CN113308432B - 一种稻曲病菌薄壁分生孢子的转移和分散方法 - Google Patents

Abstract

一种稻曲病菌薄壁分生孢子的转移和分散方法，直接从产孢菌落上拾取孢子并转移分散到观测平板上，按如下步骤操作：1)材料及器具的准备；2)孢子源的准备；3)孢子观测板的制备；4)孢子的拾取与密集孢子的稀释；5)孢子的转移与释放；6)孢子的培养观测。本发明具有如下优点：1)不需要将关键的工作材料(薄壁分生孢子)配备成孢子悬浮液，减少污染风险；2)可以在长条状的培养平板上散布与观测薄壁分生孢子的萌发与生长，提高观测孢子萌发活动的效率与效果，有利于开展孢子萌发生物学研究中的多因素作用设计与批量测试比较。

Description

一种稻曲病菌薄壁分生孢子的转移和分散方法

技术领域

本发明涉及植物病理学技术，具体是一种稻曲病菌薄壁分生孢子的转移和分散方法。

背景技术

稻曲病是我国水稻生产的一种重要病害，可给水稻生产造成重大损失，该病害由稻曲病菌(Ustilaginoidea virens)侵染引起。薄壁分生孢子是稻曲病菌的无性繁殖体，在稻曲病的病害循环和病害流行中发挥重要作用。充分认识薄壁分生孢子的萌发生物学对有效防控稻曲病的发生流行至关重要。在稻曲病菌繁殖体的萌发生物学及相关的研究工作中，经常需要将薄壁分生孢子移植/转移到培养平板上进行观测培养，这种观测培养不仅要求培养平板上的孢子处于恰当的分散状态，也要求各个移植处理平板上的孢子数量及分布保持一致。只有这样才能高质量完成有关的研究测试。

当前将薄壁分生孢子转移及分散到培养平板的方法，几乎都是水液载体移植方法，该方法的技术要点是，将产孢制备培养获得的孢子悬浮到水液载体中，配备成孢子悬浮液(简称孢子液)，然后用移液器将孢子液定量转移到培养基观测平板面上，并用工具将孢子液涂布分散到平板上，再进行有关的培养与观察等测试工作。该方法看似简单，但实践操作上仍存在相当的难度与繁琐，主要表现在，关键的工作材料(薄壁分生孢子)的获得技术操作中，往往需要采取过滤操作以脱减孢子液中的菌丝，也需要离心沉淀操作脱除孢子液中的培养基以及培养代谢产物等，这些操作过程存在较大的污染风险，另外，需要将孢子液的孢子浓度调整到合适的范围，因此需要反复的调配与取样到计数板或载玻片，还要转到生物显微镜下观察计数，比较繁琐。

发明内容

本发明的目的是，提供一种稻曲病菌薄壁分生孢子的转移和分散方法。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

一种稻曲病菌薄壁分生孢子的转移和分散方法，直接从产孢菌落上拾取孢子并转移分散到观测平板上，孢子转移和分散的操作步骤如下：

1.材料及器具的准备

用常规方法制备马铃薯琼脂培养基作孢子萌发观测培养基备用；用培养皿作保湿容器，常规消毒后备用；用棉签作孢子转移器具，先在棉签上用记号笔点画标记，再装入枪头盒，进行高温高压灭菌后备用。

2.孢子源的准备

采用马铃薯琼脂培养基作为稻曲病菌薄壁分生孢子的产孢培养基，进行稻曲病菌的产孢培养，直至形成产孢菌落，以该产孢菌落作为孢子源菌落。

3.孢子观测板的制备

取步骤1制备的马铃薯琼脂培养基加热熔化，倒入灭菌培养皿制成普通平板，平板冷凝后用灭菌刀片将该平板切成条状平板，并将条状平板转移到灭菌载玻片上，作为分生孢子观测板。

4.孢子的拾取与密集孢子的稀释

将步骤1准备的灭菌棉签的端部球面，在步骤2准备的孢子源菌落上碰触，吸附拾取孢子；然后转移到空白琼脂平板上抹涂与点印，稀释棉签上的密集孢子；在进入下一步骤操作前，将已经拾取孢子的棉签置于步骤1准备的保湿容器内，以保护棉签吸附孢子的活性。

