CN104789483A - 桉蝙蛾白僵菌菌种的分离培养及其防治桉蝙蛾的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种桉蝙蛾白僵菌菌种的分离培养及其防治桉蝙蛾的方法，它包括桉蝙蛾白僵菌菌种的采集、分离、纯化、鉴定、培养、保存，培养桉蝙蛾白僵菌分生孢子，将培养所得分生孢子配制浓度为1.0×10⁷孢子·mL^-1的悬浮液和用注射器将孢子悬浮液注入桉树上的桉蝙蛾蛀道内，或拆开木屑包对蝙蛾蛀道喷雾。所述桉蝙蛾白僵菌菌种经桉蝙蛾疑似感染白僵菌自然死亡虫尸的采集、病原菌的分离、鉴定和致病性测定所得。该方法采用的菌种从桉蝙蛾自然死亡虫尸中采集，分离培养后又用于灭杀桉蝙蛾，以菌治虫、生物防治，是一种无公害、环保和害虫防治有效措施，为保护和发展树林作出了贡献。

Description

桉蝙蛾白僵菌菌种的分离培养及其防治桉蝙蛾的方法

技术领域

本发明涉及一种害虫生物防治菌种，尤其是桉蝙蛾白僵菌菌种的分离培养及其桉蝙蛾的防治方法。

背景技术

桉树是我国南方引种栽培最广泛的用材林树种，据近来统计数据表明，全国桉树种植面积6000多万亩。桉蝙蛾是近年来发现危害桉树最严重的钻蛀性害虫，仅在广西，每年桉蝙蛾发生危害桉树的面积近5万亩，给桉树种植及其相关产业造成了巨大的经济损失。该害虫的幼虫期长，生活隐蔽，蛀道外有木屑包起防护作用，防治难度相当大，目前生产上还没有找到有效的防治方法。以菌治虫、生物防治是国内外广泛倡导和推广使用的无公害环保害虫防治措施，尤其是对于生活隐蔽、常规防治困难的钻蛀性害虫防治意义更为重大。

发明内容

在对桉蝙蛾天敌系统的调查和研究中，我们发现了一种真菌-桉蝙蛾白僵菌（Beauveria，bassiana (Bals.) Vuill）对桉蝙蛾害虫的致病率较高，能有效杀死桉蝙蛾，控制桉蝙蛾的虫口密度和危害程度。对桉蝙蛾白僵菌分离培养和扩大生产，能有效防治桉蝙蛾，减少害虫灾害，对保护树木具有十分重要的意义。

本发明的目的是提供一种桉蝙蛾白僵菌菌种的分离培养方法，为防治桉蝙蛾提供优质菌种，达到以菌治虫目的。

本发明的另一个目的是提供一种桉蝙蛾的防治方法，以菌治虫，生物防治，为保护森林和发展林业产业作出贡献。

为达上述目的，本发明的技术方案为:

一种桉蝙蛾白僵菌菌种的分离培养方法，它包括以下步骤：

（1）采集感病桉蝙蛾，采集桉蝙蛾疑似感染白僵菌自然死亡的虫尸；

（2）筛选病原菌，对采集的桉蝙蛾虫尸在光学显微镜下进行镜检，确定病原菌种类，选取感染白僵菌的虫尸；

（3）初培养，对所选择桉蝙蛾虫尸进行常规的表面消毒，剖切虫尸，取虫尸中间一小块组织移至PDA平板培养基上，封口后置于25℃恒温培养箱内培养7 天，然后取上述PDA平板培养基培养长出菌落边缘部位菌丝体移接于PDA斜面培养基上，25℃恒温箱内培养[微软用户1] ，待斜面培养基上菌种长满后放入4℃冰箱保存备用[微软用户2] ；

