CN104073443A - 一种烟草织孢霉菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种烟草织孢霉菌及其应用。所述烟草织孢霉菌分类命名为烟草织孢霉菌（Plectosporium tabacinum），株号为XJ-14，已于2013年5月26日保藏于位于中国武汉市珞珈山武汉大学的中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏编号为：CCTCC NO：M2013232。所述应用是烟草织孢霉菌在降解增塑剂中的应用，包括：将烟草织孢霉菌的菌悬液或孢子悬液投加到被增塑剂污染的土壤或水体中。本发明的烟草织孢霉菌能用于降解邻苯二甲酸二辛酯，能在以邻苯二甲酸二辛酯为唯一碳源和能源的培养基中生长。

Description

一种烟草织孢霉菌及其应用

技术领域

本发明属于微生物种质资源领域，具体涉及一种烟草织孢霉菌及其应用。 

背景技术

塑料在人类生活的许多领域得到广泛应用。在塑料生产过程中，需要在其骨架结构如聚乙烯或聚氯乙烯中添加大量的增塑剂，以增加其弹性和柔韧性，扩大塑料产品的应用范围。 

其中邻苯二甲酸二辛酯(DOP，dioctyl phthalate)是最常用的增塑剂之一，DOP具有良好的综合性能，混合性能好，增塑效率高，挥发性较低，低温柔软性较好，耐热性和耐候性良好，与绝大多数工业上使用的合成树脂和橡胶均有良好的相容性，是目前工业上使用最为广泛的通用型增塑剂。在实际生产中，DOP主要用于聚氯乙烯脂的加工，还可用于环氧树脂、醋酸树脂、ABS树脂及橡胶等高聚物的加工，也可用于造漆、染料、分散剂等，DOP增塑的聚氯乙烯可用于制造人造革、农用薄膜、包装材料、电缆等。 

塑料虽然给生活生产带来了极大的便利，但随着塑料的大量使用，产生了大量的废物塑料。由于塑料的难降解特性，废塑料残体大量存在于环境中，带来越来越严重的环境污染问题。其中的增塑剂如DOP，是通过范德华力结合到塑料骨架成分中，结合力弱，容易通过淋溶、挥发、沉降等过程进入自然环境，在土壤、水体和大气等环境介质中迁移、转化，并在土壤、水体沉积物中累积。邻苯二甲酸酯类成分是环境激素类物质，具有生殖、发育毒性，对动物具有致癌、致突变、致畸和生殖毒性等作用。美国国家环保局(US EPA)已将邻苯二甲酸二辛基酯(DOP)列为优先控制有毒污染物，我国将DOP列为优先监测污染物。土壤中的DOP可通过生物富集，经由消化系统进入人体，具有慢性毒性、引起雌激素效应以及肥胖症，甚至致癌。因此，对环境中的DOP进行有效处理，是减少和防 止DOP污染的重要手段。 

微生物是自然环境中的分解者，许多微生物对有机物具有降解作用。利用微生物降解处理环境污染物，处理条件温和，没有二次污染，成本低廉，越来越受到重视。 

真菌是自然环境中重要的微生物，在其生长过程中可以分泌大量非特异性胞外酶，将其细胞周围的有机物降解成为可以被真菌细胞吸收的物质，为自身的生长提供营养。利用这个特点，人们可以筛选对特定有机物具有降解作用的真菌。 

目前织孢霉菌属真菌包括4个种，研究人员对这4个种的形态特征有详细描述，但对这类真菌在生物降地膜增塑剂邻苯二甲酸二辛酯降解作用未见报道。 

发明内容

本发明提供了一种烟草织孢霉菌，该烟草织孢霉菌对邻苯二甲酸二辛酯具有较强的降解作用。 

一种烟草织孢霉菌，分类命名为烟草织孢霉菌(Plectosporium tabacinum)，株号为XJ-14，已于2013年5月26日保藏于位于中国武汉市珞珈山武汉大学的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为：CCTCC NO：M2013232。 

