优选在20.0μg/mL-100.0μg/mL范围内选取。

下面结合具体实例，进一步阐述本发明。应理解，这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例一至实施例七中所用检测试剂均为3-(2-吡啶基)甲基-2-(4-氯苯基)亚氨基噻唑烷（PMAS）。

实施例一

分别将5种具有不同生理特性的油菜菌核病菌在PDA培养基上培养至对数生长期，在供试病原菌的菌落边缘打取直径为6mm菌碟，接种于不含有或者含有50μg/mL检测试剂的PDA培养基平板中，置于25℃条件下恒温培养2d，肉眼观察菌落颜色，并在光学显微镜下观察菌丝颜色，结果如图1（1）～图1（10）所示。

图1（1）～图1（5）分别为5种供试油菜菌核病菌Ss01、Hm25、Hm10^I、Hm10^T、和Hm10^IT在不含有检测试剂的平板上生长结果，菌落颜色呈白色，菌丝呈无色。

图1（6-）～图1（10）分别为5种供试油菜菌核病菌Ss01、Hm25、Hm10^I、Hm10^T、和Hm10^IT在含有检测试剂的平板上生长结果，菌落颜色呈绿色，菌丝呈绿色。

同时还表明，油菜菌核病菌在含有50μg/mL检测试剂的PDA培养基平板中的生长菌落明显小于在不含有检测试剂的PSA培养基平板的生长菌落，检测试剂对油菜菌核病菌的生长具有一定的抑制作用。

实施例二

分别将立枯丝核病菌、西瓜菌核病菌、小麦灰霉病菌等17种不同植物病原菌在PDA培养基上培养至对数生长期，在供试病原菌的菌落边缘打取直径为6mm菌碟，接种于不含有或者含有50μg/mL检测试剂的PDA培养基平板中，置于25℃条件下恒温培养2d，肉眼观察菌落颜色，并在光学显微镜下观察菌丝颜色，含检测试剂培养的结果如图1（11）～图1（27）所示。

图1（11）～图1（27）分别为供试的17种植物病原菌的菌落形态和颜色。这些病原菌在含有检测试剂和不含有检测试剂的平板上生长的菌落颜色没有区别。其中：立枯丝核病菌、西瓜菌核病菌、桑椹菌核病菌、白菜炭疽病菌、西瓜炭疽病菌、日本珊瑚炭疽病菌、龙须草炭疽病菌、甜椒炭疽病菌、木耳炭疽病菌、芦荟炭疽病菌、西瓜蔓枯病菌、苍兰根腐病菌、长柄链格孢病菌、烟草赤星链格孢病菌、水稻纹枯病菌、小麦灰霉病菌等16种病原菌的菌落颜色均呈灰白色，菌丝呈无色；小麦赤霉病菌的菌落呈现自身特有的粉红色，菌丝呈淡粉色。

实施例三

将油菜菌核病菌在PDA培养基上培养至对数生长期，在菌落边缘打取直径为6mm菌碟，接种于含有50μg/mL检测试剂的PSB摇瓶中，置于25℃，180rpm条件下恒温培养3d。在光学显微镜下观察菌丝体和菌丝的颜色。结果如图2所示。

图2（a）和（c）为油菜菌核病菌在不含有检测试剂的PSB摇瓶中培养的菌丝体，菌丝体呈白色，菌丝呈无色；图2（b）和（d）为油菜菌核病菌在含有50μg/mL检测试剂的PSB摇瓶中培养的菌丝体，菌丝体呈绿色，菌丝呈绿色。

实施例四

将油菜菌核病菌在PDA培养基上培养至对数生长期，在菌落边缘打取直径为6mm菌碟，接种于含有50μg/mL检测试剂的PSB摇瓶中，置于25℃，180rpm条件下恒温培养3d。双层纱布过滤，用双蒸水冲洗3次，吸水纸吸干菌丝表面的水分，加入30mL（6mL×5）90%乙醇进行浸提，超声波处理120min，总共进行5-7次，获得菌丝体内的绿色色素的乙醇浸提液，再用0.1M HCl将乙醇浸提液调节至pH3.0，即获得绿色色素。将绿色色素置于Bio-x分光光度计进行全波长200nm-800nm范围扫描，结果见图3所示。

图3（a）显示从经过50μg/mL检测试剂处理的菌丝中提取的绿色色素乙醇溶液，图3（b）显示绿色色素在波长为615-630nm区域处呈最大吸收峰。

实施例五

采集同一片油菜地里，大小一致，位置相同的健康油菜叶片，洗净，晾干，用接种针在叶片上刺一小孔，从含有3.125、6.25、12.5、25和50μg/mL检测试剂的已生长油菜菌核病菌的PDA培养基平板上，沿菌落边缘打取菌碟，分别接种于刺伤伤口处，接种后将油菜叶片置于温度为20℃，相对湿度为95%的恒温恒湿条件下，保湿培养4天，观察发病状况，并测量病斑面积。通过致病斑面积的测定和绿色色素含量的测定，可以得到菌丝体中绿色色素的含量越高，病菌在叶片上的致病斑面积就越小，表明检测试剂能降低油菜菌核病菌的致病力，对油菜菌核病还具有一定的防控效果。