（4）单孢纯化，采用稀释纯化法对保存在冰箱中的菌种进行单孢纯化，备用；

（5）形态学鉴定，将所获得的桉蝙蛾白僵菌菌株置于PDA+桉蝙蛾虫体组织培养基上培养，其形态与球孢白僵菌最相似，初步确认为桉蝙蛾白僵菌；

（6）分子学鉴定，不同白僵菌菌株其菌落形态差异较大，根据形态的差异，筛选22个有代表性的菌株进行rDNA- ITS序列扩增，分子测序结果22个菌株的 ITS 序列均与球孢白僵菌序列相似性最高，相似性在98.16%以上。分子鉴定结果进一步确定为桉蝙蛾白僵菌。鉴定结果表明:桉蝙蛾白僵菌（Beauveria，bassiana (Bals.) Vuill）为桉蝙蛾病原真菌的优势类群。通过分离、培养、纯化、鉴定，获得桉蝙蛾白僵菌优势菌种。

利用桉蝙蛾白僵菌防治桉蝙蛾的方法为：

一种桉蝙蛾的防治方法，它包括以下步骤：

（1）取桉蝙蛾白僵菌菌种置于PDA斜面培养7-15天，让其长出大量分生孢子；

（2）将培养好的分生孢子置入一个灭过菌的盛有0.05% -吐温80无菌水的容器中；

（3）在液体快速混合器上充分振荡，3层灭菌的纱布过滤；

（4）将过滤所得分生孢子配制浓度为1.0×10⁷孢子·mL^-1的悬浮液；

（5）于桉蝙蛾幼虫期用注射器将孢子悬浮液注入桉树上的桉蝙蛾蛀道内，或拆开木屑包对蝙蛾蛀道喷雾，每个蛀道注射或喷雾1ml孢子悬浮液。无菌水做对照；

（6）效果检查，白僵菌菌株处理后，每5天检查1次桉蝙蛾幼虫死亡情况，20 天后统计处理组和对照组桉蝙蛾幼虫的累计死亡数量，计算死亡率和校正死亡率，评估防治效果。

上述桉蝙蛾白僵菌菌种的分离培养及防治桉蝙蛾的方法，菌种从桉蝙蛾自然死亡虫尸中采集，分离培养后又用于防治桉蝙蛾，以菌治虫、生物防治，是一种无公害、环保和害虫防治有效措施，为保护和发展树林作出了贡献。

附图说明

图1是本发明桉蝙蛾白僵菌分子鉴定的N-J系统发育树结构示意图。

具体实施方式

下面通过附图和实施例，对本发明作进一步说明。

实施例1

1、桉蝙蛾白僵菌菌种的采集

在广西桉蝙蛾发生的树林中，发现有桉蝙蛾疑似感染白僵菌自然死亡的死虫尸采集之。采集到的被真菌感染的桉蝙蛾幼虫、蛹和成虫虫尸共计218头；

2、筛选病原菌

选择致死病症较明显的虫尸的菌体于光学显微镜下进行镜检，确定病原菌种类；再将桉蝙蛾病虫尸进行常规的表面消毒，之后用无菌解剖刀将虫尸切开，用消毒的镊子挑取虫尸中间一小块组织移至PDA平板培养基上，每皿放入4块，封口后置于25℃恒温培养箱内培养7 天，然后取PDA平板培养基上的菌丝体移接于PDA斜面培养基上，在25℃恒温箱内培养，待斜面试管培养基上菌丝长满后放入4℃冰箱保存。采用稀释纯化法进行单孢纯化，备rDNA-ITS序列测定用。以形态学特征和 rDNA-ITS 序列分析结果为依据，进行桉蝙蛾白僵菌菌种鉴定后选择优质菌种。其中，rDNA-ITS 序列分子鉴定采用新型植物基因组DNA提取试剂盒；2×Es Taq MasterMix（购自北京康为世纪生物科技有限公司）；真菌通用引物ITS4（5′－TCCTCCGCTTATTGATATGC－3′）和ITS5（5′－GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG－3′）由上海生工生物工程（上海）股份有限公司合成；