5.孢子的转移与释放

取步骤4稀释孢子后的棉签，在步骤3制备的孢子观测板面不同位置作有序连续点印，得到孢子数量相近、且孢子分散性良好的孢子印迹。

6.孢子的培养观测

将步骤5得到载有孢子印迹的观测板置于具有保湿效果的保鲜盒内，置于工作设定的培养条件下培养，按工作要求观察与测定这些分生孢子的萌发与生长特征。

本发明的优点：

1)不需要将关键的工作材料(薄壁分生孢子)配备成孢子悬浮液，减少污染风险。

2)可以在长条状的培养平板上散布与观测薄壁分生孢子的萌发与生长，提高观测孢子萌发活动的效率与效果，有利于开展孢子萌发生物学研究中的多因素作用设计与批量测试比较。

附图说明

图1是棉签端部球面在稻曲病菌孢子源菌落上碰触粘附薄壁分生孢子一次，然后在琼脂平板面上进行连续多次点印，其中的4个印迹获得孢子的数量与分散状态。1-1图是在琼脂面上的首次点印，1-2图是在琼脂面上的第20次点印，1—3图是在琼脂面上的第30次点印，1-4图是在琼脂面上的第50次点印。图中的黑色圆点是显微镜下观察到的稻曲病菌的薄壁分生孢子。图中下部的黑色短棒长50μm。

图2是棉签端部球面在稻曲病菌孢子源菌落上仅仅吸附拾取一次薄壁分生孢子，然后转移到9cm平皿倒制的马铃薯琼脂培养基平板面上，连续有序点印孢子195次，再转到28℃条件下培养5天，各次点印位置上散落的孢子萌发生长所形成的菌落。点印顺序：首行在上、尾行在下；每行从左到右。图中相邻的多个印迹菌落的生长量一致。图中标记a的菌落是首次印迹生长形成的菌落，标记b的菌落是第195次印迹生长形成的菌落。

图3是采用本发明的方法将稻曲病菌菌株Uv-1的薄壁分生孢子从孢子源菌落转移到观测板面上的分散状态，以及在28℃温度条件下培养43小时后，这些孢子的萌发生长状态。图中下部的黑色短棒长50μm。

具体实施方式

在稻曲病研究的日常工作中，发明人用普通棉签的端部棉球碰触稻曲病菌的产孢菌落后，转到平板面上点印处理，棉球吸附的薄壁分生孢子可以散转到琼脂平板面上。意外发现的是，棉球表面仅仅碰触一次产孢菌落，却可以在琼脂平板上连续点印散落孢子150次以上，观察点印印迹中的孢子，发现大部分印迹中孢子的分散性良好，如图1所示，而且相邻印迹中孢子的数量接近。将有序连续点印孢子195次的培养平板置于28℃温度下培养5天，所有印迹的孢子均萌发生长形成可见菌落，而且相邻多个印迹的菌落生长量接近，说明各印迹的孢子数量呈现逐印平缓递减的过程，如图2所示。结果表明在产孢菌落上只需要碰触一次，就能在培养平板上印出很多的孢子数量相近且分散性良好的孢子印迹，这样的效果正好是稻曲病菌繁殖体生物学的许多研究中，薄壁分生孢子移植所需要的技术效果。按照下面的具体步骤操作实施，本发明能取得这样的技术效果。

1.材料及器具的准备

稻曲病菌薄壁分生孢子萌发生物学的观察与测定采用马铃薯琼脂培养基，可以按常规方法制备该培养基备用。

用普通培养皿作保湿容器，最好是用12cm以上的培养皿。将培养皿常规消毒后，内部置入干净的湿纸/或湿纱布即成为具备保湿作用的容器。

用普通棉签作为稻曲病菌薄壁分生孢子转移的工具。由于棉签端部的圆形棉球没有方向方位标志，而且稻曲病菌薄壁分生孢子通常为无色状态，因此，当棉签碰触菌落吸附拾取孢子后，吸附孢子部位与非吸附孢子部位往往区分不开。可以用记号笔在棉签上点画作方位标记，将点画标记后的棉签装入1000μl枪头盒，进行常规高温高压灭菌后备用。

2.孢子源的准备

用马铃薯琼脂培养基制备培养稻曲病菌薄壁分生孢子，稻曲病菌在该培养基平板上于28℃温度下培养5天后，通常能生成大量产孢的菌落，将该产孢菌落作为取得及转移薄壁分生孢子的来源，简称孢子源。

3.孢子观测板的制备

取步骤1准备的马铃薯琼脂培养基加热熔化，无菌条件下倒入灭菌培养皿制成普通平板，平板冷凝后，用灭菌手术刀片将培养基平板切成条状，并将该条状的培养基平板转移到灭菌载玻片上，作为观测薄壁分生孢子用的观测板。该观测板的长度可以与载玻片长度一致，宽度可略宽于棉签端部球面。

