CN112941007A - 一种香蕉枯萎病菌的单孢分离方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种香蕉枯萎病菌的单孢分离方法。该方法采用一种特殊的孢子抹散丝，直接从香蕉枯萎病菌常规平板菌落中将单个分生孢子分离出来，培养形成一个遗传组成单一的香蕉枯萎病菌菌株。单孢分离培养的实施操作步骤如下：1)香蕉枯萎病菌产孢菌落的准备；2)孢子抹散丝的制备；3)孢子抹散板的制备；4)分生孢子的抹散；5)镜检寻找单孢子；6)载有单孢子小方块的切取；7)单孢子分离菌株的形成。本发明具有如下优点：1)分离孢子用的关键器具简单易制，分离操作简单易行；2)分离工作耗工少耗时短；3)能显著提高香蕉枯萎病菌分离的工作效率及分离结果的可靠性。

Description

一种香蕉枯萎病菌的单孢分离方法

技术领域

本发明涉及植物病理学技术。具体是一种香蕉枯萎病菌的单孢分离方法。

背景技术

香蕉枯萎病是我国香蕉产业的一种重大病害，该病害由香蕉枯萎病菌(Fusariumoxysporum f.sp.cubense)侵染引起。开展香蕉枯萎病菌的生物学研究是香蕉枯萎病防控的重要基础。而开展香蕉枯萎病菌生物学研究的前提，必需要拥有香蕉枯萎病菌材料。

香蕉枯萎病菌群体的遗传组成复杂，不同菌株的生物学特性及致病性往往存在较大差异。正常的研究通常需要取得遗传组成单一的香蕉枯萎病菌材料，或者说单克隆菌株材料。本领域一般认为由单一孢子生长形成的菌株材料属遗传组成单一的病菌材料。显然，香蕉枯萎病菌的常规研究，通常需要获得单孢分离菌株材料。

香蕉枯萎病菌的单孢分离方法，主要是采用常规的孢子稀释分离单孢子的方法、以及直接挑取单孢子的分离方法。

孢子稀释分离单孢子的方法，主要技术特征是，将产孢菌落的分生孢子洗涤到水介质中，对孢子悬浮液进行适度的稀释分散，再通过微量移液枪、或毛细管、或移植针等器具，将悬浮液中的孢子分开，挑取单个分生孢子进行培养。这类方法需要实施菌落洗涤、对洗涤获得的孢子液进行孢子定量、以及需要进行孢子稀释操作等过程，比较费工费时。

直接挑取单孢子的分离方法，主要技术特征是，采用挑孢针直接在显微镜下挑取单孢子。由于普通显微镜的成像是实物的反向成像，显微镜下操作动作也是反向的，因此该方法需要特殊的操作训练，或者说需要操作人员有较深厚的反向显微操作技术功底。

而且，由于香蕉枯萎病在常规条件下多产生小型分生孢子，该分生孢子比较微小，常规单孢分离操作过程容易受到琼脂平板中的非熔杂质的干扰和影响。

发明内容

本发明的目的是，提供一种分离培养获得香蕉枯萎病菌单孢菌株的单孢分离方法。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

一种香蕉枯萎病菌的单孢分离方法，采用一种特殊的孢子抹散丝直接从香蕉枯萎病菌菌落中，将单个分生孢子分离出来，培养形成一个遗传组成单一的香蕉枯萎病菌菌株，分离培养的操作步骤如下：

1.香蕉枯萎病菌产孢菌落的准备：将常规分离培养取得的香蕉枯萎病菌移植到常规培养基平板，常规培养获得香蕉枯萎病菌的产孢菌落。

2.孢子抹散丝的制备：取出10μl普通移液枪的枪头，将枪头的尖端放在火焰上灼烧，枪头尖端燃火处熔化，安全熄火后，用尖头镊子夹住一点熔化的枪头，轻轻拉长，至形成一根发丝状的细丝，冷却后剪去多余的细丝，形成一支分离香蕉枯萎病菌分生孢子使用的孢子抹散丝，该抹散丝包括滑动丝a、丝柄b部分。