鉴定结果表明:桉蝙蛾白僵菌（Beauveria，bassiana (Bals.) Vuill）为桉蝙蛾病原真菌的优势类群；

 3、桉蝙蛾白僵菌的形态学鉴定

将所获得的桉蝙蛾白僵菌菌株置于PDA+桉蝙蛾虫体组织培养基上培养，不同菌株菌落表面特征差异较大，主要分为四类菌落，各类型的特征为：Ⅰ型菌落，菌落圆形或近圆形，边缘整齐，气生菌丝发达，白色棉絮状，菌落隆起，高度可达1.1cm，中间凸起或凹陷，后期于棉絮状菌丝上产生大量分生孢子，粉状；Ⅱ型菌落：菌落圆形或近圆形，白色或淡黄色，边缘整齐，具有明显的同心轮纹，绒状或粉状，大部分菌落中部下陷，产生大量分生孢子；Ⅲ型菌落：菌落圆形或近圆形，纯白色、淡黄色或略显粉红色，边缘不整齐，部分呈裂瓣状，菌丝发达，棉絮状，后期于棉絮状菌丝上产生大量分生孢子；Ⅳ型菌落：菌落圆形或近圆形，边缘整齐，白色，表面为粉状，无同心轮纹，分生孢子层较均匀。从镜检结果中可看到，菌丝体有隔膜，透明无色，直径1.3-2.9μm，产孢细胞球形至烧瓶形或丝状，宽3.1-8.7μm，长3.0-10.0μm，产孢轴20.0μm 或者更长，宽约1.0μm，膝状或不规则弯曲，有小齿突，与产孢轴同宽。分生孢子形状多为球形，单胞，大小有所差异，具有Ⅰ型菌落的菌株，其分生孢子大小不均匀，差异较大，分生孢子直径2-5.5μm；具有Ⅱ型菌落的菌株，其分生孢子大小不均匀，差异明显或不明显，分生孢子直径2-4μm；具有Ⅲ、Ⅳ型菌落的菌株，其分生孢子大小差别较小，大小在2.5μm左右。其形态与球孢白僵菌最相似；

 4、桉蝙蛾白僵菌的分子鉴定

不同白僵菌菌株其菌落形态差异较大，根据形态的差异，筛选22个有代表性的菌株进行rDNA- ITS序列扩增，经生工生物工程（上海）股份有限公司上海测序部测序，将拿到的正反双向序列用MEGA5.2软件进行拼接校对，然后登陆NCBI数据库，用BLAST进行序列的同源性比对，找出与测定序列同源性最高的基因序列及其基因库登录号，结果见表1。测序菌株的序列长度565-575bp，22个菌株的 ITS 序列均与球孢白僵菌序列相似性最高，相似性在98.16%以上；

表1  22桉蝙蛾白僵菌菌株ITS序列BLAST比对结果

表1中从NCBI上下载了10条ITS序列，包括球孢白僵菌Beauveria bassiana及其有性型球孢虫草Cordyceps bassiana以及多形白僵菌Beauveria amorpha、布氏白僵菌Beauveria brongniartii和粘孢白僵菌Beauveria velata序列。以多形白僵菌、布氏白僵菌和粘孢白僵菌的ITS序列为外群，利用 MEGA5.2软件进行系统发育分析，使用其自带的Clustal W程序进行DNA序列的排定比对，以自展法Bootstrap1000次进行各分支的置信度检测，采用N-J法(neighbor-joining)构建系统发育树，见图1；

5、分析：从图1的Neighbor-joining系统发育树可以看出，所下载的球孢白僵菌Beauveria bassiana HQ880761.1、Beauveria bassianaAY531972.1和Beauveria bassianaAF347611.1及其有性型球孢虫草 Cordyceps bassiana AF347612.1同处于一个大分枝中，亲缘关系较近，而与同属中的其他种亲缘关系较远。布氏白僵菌Beauveria brongniartii JF947191.1和Beauveria brongniartiiHQ880782.1处于同一个分枝上，粘孢白僵菌Beauveria velata U35289.1和Beauveria velata Z54134.1处于同一个分枝上，多形白僵菌Beauveria amorpha HQ880806.1和Beauveria amorpha HQ880807.1处于同一个分枝上，它们均获得99%的支持率。因此该N-J系统发育树图能很明显的看出菌株的亲缘关系，供试的22个桉蝙蛾白僵菌菌株均与下载的4个球孢白僵菌及其有性态球孢虫草序列聚为一大类，与白僵菌属中的其它种明显处于不同分枝，亲缘关系较远，表明供试菌株均为球孢白僵菌，但是这些菌株出现了4个小分支，表明这22个菌株虽然都属于同一个种，但出现了一定程度的变异，这点与菌株的形态特征吻合，Clade1中的7个供试菌株菌落类型为Ⅱ型， Clade2中的8个供试菌株菌落类型为Ⅰ型，Clade3中的4个供试菌株菌落类型为Ⅲ型，Clade4中的3个供试菌株菌落类型为Ⅳ型菌落。综上所述，不同菌株间存在一定的遗传距离，菌株之间的遗传特性及其差异有待进一步研究。