本发明的烟草织孢霉菌分离自在麦田中使用过的破旧地膜，其ITS序列如SEQ ID No.1所示，主要生物学特征为：在PDA平板上22℃黑暗培养14天，菌落直径5.2-7.8cm，菌落白色至浅红色，气生菌丝发达，1.4-2.7μm宽，菌落表面的菌丝顶端常凝结有许多细小的水滴，菌落边缘有放射状的洼陷；分生孢子梗单生，无色，分支或不分支，在分生孢子梗的顶端或侧面产生1-多个瓶梗状产孢细胞，(2.3-)5.5-28.8(-31.5)×(1.4-)1.8-3.1(-3.6)μm，瓶梗顶端1.1-1.8μm，产孢后往往留下围领型的圆柱状产孢痕，深度1.4-2.3μm；许多分生孢子在瓶梗顶端聚集，并附着一滴水珠，形成圆球形孢子球；分生孢子无色，两边对称，无隔膜或有1个隔膜，有时分生孢子的侧面略弯曲，使分生孢子的两端明显不同，一端较钝，一端较尖锐，(4-)4.5-9.6(-10.9)×(1.8)-2.3-2.7μm。 

该菌与镰刀菌的主要区别是产孢后瓶梗上明显的围领型的圆柱状产孢痕，部分分生孢子的两端一端较钝，一端较尖锐，菌落生长速度明显比镰刀菌慢，菌落表面有明显塌陷，表面不平整。 

本发明的烟草织孢霉菌还能以邻苯二甲酸二辛酯为唯一碳源和能源生长。基于该生长特性，本发明提供了一种所述烟草织孢霉菌的生长培养基，包括碳源，所述碳源即为邻苯二甲酸二辛酯。 

作为优选，所述邻苯二甲酸二辛酯的浓度为0.2～0.4％，更优选为0.2％。作为进一步优选，所述生长培养基的配方为：K₂HPO₄·3H₂O 9g、KH₂PO₄ 3g、MgSO₄·7H₂O 0.1g、(NH₄)₂SO₄ 1g、琼脂15g、邻苯二甲酸二丁辛酯2g、水1000mL。 

基于该菌的生长特性，本发明还提供了所述烟草织孢霉菌在降解增塑剂中的应用，包括：将烟草织孢霉菌的菌悬液或孢子悬液投加到被增塑剂污染的土壤或水体中。作为微型，所述增塑剂为邻苯二甲酸二辛酯。 

本发明还提供了含有所述烟草织孢霉菌的菌剂。该菌剂可以采用烟草织孢霉菌的菌丝或孢子制成，优选为采用孢子制成，菌剂中烟草织孢霉菌孢子的浓度为1.0×10⁶～10⁸个/mL。 

当需要对邻苯二甲酸二辛酯进行降解处理时，将该菌剂直接投加或经适当倍数稀释后投加到被污染土壤或水体中即可。与现有技术相比，本发明的有益效果为： 

本发明的烟草织孢霉菌能用于降解邻苯二甲酸二辛酯，该烟草织孢霉菌能在以邻苯二甲酸二辛酯为唯一碳源和能源的培养基中生长。 

附图说明

图1A为XJ-14菌株的瓶梗状分生孢子梗形态图； 

图1B为XJ-14菌株着生分生孢子的瓶梗状分生孢子梗形态图； 

图1C为分生孢子梗发生处的菌丝形态图； 

图1D为两端不相同的分生孢子形态图；分生孢子的一端较钝，一端较尖锐； 

图1E为XJ-14菌株的分生孢子形态图； 

图1F为XJ-14菌株的另一分生孢子形态图； 

图1A～1F中，标尺＝10μm； 

图2A为XJ-14菌株在PDA培养基上22℃培养7天的菌落形态图(正面)； 

图2B为XJ-14菌株在PDA培养基上22℃培养7天的菌落形态图(反面)； 

图3A为XJ-14菌株在含DOP的基本培养基上生长14天的菌落形态图； 

图3B为XJ-14菌株在不含DOP的基本培养基上生长14天的菌落形态图。 

具体实施方式

实施例1菌株分离 

1、培养基配制 

(1)马铃薯葡萄糖琼脂培养基(potato dextrose agar,PDA)：在马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂20g中加蒸馏水定容至1000mL；然后进行常规的高温灭菌(1.1个大气压，121℃下灭菌20min)。 

(2)2％水琼脂(WA)培养基：琼脂粉20g、水1000mL，进行常规的高温灭菌(1.1个大气压，121℃下灭菌20min)。 

(3)基本培养基：K₂HPO₄·3H₂O 9g、KH₂PO₄ 3g、MgSO₄·7H₂O0.1g、(NH₄)₂SO₄ 1g、琼脂15g、水1000mL，进行常规的高温灭菌(1.1个大气压，121℃下灭菌20min)。 

