CN113293124B - 一种稻瘟病菌的分离方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种稻瘟病菌的分离方法。该方法采用一种专用的孢子滑散丝，直接从稻瘟病标样中将单个分生孢子分离出来，培养形成一个遗传组成单一的稻瘟病菌菌株。分离培养的实施操作步骤如下：1)稻瘟病标样的采集；2)稻瘟病菌标样的处置；3)孢子滑散丝的制备；4)孢子滑散板的制备；5)分生孢子的分散；6)切割载孢滑散板；7)分生孢子的培养与单孢子菌株的形成。本发明具有如下优点：1)分离孢子用的关键器具简单易制，分离操作简单易行；2)分离与取得单孢菌株能一次到位；3)分离工作耗工少耗时短；4)能显著提高稻瘟病菌分离的工作效率及分离结果的可靠性。

Description

一种稻瘟病菌的分离方法

技术领域

本发明涉及植物病理学技术。具体是一种稻瘟病菌的分离方法。

背景技术

稻瘟病是我国水稻生产的一种重大病害，该病害由稻瘟病菌(Magnaportheoryzae)侵染引起。开展稻瘟病菌的生物学研究是稻瘟病防控的重要基础。而开展稻瘟病菌生物学研究的前提，必需要拥有稻瘟病菌材料。一般实验室往往需要从病害标样中分离获得稻瘟病菌。

稻瘟病菌群体的遗传组成复杂，不同菌株的生物学特性及致病性往往存在较大差异。正常的研究通常需要取得遗传组成单一的稻瘟病菌材料，或者说单克隆菌株材料。本领域一般认为由单一孢子生长形成的菌株材料属遗传组成单一的病菌材料。因此稻瘟病菌的分离菌株材料一般需要获得单孢分离菌株材料。

至今已有公开多种稻瘟病菌的分离方法，主要是组织分离培养方法和分生孢子分离培养方法。

组织分离培养方法的主要技术特征是，需要将带菌组织进行表面消毒，再将消毒后的组织块转移到培养基上培养。该方法容易被腐生杂菌污染，重要的是分离获得的纯培养菌一般不属于遗传组成单一的稻瘟病菌。

分生孢子分离方法，包括悬浮液法、震落法、和直接挑取法等。

悬浮液法先将待分离标样进行保湿产孢，然后通过水介质洗涤产孢标样，将分生孢子洗涤到水液中形成孢子悬浮液，再通过微量移液枪或毛细管等器具，将孢子悬浮液分解成微滴的手段，将孢子分散和分开，然后选择分解成单个分生孢子的微滴，再进行培养。这类方法必需要实施孢子液的孢子定量及稀释操作过程，比较费事，而且很容易出现杂菌污染而影响分离工作的效率与效果。

震落法通过将已经保湿产孢的标样置于培养平板上方进行敲震处理，把分生孢子震落在培养平板上，再从中选择分散的单孢子进行培养。这类方法仍然受到标样上的杂菌孢子的干扰；而且搜寻目标单孢子存在较大的盲目性；当找到单孢子后，转移单孢子的操作也较为费事。

直接挑取法，多需要在普通显微镜上增加额外的辅助技术装置。没有辅助技术装置的直接挑取，操作难度较大，一般需要操作者具备较好的显微操作技巧。

发明内容

本发明的目的是，提供一种分离培养获得遗传组成单一的稻瘟病菌纯培养的分离方法。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

一种稻瘟病菌的分离方法，采用一种专用的孢子滑散丝，直接从稻瘟病标样中将单个分生孢子分离出来，培养形成一个遗传组成单一的稻瘟病菌菌株，分离培养的操作步骤如下：

1.稻瘟病标样的采集：在稻瘟病发病期间到田间采集稻瘟病标样，采摘干净新鲜的病斑标样带回实验室，凉干后置于4℃冷藏箱存放。

2.稻瘟病标样的处置：将步骤1存放的稻瘟病标样进行常规表面消毒与清洁，并进行常规保湿培养，直至标样病斑表面形成分生孢子。

3.孢子滑散丝的制备：取无墨水的一次性水笔笔芯在火焰上灼烧，笔芯燃火处熔化，安全熄火后，用尖头镊子夹住一点熔化的笔芯，轻轻拉长，至形成一根发丝状的细丝，冷却后剪去多余的细丝，形成一支分离稻瘟病菌分生孢子使用的孢子滑散丝，该滑散丝包括滑动丝a、丝杆b部分。