4.孢子的拾取与密集孢子的稀释

取出步骤1准备好的有方位记号的灭菌棉签，将棉球在步骤2准备的孢子源菌落上碰触，吸附拾取孢子；然后将拾取孢子的球面转到普通空白琼脂平板面上进行轻轻抹涂和点印操作，该球面吸附的密集孢子可以快速释放稀散，通常在平板面上轻轻抹涂3～4次，该棉签球面留下的孢子分散状态符合工作要求，实际操作可以在抹涂操作后，将棉签球面以点印方式印到琼脂面上，再把这些孢子印迹转到显微镜下检查，确认孢子的分散程度或分散间距符合工作要求。不同的研究内容往往对孢子的分散程度要求不全一样，观测孢子的萌发率，孢子的分散间距可以窄一些，观测孢子萌发芽管的生长活动，则孢子的分散间距可以宽一些。原则上，孢子间的密集分布不能影响后续工作对各个孢子萌发生长动态的识别。需要注意的是，稻曲病菌薄壁分生孢子长时间处于干燥环境容易失活，为了避免棉签球面上的孢子失活，在镜检期间，可以将已拾取孢子的棉签置于步骤1准备的保湿容器内保护。

5.孢子的转移与释放

步骤4镜检确认棉签球面点印出来的孢子分散效果符合工作要求之后，将此时的棉签转移到步骤3制备的孢子观测板面上，依据棉签的方位标记，将拾取孢子的球面对准观测板面不同位置作有序连续逐次点印，棉签球面上的孢子逐次释放散落在观察板面的各个点印位置上，根据工作需要确定点印的次数，点印完毕后即得到孢子分散性良好的孢子印迹，而且各个印迹的孢子数量相近。

6.孢子的培养观测

将步骤5得到载有薄壁分生孢子印迹的观测平板放入内部垫有湿纸/或湿纱布的保鲜盒或其它保湿小容器内，再将孢子连同保湿小容器一起置于工作设定的培养条件下培养，按工作要求观察与测定这些分生孢子的萌发与生长特征。

实施例1

采用本发明一种稻曲病菌薄壁分生孢子的转移和分散方法，从菌株Uv-1的孢子源菌落上将薄壁分生孢子转移分散到孢子观测板，结果观测板面上的孢子的分散性良好，将该观测板置于28℃温度条件下培养43小时后，取出在显微镜下观察各个点印印迹，能清晰识别各个印迹中的孢子及其萌发的芽管，如图3所示，随机观察其中一个印迹中的150个孢子，正常萌发的孢子萌发率为93％。

Claims (1)

1.一种稻曲病菌（ Ustilaginoidea virens）薄壁分生孢子的转移和分散方法，其特征是，直接从产孢菌落上拾取孢子并转移分散到观测平板上，孢子转移和分散的操作步骤如下：

1)材料及器具的准备：用常规方法制备马铃薯琼脂培养基作孢子萌发观测培养基备用；用培养皿作保湿容器，常规消毒后备用；用棉签作孢子转移器具，先在棉签上用记号笔点画标记，再装入枪头盒，进行常规高温高压灭菌后备用；

2)孢子源的准备：采用马铃薯琼脂培养基作为稻曲病菌薄壁分生孢子的产孢培养基，进行稻曲病菌的产孢培养，直至形成产孢菌落，以该产孢菌落作为孢子源菌落；

3)孢子观测板的制备：取步骤1)制备的马铃薯琼脂培养基加热熔化，倒入灭菌培养皿制成普通平板，平板冷凝后用灭菌刀片将该平板切成条状平板，并将条状平板转移到灭菌载玻片上，作为分生孢子的观测板；

4)孢子的拾取与密集孢子的稀释：将步骤1)准备的灭菌棉签的端部球面，在步骤2)准备的孢子源菌落上碰触，吸附拾取孢子；然后转移到空白琼脂平板上抹涂与点印，稀释棉签上的密集孢子；在进入下一步骤操作前，将已经拾取孢子的棉签置于步骤1)准备的保湿容器内，以保护棉签吸附孢子的活性；

5)孢子的转移与释放：取步骤4)稀释孢子后的棉签，在步骤3)制备的孢子观测板面不同位置作有序连续点印，得到孢子数量相近、且孢子分散性良好的孢子印迹；

6)孢子的培养观测：将步骤5)得到载有孢子印迹的观测板置于具有保湿效果的保鲜盒内，置于工作设定的培养条件下培养，按工作要求观察与测定这些分生孢子的萌发与生长特征。

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