2、菌株分离 

XJ-14菌株是从我国新疆维吾尔自治区昌吉回族自治州昌吉市(东经80°12'13.68”,北纬120°7'11.28”)小麦田中的地膜上分离得到的，其分离步骤为： 

(1)采集麦田中上个生长季使用过的地膜，在实验室用自来水漂洗干净，无菌水漂洗3次； 

(2)处理后的地膜用无菌刀片切成3×3cm²的小块，置于含50μg·ml^-1氨苄青霉素和50μg·ml^-链霉素的2％水琼脂(WA)平皿上，25℃暗培养3天后，在解剖镜下检查，用挑针将在地膜上长出的菌丝移接到直径为 6cm的PDA培养基平板上培养7天； 

(3)将5ml无菌水加到长好菌落的直径为6cm的平板上，洗下孢子，转移到1.5毫升离心管中，取100μL孢子液滴在血球计数板上，显微镜下计数； 

(4)取100μL孢子液加到一个新的1.5mL离心管中，根据计数结果，加适量无菌水配成浓度为2000个孢子/mL的孢子液；将100mL的2％水琼脂(WA)培养基融化后，室温冷却至50℃，再加入氯霉素储备液和链霉素储备液各100μL，混匀后倒平板；取50μL调好浓度的孢子液均匀涂布在已经倒好的含氯霉素和链霉素水琼脂平板上，培养2天； 

(5)在倒置显微镜下，找到单个孢子萌发形成的小菌落，用挑针转移到新的PDA平板上，25℃培养5天，得到单孢分离的纯培养物； 

(6)通过上述方法分离得到了230株真菌纯培养物，将分离得到的真菌纯培养物接种在含有0.2％的DOP的基本培养基上培养7天，发现菌株XJ-14生长出菌丝。将菌株XJ-14保存在PDA培养基上。 

3、菌株鉴定 

(1)形态鉴定 

XJ-14经过单孢分离纯化后，接种到PDA培养基上，22℃培养14天。用挑针挑取少量菌体，制成玻片，在显微镜下观察，测量，拍照。分生孢子和分生孢子梗形态如图1所示，菌落生长状态如图2所示。 

由图1和图2可见，XJ-14在PDA平板上22℃黑暗培养14天，菌落直径5.2-7.8cm，菌落白色至浅红色，气生菌丝发达，1.4-2.7μm宽，菌落表面的菌丝顶端常凝结有许多细小的水滴，菌落边缘有放射状的洼陷；分生孢子梗单生，无色，分支或不分支，在分生孢子梗的顶端或侧面产生1-多个瓶梗状产孢细胞，(2.3-)5.5-28.8(-31.5)×(1.4-)1.8-3.1(-3.6)μm，瓶梗顶端1.1-1.8μm，产孢后往往留下围领型的圆柱状产孢痕，深度1.4-2.3μm；许多分生孢子在瓶梗顶端聚集，并附着一滴水珠，形成圆球形孢子球；分生孢子无色，两边对称，无隔膜或有1个隔膜，有时分生孢子的侧面略弯曲，使分生孢子的两端明显不同，一端较钝，一端较尖锐，(4-)4.5-9.6(-10.9)×(1.8)-2.3-2.7μm。 

(2)分子鉴定 

(2.1)DNA提取 

1)XJ-14菌株在PDA平板上生长14天后，用牙签刮取平板上的菌丝，放入已灭菌的含有300μL提取缓冲液1.5mL离心管中； 

2)用电磨机将挑取的菌丝磨碎，然后再加入300μL提取缓冲液，剧烈震荡2min； 

3)10000rpm离心10min； 

4)吸取上清至另一离心管中，弃沉淀； 

5)加入等体积的异丙醇(分析纯)，沉淀核酸，轻轻颠倒混匀数次后，12000rpm离心10min； 

6)轻轻倒去上清液，在吸水纸上排干水分； 

7)加入300μL 70％乙醇，轻轻颠倒混匀数次后，12000rpm离心2min； 

8)轻轻倒去上清液，在吸水纸上排干水分，置于37℃下15min，使乙醇充分挥发； 

9)用50μL ddH2O重悬沉淀，得到XJ-14基因组DNA，浓度达到30ng/μL。 

(2.2)真菌ITS rDNA基因的PCR扩增 

采用50μL反应体系进行PCR扩增，体系中含有：上下游引物各2μM，dNTPs 200μM，Mg²⁺ 1.5mM，10×PCR buffer 5μL，模版DNA 2μL，Taq酶2U。 