4.孢子滑散板的制备：

①琼脂平板基质的制备：按照琼脂15g、水1000ml的配比，配制含有常规营养的琼脂基质，常规高温高压灭菌后，成为琼脂平板基质备用。

②琼脂平板的倒制与平板表层净化：将操作①制备的琼脂平板基质加热充分熔化，趁热倒入培养皿制成薄层平板，并将该热液状的平板置于能继续保持热液状的保温装置内，保温静置20分钟以上，然后将该静置的液状薄层平权，平稳转移到无菌工作台面，待液状薄层平板冷凝后，成为表层净化的琼脂平板。

③孢子滑散板的切制与装片：用灭菌刀片将操作②制成的琼脂平板，切割成长条状的琼脂条块，该琼脂条块就是起分散孢子作用的滑散板；用灭菌刀片将该滑散板挑起装放到灭菌载玻片上，成为备待分散孢子用的滑散板c。

5.分生孢子的分散：将步骤3制备的孢子滑散丝进行常规表面消毒和清洁，然后手执孢子滑散丝的丝杆b，将滑动丝a的端部，在步骤2处置的标样病斑表面轻轻点触而粘附分生孢子，将粘有孢子的滑动丝a转移到步骤4准备的孢子滑散板c的一端，并贴放于滑散板面上，沿着滑散板面滑移滑动丝a，滑动丝a在滑散板面的相对滑动，导致滑动丝a上粘附的孢子脱开散落在滑散板面上。

6.切割载孢滑散板：将步骤5得到的载有分生孢子的滑散板c，置于显微镜下观察，沿着滑动丝a的滑动轨迹寻找离散的孢子，找出单一出现的孢子，选择与左右相邻孢子间隔距离远的单一孢子，用灭菌刀片将该单一孢子左右的滑散板c切断及移开，得到只载有唯一1个分生孢子的小方块。

7.分生孢子的培养与单孢子菌株的形成：用刀片将步骤6切出的载有单一分生孢子的小方块，转移到稻瘟病菌的常规培养基上，常规培养，直到孢子萌发生长形成单孢子菌落。移植单孢子菌落的菌丝扩大繁殖，形成稻瘟病菌单孢子分离菌株。

本发明的优点是：

1)分离孢子用的关键器具(孢子滑散丝)简单易制，分离操作简单易行，无需难度较大的显微操作技术训练。

2)分离与取得单克隆菌株能一次到位，无需再行专门的单孢分离程序。

3)实现分离稻瘟病菌的目标，耗工少耗时短。

4)承载分生孢子的板面经过表层净化，显微镜观察到的有效视野较均匀干净，在寻找识别稻瘟病菌分生孢子操作过程中，不容易受到非熔杂质的干扰，能显著提高分离工作的效率及分离结果的可靠性。

附图说明

图1是用一次性水笔笔芯制成的孢子滑散丝示意图。图中，滑动丝a，丝杆b。

图2是摆放在载玻片上的孢子滑散板示意图。图中，滑散板c，载玻片d。图2-1示意正面观，图2-2示意侧面观。

图3是分生孢子滑散操作示意图。图中，滑动丝a，丝杆b，滑散板c，载玻片d，滑动丝a的滑动方向e。

图4是显微镜观察到的滑散板表面图。图中，分生孢子a，杂质b。图4-1是表层净化的滑散板，图4-2是表层未净化的滑散板。图中黑色短棒长50μm。

图5是滑散丝的滑动丝粘带分生孢子后，在滑散板上滑动导致孢子散落在滑散板面上的过程。图中，分生孢子a。图5-1是滑动丝与滑散板开始接触之处，很多孢子脱离滑动丝散落在滑散板上。图5-2是在滑动轨迹中孢子逐步稀散变少。图5-3是滑动轨迹中出现离散独立的单孢子。图5-4是与左右相邻孢子距离较远的独立单一孢子。图中黑色短棒长50μm。