3.孢子抹散板的制备：

①琼脂平板基质的制备：按照琼脂15g、水1000ml的配比，配制含有常规营养的琼脂基质，常规高温高压灭菌后，成为琼脂平板基质备用。

②琼脂平板的倒制与平板表层净化：将操作①制备的琼脂平板基质加热充分熔化，趁热倒入培养皿制成薄层平板，并将该热液状的平板置于能继续保持热液状的保温装置内，保温静置20分钟以上，然后将该静置的液状薄层平板，平稳转移到无菌工作台面，待液状薄层平板冷凝后，成为表层净化的琼脂平板。

③孢子抹散板的切制与装片：用灭菌刀片将操作②制成的琼脂平板，切割成长条状的琼脂条块，该琼脂条块就是起分散孢子作用的抹散板；用灭菌刀片将该抹散板挑起装放到灭菌载玻片上，成为备待分散孢子用的抹散板c。

4.分生孢子的抹散：将步骤2制备的孢子抹散丝进行常规表面消毒和清洁，然后手执孢子抹散丝的丝柄b，将滑动丝a的端部，在步骤1准备的产孢菌落上，轻轻点触菌落而粘附分生孢子，将粘有孢子的滑动丝a转移到步骤3准备的孢子抹散板c的一端，并贴放于抹散板面上，沿着抹散板面滑移滑动丝a，滑动丝a在抹散板面的相对滑抹，导致滑动丝a上粘附的孢子脱开散落在抹散板面上。

5.镜检寻找单孢子：将步骤4得到的载有分生孢子的抹散板c，置于显微镜下观察，沿着滑动丝a的滑动轨迹寻找离散的孢子，找出单一出现的孢子，选择与左右相邻孢子间隔距离远的单一孢子。

6.载有单孢子小方块的切取：将步骤5镜检选择的单一孢子移到显微镜视野中间，用灭菌刀片将该单一孢子左右的抹散板c切断及移开，得到只载有唯一1个分生孢子的小方块。

7.单孢子分离菌株的形成：用刀片将步骤6切出的载有单一分生孢子的小方块，转移到香蕉枯萎病菌的常规培养基上，常规培养，直到孢子萌发生长形成单孢子菌落。移植单孢子菌落的菌丝扩大繁殖，形成香蕉枯萎病菌单孢子分离菌株。

本发明的优点是：

1)采用的关键器具(孢子抹散丝)简单易制，分离操作简单易行，无需难度较大的显微操作技术训练。

2)获得单孢菌株的技术操作，耗工少耗时短。

3)承载分生孢子的板面经过表层净化，显微镜观察到的有效视野较均匀干净，在寻找识别香蕉枯萎病菌分生孢子操作过程中，不容易受到非熔杂质的干扰，能显著提高分离工作的效率及分离结果的可靠性。

附图说明

图1是用10μl普通移液枪的枪头制成的孢子抹散丝示意图。图中，滑动丝a，丝柄b。图1-1是原初制成的孢子抹散丝，图1-2是套加一截笔杆后的孢子抹散丝。

图2是摆放在载玻片上的孢子抹散板示意图。图中，抹散板c，载玻片d。图2-1示意正面观，图2-2示意侧面观。

图3是孢子抹散操作示意图。图中，滑动丝a，丝柄b，抹散板c，载玻片d，滑动丝的滑动方向e。

图4是显微镜观察到的抹散板表面图。图中，分生孢子a，杂质b。图4-1是表层净化的抹散板，图4-2是表层未净化的抹散板。图中黑色短棒长50μm。

图5是抹散丝的滑动丝粘带分生孢子后，在抹散板上滑动导致孢子散落在抹散板面上的过程。图中，分生孢子a。图5-1是滑动丝与抹散板开始接触之处，很多孢子脱离滑动丝散落在抹散板上。图5-2是滑动轨迹中孢子逐步稀散变少。图5-3是滑动轨迹中出现离散独立的单孢子。图5-4是与左右相邻孢子距离较远的独立单一孢子。图中黑色短棒长50μm。