形态学鉴定结合rDNA-ITS序列分析结果，将这些白僵菌确定为子囊菌门Ascomycota，盘菌亚门Pezizomycotina，粪壳菌纲Sordariomycetes，肉座菌亚纲Hypocreomycetidae，肉座菌目Hypocreales，虫草菌科Moniliaceae的无性态，白僵菌属Beauveria，球孢白僵菌Beauveria bassiana (Balsamo) Vuillemin，即桉蝙蛾白僵菌属于球孢白僵菌类，但桉蝙蛾白僵菌与感染其它昆虫的白僵菌存在致病力差异，桉蝙蛾白僵菌属于白僵菌的生理小种，对桉蝙蛾致病力强于其它生理小种，以下通过实验进行证实。

实施例2

1、桉蝙蛾白僵菌培养和分生孢子悬浮液的配制

将单孢分离纯化的桉蝙蛾白僵菌菌种置于PDA斜面培养7-15天，让其长出大量分生孢子，用灭菌的不锈钢药匙将培养好的分生孢子刮入一个灭过菌的盛有0.05% -吐温80无菌水的三角瓶中，在液体快速混合器上充分振荡，3层灭菌的纱布过滤后，用规格为（25格×16格）血球计数板计数孢子液中孢子的个数，并按照公式计算分生孢子浓度，进而将原液浓度配制成实验所需的浓度，备用；

2、桉蝙蛾白僵菌对桉蝙蛾致病性测定

从桉蝙蛾虫尸分离获得的白僵菌菌株中分别筛选长势较好的菌株，培养制成分生孢子悬浮液，进行6龄桉蝙蛾幼虫的致病性测定，用于接种的菌株，将其分生孢子配制浓度为1.0×10⁷孢子·mL^-1的悬浮液，用注射器将2mL孢子液注入桉蝙蛾蛀道，每个菌株两个重复，每个重复10头虫子，用 0.05%-吐温80无菌水作对照。从接菌后第4 天开始，每天拆开木屑包检查发病情况并做好记录，拆开木屑包无法观察虫体发病的统一在接菌后第20 天劈开木段检查发病情况，分析各菌株对桉蝙蛾幼虫致死情况；

结果见表2，两个白僵菌菌株处理后20 天桉蝙蛾幼虫的累计死亡率分别达到90%和100%，对照死亡率为0，而对比试验的镰刀菌菌株对桉蝙蛾幼虫死亡率仅为10%，表明白僵菌对桉蝙蛾幼虫的致病力较强，镰刀菌Fusarium的致病力较弱。对发病死亡的虫体进行病原菌的分离培养，获得的菌株与原接种菌株一致，确定白僵菌Beauveria为桉蝙蛾幼虫的病原真菌；

表2桉蝙蛾白僵菌对桉蝙蛾幼虫的致病性测定

注：LR₂₀/d：接种后20 天的累积死亡率．

  3、桉蝙蛾白僵菌对桉蝙蛾的致病特点

桉蝙蛾幼虫被白僵菌感染发病后，通常死于蛀道口附近，多数情况僵死的虫体头部伸出蛀道口或在蛀道口处，腹部留在蛀道内，少数情况整个虫体都在蛀道外的木屑包里。发病虫体，初期其体表会出现明显的黑褐色至黑色圆形或不规则形病斑，病斑大小为1-2㎜×5-6㎜，病斑直径2-3㎜居多，病情严重者，会出现整个体节都是黑斑。病斑多位于第4-10腹节气门和节间膜处，这些部位较柔软，病菌易于侵入，腹板或背板处也常有病斑出现，头部，胸部以及第1，2腹节很少见到病斑；虫体死亡当天或第二天即变成僵虫，虫体呈现3种不同的体色：原体色、黑色和粉红色，环境温湿度适宜，菌丝在虫体内快速生长，伸出体壁，随后在虫体表面产生大量分生孢子，粉状，白色或略显黄色，虫体逐渐变为白僵虫尸；