图6是采用本发明的方法从标样1分离获得稻瘟病菌单孢菌落的过程与结果。图6-1是标样1的稻瘟病标样。图6-2是在一个培养皿平板上摆放6块小方块，各小方块上均载有从图6-1的稻瘟病标样中分离出来的单一个分生孢子。图6-3是图6-2的分生孢子置于28℃培养2天后，在小方块面上萌发生长成一个小菌落。图6-4是图6-3的小菌落继续于28℃再培养2天后，生长成较大的菌落。图中白色短棒长5mm。

图7是采用本发明的方法从标样2分离获得稻瘟病菌单孢菌落的过程与结果。图7-1是标样2的穗颈瘟标样。图7-2是在一个培养皿平板上摆放6块小方块，各小方块上均载有从图7-1的穗颈瘟标样中分离的单一分生孢子。图7-3是图7-2的分生孢子置于28℃培养2天后，在小方块面上萌发生长成一个小菌落。图7-4是图7-3的小菌落继续于28℃再培养2天后，生长成较大的菌落。图中白色短棒长5mm。

具体实施方式

下面结合附图与实施例对本发明作进一步描述。

稻瘟病在田间的表现症状主要有叶瘟和穗瘟，在发病部位(器官组织上的病斑)均可形成稻瘟病菌的分生孢子。本发明采用巧妙的手段从稻瘟病标样上将单一个分生孢子分离出来，培养形成遗传组成单一的稻瘟病菌纯培养。具体实施方式如下。

1.稻瘟病标样的采集

发病田间有叶瘟病组织，也有穗瘟病组织，由于穗颈瘟病组织更利于采集操作及后续处理，因而通常选择典型的穗颈瘟新鲜标样，带回实验室凉干，并存放于4℃冷藏箱备用。

2.稻瘟病标样的处置

可以用75％酒精和无菌水将采集存放的穗颈瘟标样进行常规表面消毒与清洁，并置于保湿容器内进行常规保湿培养，通常在28℃环境下培养一天后，标样病斑表面就可形成稻瘟病菌分生孢子。

3.孢子滑散丝的制备

取使用后无墨水的普通一次性水笔笔芯在酒精灯火焰上灼烧，笔芯燃火处熔化，用酒精灯灭火罩等用具安全熄灭笔芯上的燃火，用尖头镊子夹住一点熔化的笔芯，轻轻拉长，至形成一根发丝状的细丝，冷却后剪去多余的细丝，保留约3cm长的细丝连在笔杆上，即形成一支分离稻瘟病菌孢子使用的孢子滑散丝，该滑散丝工具包括滑动丝a和丝杆b部分，如图1所示，这两部分天然连接成一体，关键技术作用是滑动丝a。滑动丝a细小、柔软且兼有弹性。

分离不同的标本使用时，可先用75％的酒精棉球擦拭滑动丝a作表面消毒，也可以重复前面的操作再烧制及拉伸新的滑动丝。

4.孢子滑散板的制备

按如下方法制备。

先配制琼脂平板基质：

按照琼脂15.0g、水1000.0ml的配比，配制含有常规营养的琼脂基质。稻瘟病菌的常规营养可以用马铃薯蔗糖(PS)培养基，按常规用量添加在琼脂基质中，常规高温高压灭菌后成为含有营养的琼脂平板基质。实际应用时，琼脂的使用量可依据从市面所购的琼脂质量而定，每升基质的琼脂用量可以在10.0g～15.0g变动，原则上是用量少、且冷凝后切割成小琼脂条时，小琼脂条仍具有较好的弹性为宜。

然后倒制表面净化的琼脂平板：

常规的琼脂培养基平板的琼脂含量为2.0g/升，按常规方式倒制的平板，显微镜下容易看到琼脂平板表层中的非熔杂质。发明人经过探索发现采取如下的制备技术，可以有效减少琼脂平板表层中的非熔杂质：将高温熔化倒制的平板保持热熔状态20分钟以上再冷凝。具体可以按如下操作：