图6是采用本发明的方法从菌落1分离获得香蕉枯萎病菌单孢菌落的过程与结果。图6-1是香蕉枯萎病菌的菌落1。图6-2是在一个培养皿平板上摆放3块小方块，各小方块上均载有从图6-1的菌落上分离出来的单一个分生孢子。图6-3是图6-2的分生孢子置于28℃培养2天后，在小方块上萌发生长形成明显的菌丝小菌落。图6-4是图6-3的小菌落继续于28℃再培养1天后，生长成较大的菌落。图中黑色短棒长5mm。

图7是采用本发明的方法从菌落2分离获得香蕉枯萎病菌单孢菌落的过程与结果。图7-1是香蕉枯萎病菌的菌落2。图7-2是在一个培养皿平板上摆放3块小方块，各小方块上均载有从图7-1的菌落上分离出来的单一个分生孢子。图7-3是图7-2的分生孢子置于28℃培养2天后，在小方块上萌发生长形成明显的菌丝小菌落。图7-4是图7-3的小菌落继续于28℃再培养1天后，生长成较大的菌落。图中黑色短棒长5mm。

具体实施方式

下面结合附图与实施例对本发明作进一步描述。

香蕉枯萎病菌的分生孢子有两种，一种是大型分生孢子，一种是小型分生孢子，在常规营养培养基平板上产生的分生孢子多为小型分生孢子。本发明采用巧妙的手段从香蕉枯萎病菌菌落上将单一个分生孢子分离出来，培养形成遗传组成单一的香蕉枯萎病菌纯培养。具体实施方式如下。

1.香蕉枯萎病菌产孢菌落的准备：将常规分离培养取得的香蕉枯萎病菌移植到常规培养基(如马铃薯薕蔗糖琼脂PSA)平板，置于适合温度(如28℃)培养，通常培养3-5天后形成产孢菌落，可以从该菌落上进行单孢分离。

2.孢子抹散丝的制备

取出10μl普通移液枪的枪头，将枪头的尖端放在火焰上灼烧，枪头尖端燃火处熔化，用酒精灯灭火罩等用具安全熄灭枪头上的燃火，用尖头镊子夹住一点熔化的枪头，轻轻拉长，至形成一根发丝状的细丝，冷却后剪去多余的细丝，保留约3cm长的细丝连在枪头上，即形成一支分离香蕉枯萎病菌孢子使用的孢子抹散丝，该抹散丝工具包括滑动丝a和丝柄b部分，如图1-1所示，这两部分天然连接成一体，关键技术作用是滑动丝a。滑动丝a细小、柔软且兼有弹性。

丝柄b实际只是个小枪头主体，由于该枪头较为短小，不便于后面的执拿操作，可以取一截普通铅笔，用削笔刀将该截铅笔作常规削尖笔头，再将削尖笔头套入小枪头内旋紧，形成一个较长的、便于人手执拿操作的丝柄b，如图1-2所示。

分离不同的标本使用时，可先用75％的酒精棉球擦拭滑动丝a作表面消毒，也可以重复前面的操作再烧制及拉伸新的滑动丝。

3.孢子抹散板的制备

按如下方法制备。

先配制琼脂平板基质：

按照琼脂15.0g、水1000.0ml的配比，配制含有常规营养的琼脂基质。香蕉枯萎病菌的常规营养可以用马铃薯蔗糖(PS)培养基，按常规用量添加在琼脂基质中，常规高温高压灭菌后成为含有营养的琼脂平板基质。实际应用时，琼脂的使用量可依据从市面所购的琼脂质量而定，每升基质的琼脂用量可以在10.0g～15.0g变动，原则上是用量少、且冷凝后切割成小琼脂条时，小琼脂条仍具有较好的弹性为宜。

然后倒制表面净化的琼脂平板：

常规的琼脂培养基平板的琼脂含量为2.0g/升，按常规方式倒制的平板，显微镜下容易看到琼脂平板表层中的非熔杂质。发明人经过探索发现采取如下的制备技术，可以有效减少琼脂平板表层中的非熔杂质：将高温熔化倒制的平板保持热熔状态20分钟以上再冷凝。具体可以按如下操作：

用普通器具与材料组配形成一个保温装置，比如，将普通食品包装铁盒，罩盖在盛装热水的普通小钢盆上面，即获得一个有热度的铁盒面板(利用该铁盒面板放置培养皿)，再用一个塑料盆倒过来扣罩住铁盒与热水钢盆，并在塑料盆上面铺盖毛巾之类的保温材料，即能组配成一个适合本发明用的保温装置。