4、桉蝙蛾白僵菌的另一形态--球孢虫草的形态特征

子座从寄主头部和腹部伸出，2～9个，棒状，弯曲有柄，具有可孕的头部和不孕的柄部，长25~50.0mm，柄部直径2.0～8.0mm，可孕部长15.2～30.0 mm ，直径2.0～9.0mm，淡黄色或淡桔黄色，子囊壳着生于子座表面，子囊壳拟卵形，长宽为688~950×225～388μm，壁薄，膜质，轻轻按压就会开裂，成丛的子囊即从裂口溢出，所有子囊基部粘连在一起，着生于子囊壳基部，顶端游离。子囊圆筒形， 461.1～720.1×3.6～4.2 μm，单膜，具明显加厚的顶部子囊帽，子囊帽宽 3.5～4.1μm，子囊孢子丝状，具横隔，经常在横隔处脱节为part-spores， 5～10.1×0.9～1μm。该虫草形态特征与球孢白僵菌有性型球孢虫草Cordyceps bassiana最为接近（李增智等，2001）。

挑取子座内部组织，子座柄部，子囊壳，子囊孢子part-spores，以及虫尸组织分别进行分离培养，对获得的培养物进行形态学鉴定，其菌落形态结构以及菌丝、产孢结构、分生孢子的形态大小等特征与球孢白僵菌的描述一致。提取这些培养物的DNA，进行rDNA ITS序列扩增和比对分析，所获得的序列与多个球孢白僵菌序列的同源性均达到99%以上，参照Renske（2003）的标准，这些培养物可以确定到种，为球孢白僵菌Beauveria bassiana (Bals.) Vuillemin，形态特征和分子鉴定证实了该子座为球孢白僵菌的有性态球孢虫草Cordyceps bassiana Li, Li, Huang & Fan sp. Nov.；

5、桉蝙蛾白僵菌与松毛虫白僵菌对桉蝙蛾幼虫致死力对比测定

将3株松毛虫白僵菌和4株桉蝙蛾白僵菌配成1.0×10⁷孢子·mL^-1的悬浮液，采用蛀道注射孢子悬浮液法进行致病力测定，每个蛀道注射2mL孢子悬浮液，对照组注射2mL0.05%-吐温80溶液，自接菌后第3 天开始每天拆开木屑包观察桉蝙蛾幼虫死亡情况，接菌后第20 天，剖开所有木段检查桉蝙蛾幼虫的存活情况，被白僵菌感染的桉蝙蛾幼虫通常死于蛀道口处，拆开木屑包即可发现，但也不排除其死于蛀道内的可能性。致病力测定结果见表3；

表3 白僵菌对6龄桉蝙蛾幼虫的致病力测定

处理后第20 天解剖木段发现，对照组桉蝙蛾幼虫活动正常，非常活跃，反应灵敏，均无发病或死亡。处理组供试7个菌株均表现出对桉蝙蛾幼虫一定的致病力作用，死亡率为60-100%，初见死亡时间为5-7天。

松毛虫白僵菌3个菌株处理桉蝙蛾幼虫，其对桉蝙蛾的致死率为63.33%，初见死亡时间为接菌后第6.77 天，致死中时为8.9 天，说明松毛虫白僵菌对桉蝙蛾幼虫具有一定的致病力，但致死能力较弱。

桉蝙蛾白僵菌4个菌株对桉蝙蛾幼虫致病力较强，20天桉蝙蛾的致死率达97.50%。初见死亡时间为5 天，死亡时间较松毛虫白僵菌早，致死中时为7.4 天，死亡速度较快。其中Bb-WM1、Bb-CX14和Bb-QL9三个菌株表现出超强致病力， 3个处理20天致死率达100%；