用普通器具与材料组配形成一个保温装置，比如，将普通食品包装铁盒，罩盖在盛装热水的普通小钢盆上面，即获得一个有热度的铁盒面板(利用该铁盒面板放置培养皿)，再用一个塑料盆倒过来扣罩住铁盒与热水钢盆，并在塑料盆上面铺盖毛巾之类的保温材料，即能组配成一个适合本发明用的保温装置。工作时先将普通小钢盆放置在无菌工作台上，将刚烧沸的热水倒入小钢盆，再罩上铁盒，将平底培养皿放置在铁盒面板上，扣罩塑料盆把培养皿预热5分钟，然后打开扣罩塑料盆，将已加热充分熔化的琼脂平板基质，趁热倒入预热的培养皿内，形成厚度约为1.0mm的薄层平板，罩回塑料盆并铺放保温材料，保持薄层平板处于热液状保温静置20分钟以上，热液状平板表层的非熔杂质可缓慢沉降到下层中，考虑到长时间高温造成热液状平板水分的过度蒸发，以及影响琼脂的凝固性能，保温时间宜控制在30分钟内。然后打开扣罩塑料盆，将液状薄层琼脂平板平稳转移到无菌工作台面冷却，冷凝后即获得表层净化的琼脂平板。

在后续步骤中该琼脂平板用来承载稻瘟病标样的分生孢子，考虑到可能存在的细菌污染，可以在倒制平板前，按常规方式在琼脂基质中添加抗细菌药物，如链霉素等。

再将琼脂平板切割与装片形成孢子滑散板：

用灭菌手术刀片将上述制备的琼脂平板切割成狭长的琼脂条块，可以切成宽度为3mm，长度为4～5cm的长条状琼脂块，再用手术刀片将该长条状琼脂块挑转到灭菌载玻片上，长条琼脂块长向沿着载玻片长向摆放，如图2所示，将该摆放好的长条琼脂块作为滑散孢子用的滑散板c。

5.分生孢子的分散

用酒精和无菌水按常规方式将制备好的孢子滑散丝表面清洁和消毒，手执滑散丝的丝柄b，将滑动丝a在已经产孢处置的稻瘟病标样表面轻轻点触，滑动丝a表面能粘附许多分生孢子，将粘有孢子的滑动丝a转移到已备好的孢子滑散板c，并贴放于滑散板面的一端，然后拖拉滑动丝a沿着滑散板面，向滑散板c的另一端滑动，如图3所示，滑动丝a在滑散板面的接触滑动，导致滑动丝a上粘附的孢子脱落并分散在滑散板面上。

6.切割载孢滑散板

将上述操作得到的载有孢子的滑散板c，置于普通显微镜下观察，可见经过净化的滑散板c，表面杂质明显减少，如图4所示，因而能显著提高对目标真菌或杂菌孢子识别判断的准确性。

通常在滑动丝a与滑散板面首先接触之处，脱落很多分生孢子，跟随滑动丝a滑动的轨迹观察，可见脱落到滑散板面的孢子逐步稀散变少，并出现离散的单个孢子，继续沿着滑动丝轨迹寻找，能找到与左右相邻孢子间隔距离较远的独立单一孢子，如图5所示。通常一条滑散板上能滑出1～5个远距离独立的单一孢子。

当移动显微镜的载物台，确认单一出现的孢子与左右相邻孢子距离较远时，用灭菌手术刀片将该单一孢子左右的滑散板切断及移开，得到只载有独立一个分生孢子的小方块。

显微观察过程主要使用10倍物镜，必要时转换到40倍物镜观察细微特征，确认属于单一的稻瘟病菌分生孢子。切割操作可以离开显微镜目镜，直接肉眼观察操作，无需显微操作。操作要领是：将显微镜台下的聚光光阑调小，并上下调节聚光模块，至肉眼可见光源聚集成一个小光点穿过载玻片上的滑散板，该小光点直径约2mm，普通显微镜10倍物镜视野所覆盖实物的直径也是大约2mm，参比这两个参数来判断切割孢子滑散板时的下刀位置，而且10倍物镜的镜头与观察物之间通常有1cm的距离，适合用尖头刀片(如23号手术刀片)的切割操作。切割后，可以返回显微镜目镜观察检查切割结果，包括下刀切割位置是否恰当，切割前后滑散板上的孢子存在状况。