工作时先将普通小钢盆放置在无菌工作台上，将刚烧沸的热水倒入小钢盆，再罩上铁盒，将平底培养皿放置在铁盒面板上，扣罩塑料盆把培养皿预热5分钟，然后打开扣罩塑料盆，将已加热充分熔化的琼脂平板基质，趁热倒入预热的培养皿内，形成厚度约为1.0mm的薄层平板，罩回塑料盆并铺放保温材料，保持薄层平板处于热液状保温静置20分钟以上，热液状平板表层的非熔杂质可缓慢沉降到下层中，考虑到长时间高温造成热液状平板水分的过度蒸发，以及影响琼脂的凝固性能，保温时间宜控制在30分钟内。然后打开扣罩塑料盆，将液状薄层琼脂平板平稳转移到无菌工作台面冷却，冷凝后即获得表层净化的琼脂平板。

再将琼脂平板切割与装片形成孢子抹散板：

用灭菌手术刀片将上述制备的琼脂平板切割成狭长的琼脂条块，可以切成宽度为3mm，长度为4～5cm的长条状琼脂块，再用手术刀片将该长条状琼脂块挑转到灭菌载玻片上，长条琼脂块长向沿着载玻片长向摆放，如图2所示，将该摆放好的长条琼脂块作为滑散孢子用的抹散板c。

4.分生孢子的抹散

用酒精和无菌水按常规方式将制备好的孢子抹散丝表面清洁和消毒，手执抹散丝的丝柄b，将滑动丝a在前面准备的产孢菌落上轻轻点触，滑动丝a表面能粘附许多分生孢子，将粘有孢子的滑动丝a转移到已备好的孢子抹散板c，并贴放于抹散板面的一端，然后拖拉滑动丝a沿着抹散板面，向抹散板c的另一端滑动，如图3所示，滑动丝a在抹散板面的接触滑动，导致滑动丝a上粘附的孢子脱落并分散在抹散板面上。

5.镜检寻找单孢子

将上述操作得到的载有孢子的抹散板c，置于普通显微镜下观察，可见经过净化的抹散板c，表面杂质明显减少，如图4所示，因而在寻找与识别香蕉枯萎病菌微小的分生孢子的操作过程中，能显著提高寻找与识别的效率与准确性。

通常在滑动丝a与抹散板面首先接触之处，脱落大量的分生孢子，跟随滑动丝a滑动的轨迹观察，可见脱落到抹散板面的孢子逐步稀散变少，并出现离散的单个孢子，继续沿着滑动丝轨迹寻找，能找到与左右相邻孢子间隔距离较远的独立单一孢子，如图5所示。通常一条抹散板上能滑出1～5个远距离独立的单一孢子。

显微观察过程主要使用10倍物镜，必要时转换到40倍物镜观察细微特征，确认捕捉的目标是单一的香蕉枯萎病菌分生孢子。

6.载有单孢子小方块的切取

在确认捕捉的目标是单一的香蕉枯萎病菌分生孢子，而且该孢子与左右相邻孢子距离较远时，用灭菌手术刀片将该单一孢子左右的抹散板切断及移开，得到只载有独立一个分生孢子的小方块。

捕捉寻找孢子需要使用显微镜目镜观察，而切割操作可以离开显微镜目镜，直接肉眼观察操作，无需显微操作。操作要领是：将显微镜台下的聚光光阑调小，并上下调节聚光模块，至肉眼可见光源聚集成一个小光点穿过载玻片上的抹散板，该小光点直径大约2mm，普通显微镜10倍物镜视野所覆盖实物的直径也是大约2mm，参比这两个参数来判断切割孢子抹散板时的下刀位置，而且10倍物镜的镜头与观察物之间通常有1cm的距离，适合用尖头刀片(如23号手术刀片)的切割操作。切割后，可以返回显微镜目镜观察检查切割结果，包括下刀切割位置是否恰当，切割前后抹散板上的孢子存在状况。