上游引物ITS1序列为5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′， 

下游引物ITS4序列为5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。 

PCR扩增反应在朗基MG96G型PCR仪上进行。反应条件：94℃预变性2min，然后35个循环包括：94℃变性30sec，55℃退火40sec，72℃延伸1min。最后72℃后延伸10min。 

(2.3)PCR产物的回收纯化 

PCR反应结束后，PCR产物经1％的琼脂糖凝胶电泳检测后，采用爱思进生物技术公司的DNA凝胶纯化试剂盒，按照试剂盒说明书的步骤进行。步骤如下： 

1)电泳结束后，在紫外灯下用刀片切取含目的DNA片段的凝胶，置于2mL离心管中，称重； 

2)加入3倍体积的DE-A缓冲液，75℃保温10min，期间振荡数次，至完全融化； 

3)加入0.5个倍体积的DE-B缓冲液，混合均匀； 

4)将DNA制备管放入2mL离心管中，将混合液转移到DNA制备管中，12000rpm离心1min，弃上清； 

5)将DNA制备管放回2mL离心管中，加500μL缓冲液W1,12000rpm离心30s； 

6)将DNA制备管放回2mL离心管中，加700μL缓冲液W2,12000rpm离心30s； 

7)重复步骤6)一次； 

8)将DNA制备管放回2mL离心管中，12000rpm离心2min。以排干膜上洗涤液； 

9)将DNA制备管放回2mL离心管中，加50μL的ddH₂O，10000rpm离心1min，洗脱DNA置-20℃下保存。 

(2.4)基因的测序和序列分析 

将纯化回收的目的DNA片段经电泳检测后送至上海生工用ABIPRISMA377型自动测序仪进行测序。测序结果经过严格核对后，得到如SEQ ID No.1所示的长度为499bp的DNA片段序列。 

将测得的核苷酸序列用BLAST在GenBank中查找和比对同源或相似的核苷酸序列。根据同源序列的数据库注释，再结合菌株的形态结构来判断所研究菌株的种属。经过BLAST比对，该序列与登录号为KC845227和KC845226的序列覆盖率100％，相似度达到99％。这两个序列都是来自烟草织孢霉菌Plectosporium tabacinum的ITS rDNA。这些结果表明分子鉴定与形态鉴定结果相符。XJ-14菌株为烟草织孢霉菌菌株，对该菌株进行了如下保藏：保藏名称为：烟草织孢霉菌Plectosporium tabacinum，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学；保藏日期：2013年5月26，保藏号：CCTCC No：M 2013232。 

实施例2XJ-14对DOP的降解利用 

在实施例1的基本培养基中加入终浓度0.2％的邻苯二甲酸二丁辛酯， 获得本实施例的生长培养基。 

将菌株XJ-14在PDA培养基上培养7天，从菌落边缘挑取约3×3的cm²的菌块，置于含有DOP的生长培养基的直径9cm的平板中央，以不加DOP的基本培养基为对照，置于25℃培养14天，观察生长情况，观察结果如图3所示。 

由图3可见，菌株XJ-14在含DOP的生长培养基上明显生长，而对照则没有生长，表明XJ-14可以利用DOP作为唯一碳源和能源，将DOP分解以提供碳素营养，供自身菌丝生长应用。 

Claims (8)

1.一种烟草织孢霉菌，其特征在于，命名为烟草织孢霉菌（Plectosporium tabacinum）XJ-14，保藏编号为：CCTCC NO：M2013232。

2.一种含有如权利要求1所述烟草织孢霉菌的菌剂。

3.如权利要求2所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂采用烟草织孢霉菌的孢子制成。

4.如权利要求3所述的菌剂，其特征在于，菌剂中烟草织孢霉菌孢子的浓度为1.0×10⁶～10⁸个/mL。

5.如权利要求2所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂采用烟草织孢霉菌的菌丝制成。

6.如权利要求1所述烟草织孢霉菌在降解增塑剂中的应用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，包括：将烟草织孢霉菌的菌悬液或孢子悬液投加到被增塑剂污染的土壤或水体中。

8.如权利要求6或7所述的应用，其特征在于，所述增塑剂为邻苯二甲酸二辛酯。