7.分生孢子的培养与单孢子菌株的形成

用手术刀片将切出的载有单一分生孢子的小方块，转移到稻瘟病菌的常规平板(如马铃薯蔗糖琼脂PSA)培养基上常规培养。考虑到可能出现细菌污染，培养基平板倒制时，可按常规添加抗细菌药物(如链霉素等)。分生孢子在小方块上正常萌发和生长，一般在28℃条件下培养2天后形成肉眼可见的小菌落，继续培养，菌落扩大到小方块下面的培养基平板上，并能形成较大的菌落，可以从这较大的菌落上移植菌丝进行扩大繁殖。从单一菌落移植菌丝扩大繁殖，就获得稻瘟病菌单孢子分离菌株。

实施例1

采用本发明一种稻瘟病菌的分离方法，分离稻瘟病标样1的稻瘟病菌，分离培养结果如图6所示。

实施例2

采用本发明一种稻瘟病菌的分离方法，分离稻瘟病标样2的稻瘟病菌，分离培养结果如图7所示。

Claims (1)

1.一种稻瘟病菌（ Magnaporthe Oryzae ） 的分离方法，其特征是，采用一种专用的孢子滑散丝，直接从稻瘟病标样中将单个分生孢子分离出来，培养形成一个遗传组成单一的稻瘟病菌菌株，分离培养的操作步骤如下：

1)稻瘟病标样的采集：在稻瘟病发病期间到田间采集稻瘟病标样，采摘干净新鲜的病斑标样带回实验室，凉干后置于4℃冷藏箱存放；

2)稻瘟病标样的处置：将步骤1)存放的稻瘟病标样进行常规表面消毒与清洁，并进行常规保湿培养，直至标样病斑表面形成分生孢子；

3)孢子滑散丝的制备：取无墨水的一次性水笔笔芯在火焰上灼烧，笔芯燃火处熔化，安全熄火后，用尖头镊子夹住一点熔化的笔芯，轻轻拉长，至形成一根发丝状的细丝，冷却后剪去多余的细丝，形成一支分离稻瘟病菌分生孢子使用的孢子滑散丝，该滑散丝包括滑动丝(a)、丝杆(b)部分；

4)孢子滑散板的制备：

①琼脂平板基质的制备：按照琼脂15g、水1000ml的配比，配制含有常规营养的琼脂基质，常规高温高压灭菌后，成为琼脂平板基质备用；

②琼脂平板的倒制与平板表层净化：将操作①制备的琼脂平板基质加热充分熔化，趁热倒入培养皿制成薄层平板，并将该热液状的平板置于能继续保持热液状的保温装置内，保温静置20分钟以上，然后将该静置的液状薄层平板，平稳转移到无菌工作台面，待液状薄层平板冷凝后，成为表层净化的琼脂平板；

③孢子滑散板的切制与装片：用灭菌刀片将操作②制成的琼脂平板，切割成长条状的琼脂条块，该琼脂条块就是起分散孢子作用的滑散板；用灭菌刀片将该滑散板挑起装放到灭菌载玻片上，成为备待分散孢子用的滑散板(c)；

5)分生孢子的分散：将步骤3)制备的孢子滑散丝进行常规表面消毒和清洁，然后手执孢子滑散丝的丝杆(b)，将滑动丝(a)的端部，在步骤2)处置的标样病斑表面轻轻点触而粘附分生孢子，将粘有孢子的滑动丝(a)转移到步骤4)准备的孢子滑散板(c)的一端，并贴放于滑散板面上，沿着滑散板面滑移滑动丝(a)，滑动丝(a)在滑散板面的相对滑动，导致滑动丝(a)上粘附的孢子脱开散落在滑散板面上；

6)切割载孢滑散板：将步骤5)得到的载有分生孢子的滑散板(c)，置于显微镜下观察，沿着滑动丝(a)的滑动轨迹寻找离散的孢子，找出单一出现的孢子，选择与左右相邻孢子间隔距离远的单一孢子，用灭菌刀片将该单一孢子左右的滑散板(c)切断及移开，得到只载有唯一1个分生孢子的小方块；

7)分生孢子的培养与单孢子菌株的形成：用刀片将步骤6)切出的载有单一分生孢子的小方块，转移到稻瘟病菌的常规培养基上，常规培养，直到孢子萌发生长形成单孢子菌落；移植单孢子菌落的菌丝扩大繁殖，形成稻瘟病菌单孢子分离菌株。

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