7.单孢子分离菌株的形成

用手术刀片将切出的载有单一分生孢子的小方块，转移到香蕉枯萎病菌的常规平板培养基(如马铃薯蔗糖琼脂PSA)上常规培养。分生孢子在小方块上正常萌发和生长，一般在28℃条件下培养2天后就能生长形成明显的小菌落，继续培养，菌落扩大形成较大的菌落。从单一菌落移植菌丝扩大繁殖，就获得香蕉枯萎病菌单孢子分离菌株。

实施例1

采用本发明一种香蕉枯萎病菌的单孢分离方法，进行香蕉枯萎病菌菌落1的单孢分离，分离培养结果如图6所示。

实施例2

采用本发明一种香蕉枯萎病菌的单孢分离方法，进行香蕉枯萎病菌菌落2的单孢分离，分离培养结果如图7所示。

Claims (1)

1.一种香蕉枯萎病菌的单孢分离方法，其特征是，采用一种特殊的孢子抹散丝直接从香蕉枯萎病菌菌落中，将单个分生孢子分离出来，培养形成一个遗传组成单一的香蕉枯萎病菌菌株，分离培养的操作步骤如下：

1)香蕉枯萎病菌产孢菌落的准备：将常规分离培养取得的香蕉枯萎病菌移植到常规培养基平板，常规培养获得香蕉枯萎病菌的产孢菌落；

2)孢子抹散丝的制备：取出10μl普通移液枪的枪头，将枪头的尖端放在火焰上灼烧，枪头尖端燃火处熔化，安全熄火后，用尖头镊子夹住一点熔化的枪头，轻轻拉长，至形成一根发丝状的细丝，冷却后剪去多余的细丝，形成一支分离香蕉枯萎病菌分生孢子使用的孢子抹散丝，该抹散丝包括滑动丝(a)、丝柄(b)部分；

3)孢子抹散板的制备：

①琼脂平板基质的制备：按照琼脂15g、水1000ml的配比，配制含有常规营养的琼脂基质，常规高温高压灭菌后，成为琼脂平板基质备用；

②琼脂平板的倒制与平板表层净化：将操作①制备的琼脂平板基质加热充分熔化，趁热倒入培养皿制成薄层平板，并将该热液状的平板置于能继续保持热液状的保温装置内，保温静置20分钟以上，然后将该静置的液状薄层平板，平稳转移到无菌工作台面，待液状薄层平板冷凝后，成为表层净化的琼脂平板；

③孢子抹散板的切制与装片：用灭菌刀片将操作②制成的琼脂平板，切割成长条状的琼脂条块，该琼脂条块就是起分散孢子作用的抹散板；用灭菌刀片将该抹散板挑起装放到灭菌载玻片上，成为备待分散孢子用的抹散板(c)；

4)分生孢子的抹散：将步骤2)制备的孢子抹散丝进行常规表面消毒和清洁，然后手执孢子抹散丝的丝柄(b)，将滑动丝(a)的端部，在步骤1)准备的产孢菌落上，轻轻点触菌落而粘附分生孢子，将粘有孢子的滑动丝(a)转移到步骤3)准备的孢子抹散板c的一端，并贴放于抹散板面上，沿着抹散板面滑移滑动丝(a)，滑动丝(a)在抹散板面的相对滑抹，导致滑动丝(a)上粘附的孢子脱开散落在抹散板面上；

5)镜检寻找单孢子：将步骤4)得到的载有分生孢子的抹散板(c)，置于显微镜下观察，沿着滑动丝(a)的滑动轨迹寻找离散的孢子，找出单一出现的孢子，选择与左右相邻孢子间隔距离远的单一孢子；

6)载有单孢子小方块的切取：将步骤5)镜检选择的单一孢子移到显微镜视野中间，用灭菌刀片将该单一孢子左右的抹散板(c)切断及移开，得到只载有唯一1个分生孢子的小方块；

7)单孢子分离菌株的形成：用刀片将步骤6)切出的载有单一分生孢子的小方块，转移到香蕉枯萎病菌的常规培养基上，常规培养，直到孢子萌发生长形成单孢子菌落；移植单孢子菌落的菌丝扩大繁殖，形成香蕉枯萎病菌单孢子分离菌株。

Images