实施例六

从田间选取感染病害的油菜叶片，洗净后，用10%漂白粉溶液消毒3-5min，截取10片均带有已发病和未发病区域（即病斑边缘）的叶片组织，大小约为0.5cm×0.5cm，平贴于含有检测试剂和1000ppm链霉素（其作用是防止细菌污染）的PDA培养基平板上，置于25℃条件下恒温培养48h，从叶片组织边缘长出病原菌的菌丝，可以观察到油菜菌核病菌的菌丝呈绿色，而其他病原菌如：油菜灰霉病菌的菌丝呈灰白色。

实施例七

从发病田块中取土样0.5g，迅速倒入带玻璃珠的50mL无菌水瓶中，振荡5-10min，使土样充分散开，即为土壤菌悬液。用无菌移液管吸取土壤菌悬液0.5mL，放入4.5mL无菌水中即为10^-2稀释液，如此重复，可依次制成10^-3-10^-8的稀释液。取10^-6稀释度菌悬液0.5mL均匀涂布在PDA平板（含1000ppm链霉素，以防止细菌污染）上，置于25℃条件下恒温培养48h，平板上长出的绿色菌落即为油菜菌核病菌。进一步可根据出现的绿色菌落数来评估该田块中油菜菌核病菌的潜在发生量，推测该田块中油菜菌核病菌将会对油菜种植的潜在危害程度。

实施例八

检测试剂：PMAS及其衍生物P-1、P-2、P-3、P-4、P-5、P-6和P-7。这些检测试剂的结构式如下：

R₁：4-Cl(PMAS)；2-Cl(P-1)；2-CH₃(P-2)；2-F(P-3)；2,4-F(P-4)；4-CF₃(P-5)；

R₂：4-CH₃(P-6)；4-Cl(P-7)。

取检测试剂PMAS及其衍生物P-1、P-2、P-3、P-4、P-5、P-6和P-7，用DMSO溶解后加入PSB培养液中，制成含有浓度为50μg/mL检测试剂的含药PSB培养液。从处于对数生长期的油菜菌核病菌的菌落边缘打取直径为6mm菌碟，接种于含药PSB培养液摇瓶中，置于25℃，180rpm条件下恒温培养3d。双层纱布过滤，用双蒸水冲洗3次，吸水纸吸干绿色菌丝表面的水分。将绿色菌丝加入30mL（6mL×5）90%乙醇中，超声波处理120min，用0.1M HCl将乙醇浸提液调节至pH3.0，获得绿色色素的乙醇浸提液。取3.0mL绿色乙醇提取液，置于紫外分光光度计波长为622nm下读取其吸光度值。结果如图4所示。本发明结果表明检测试剂3-(2-吡啶基)甲基-2-(4-氯苯基)亚氨基噻唑烷或其含亚氨基噻唑烷结构的衍生物均能引起油菜菌核病菌特异性地产生绿色色素，且不同含亚氨基噻唑烷结构的衍生物对油菜菌核病菌产生绿色色素的诱导能力与其使用浓度有关。

Claims (3)

1.式Ⅱ所示化合物在特异性检测油菜菌核病菌中的用途；

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，其中所述检测油菜菌核病菌，包括如下步骤：

(a)将样品接入含有特异性检测试剂的固体培养基或液体培养基中，置于适宜条件下培养，所述特异性检测试剂为式Ⅱ所示化合物；

(b)目测观察培养所得菌落或镜检观察所得液体培养物中菌丝体的颜色，如观察到绿色菌落或菌丝体，则表明样品中含有油菜菌核病菌；和

(c)当所述样品为田块土壤时根据固体培养基中出现的绿色菌落数来评估该田块中油菜菌核病菌的潜在危害程度，当所述样品为发病植物组织时根据固体培养基中出现的绿色菌落数来评估该发病植物的发病程度；或，

在酸性条件下，以低级醇浸提所述油菜菌核病菌菌丝体的绿色色素，并测定其吸光度，其吸光度测定波长在610nm至630nm内选取；

所述样品为疑有油菜菌核病菌的农林植物的子叶、茎秆、真叶或者土壤；培养基中所述特异性检测试剂的含量为0.1μg/mL～100.0μg/mL。

3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，其中步骤(a)中的培养为，样品接入含有0.1～100.0μg/mL式Ⅱ所示化合物的培养基摇瓶或平板中，置于25℃条件下恒温培养1-3天。