从初见死亡时间、致死中时和死亡率3个方面综合考虑比较松毛虫白僵菌和桉蝙蛾白僵菌对桉蝙蛾幼虫的致病力，桉蝙蛾白僵菌以上3个方面均高于松毛虫白僵菌，说明桉蝙蛾白僵菌对桉蝙蛾幼虫的致病力较强，松毛虫白僵菌对桉蝙蛾幼虫的致病力较弱。桉蝙蛾白僵菌对桉蝙蛾寄主专化性较强，本研究发明意义重大。

实施例3

（1）桉蝙蛾白僵菌林间防治桉蝙蛾效果

    不同施菌方法的防治效果，选用分离自桉蝙蛾的球孢白僵菌Bb-WM1、Bb-CX14和Bb-QL9三个菌株进行林间防治试验，三个菌株是室内致病力测定毒力最高的菌株，将其分生孢子配成1×10⁷孢子/mL孢子悬浮液，采用两种施菌方法：①蛀道注射法；②拆开木屑包喷雾法；

表4 不同施菌方法的防治效果

注：相同的字母表示差异不显著（P=0.01）（Duncan新复极差法）；

从表4中可以看出，Bb-WM1、Bb-CX14和Bb-QL9 三个不同白僵菌菌株采用蛀道注射法进行桉蝙蛾防治，施菌2个月后，防效分别达94.12%，91.18%，94.12%，防治效果较为理想；采用拆开木屑包喷雾法施菌，防治效果仅此于蛀道注射法，防治效果分别为80.00%、85.00%、70.00%；而不拆开木屑包喷雾法施菌防治效果较差，不超过5%。由此可知同一个白僵菌菌株采用不同的施菌方式，防治效果差异较大，防治效果均表现为：①蛀道注射法>②拆开木屑包喷雾法，其中蛀道注射法与拆开木屑包喷雾法在P=0.01水平差异不显著，与不拆开木屑包喷雾法比差异极显著；拆开木屑包喷雾法与不拆开木屑包喷雾法相比较，Bb-CX14和Bb-QL9两个菌株均表现为差异极显著，而Bb-WM1菌株在P=0.01水平差异不显著；

虫体与菌体的接触是昆虫发病的前提条件，适合的温湿度条件是孢子萌发和侵染致病的主要制约因子。蛀道注射法是将孢子悬浮液注射到蛀道内，孢子液直接洒至桉蝙蛾虫体上或粘附在蛀道内壁中，孢子与虫体接触的机会大、数量多；接菌时间当地平均气温为23.92℃，有利于孢子的萌发；蛀道口有木屑包覆盖，注入的孢子液水分不易挥发，在相当长一段时间内能够保持较高的湿度条件，非常适合孢子的萌发和侵染，因此蛀道注射法，桉蝙蛾幼虫的死亡率较高，防效较为理想。拆开木屑包喷雾法是将桉蝙蛾蛀道口处的木屑包撕开一部分，然后用孢子悬浮液喷雾处理，孢子液没有直接洒至桉蝙蛾幼虫虫体上，大部分附着于木屑包内、蛀道口壁上以及蛀道口周围的愈伤组织上，桉蝙蛾幼虫爬出蛀道取食蛀道口处的愈伤组织，比较容易与病原孢子接触，取食的过程中部分病原孢子会随着食物进入消化道，病原孢子可以从消化道开始侵染，蛀道中的温湿度环境也比较适合病原菌孢子的萌发和侵染，因此拆开木屑包喷雾法防治桉蝙蛾幼虫效果也比较好；

（2）不同施菌时间防治效果

每个月进行一次桉蝙蛾林间防治试验，了解不同施菌时间白僵菌对桉蝙蛾幼虫的防治效果，统一使用编号为Bb-WM1的菌株进行防治，浓度配制为1.0×10⁷孢子·mL^-1的悬浮液，采用蛀道注射法和拆开木屑包喷雾法进行，结果见表5；

表5 不同施菌时间的防治效果

注：相同的字母表示差异不显著（P=0.01）（Duncan新复极差法）；

从表5中可知，2013年10月至2014年1月，蛀道注射法的防治效果为55%-94.12%，拆开木屑包喷雾法的防治效果为40%-80%，2种施菌方式的防治效果都是先下降再上升，同一种施菌方式不同施菌时间在p=0.01水平差异不显著；

表6 防治效果与林地气温的关系

注：*在0.05水平（双侧）上显著相关(Pearson相关系数，双侧检验)

 从表6可以看出，两种施菌方式的防治效果与林地内的月平均气温在0.05水平（双侧）上显著相关，说明温度对防治效果影响较大。10月份林地月平均气温为23.92℃，接近白僵菌孢子萌发和侵染的最适温度25℃，适合病原菌的萌发侵染，而且此时虫龄相对较小，寄主防御能力相对较弱，发病快，死亡率高，侵染致病效果显著，防效明显。11月份施菌，天气转冷，林地气温为20.14℃，气温降低，此时桉蝙蛾幼虫虫龄较大，防御抗病能力较强，发病速度较慢，防治效果有所降低。12月桉蝙蛾幼虫变为老熟幼虫，进入越冬休眠期，取食活动减弱，平均气温为12.79℃，为一年当中的最低气温，防效最差。2014年1月施菌，伴随着气温上升，天气回暖，侵染致病效果提升，防效升高。

桉蝙蛾白僵菌菌种优势菌株及保存

经过标本采集，分离、纯化、鉴定，培养分生孢子进行致病力测定和林间防治试验，筛选出三株高效桉蝙蛾的球孢白僵菌Bb-WM1、Bb-CX14和Bb-QL9，三个菌株是室内致病力测定毒力最高的桉蝙蛾白僵菌菌种，保存在广西大学农学院植保系统植物病理317实验室，供生产扩大培养和防治需要，为该桉蝙蛾的生物防治提供有力保障，对于有效控制害虫、保护林木生长，促进桉树产业发展意义重大。

Claims (2)

1.一种桉蝙蛾白僵菌菌种的分离培养方法，它包括以下步骤：

（1）采集感病的桉蝙蛾，采集桉蝙蛾疑似感染白僵菌自然死亡的虫尸；

（2）筛选病原菌，对采集的桉蝙蛾虫尸在光学显微镜下进行镜检，确定病原菌种类，选取感染白僵菌的虫尸；

（3）初培养，对所选择桉蝙蛾虫尸进行常规的表面消毒，剖切虫尸，取虫尸中间一小块组织移至PDA平板培养基上，封口后置于25℃恒温培养箱内培养7 天，然后，取上述PDA平板培养基培养长出的菌落边缘部位菌丝体移接于PDA斜面培养基上，25℃恒温箱内培养[s1] ，待斜面试管菌种长满后放入4℃冰箱保存备用；

（4）单孢纯化，采用稀释纯化法对保存在冰箱中的菌种进行单孢纯化，备用；

（5）形态学鉴定，将所获得的桉蝙蛾白僵菌菌株置于PDA+桉蝙蛾虫体组织培养基上培养，其形态与球孢白僵菌最相似，初步确认为桉蝙蛾白僵菌。

2.一种桉蝙蛾的防治方法，利用权利要求1的桉蝙蛾白僵菌菌种培养出大量分生孢子，然后进行防治，它包括以下步骤：

（1）取桉蝙蛾白僵菌菌种置于PDA斜面培养7-15天，让其长出大量分生孢子；

（2）将培养好的分生孢子置入一个灭过菌的盛有0.05% -吐温80无菌水的容器中；

（3）在液体快速混合器上充分振荡，3层灭菌的纱布过滤；

（4）将过滤所得分生孢子配制浓度为1.0×10⁷孢子·mL^-1的悬浮液；

（5）于桉蝙蛾幼虫期用注射器将孢子悬浮液注入桉树上的桉蝙蛾蛀道内，或拆开木屑包对蝙蛾蛀道喷雾，每个蛀道注射或喷雾1ml孢子悬浮液。