CN114317380A - 分离自冶炼厂土壤的乳酸乳球菌lxy-2及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一株分离自铅锌冶炼厂土壤的乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)LXY‑2及其在含邻苯二甲酸二辛酯废水处理中的应用。本发明公开了乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)LXY‑2，其保藏编号：CGMCC No.22159。乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)LXY‑2用途为：处理含邻苯二甲酸二辛酯废水。

Description

分离自冶炼厂土壤的乳酸乳球菌LXY-2及其应用

技术领域

本发明涉及一株分离自铅锌冶炼厂土壤的乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)LXY-2及其在含邻苯二甲酸二辛酯废水处理中的应用。

背景技术

邻苯二甲酸二辛酯是邻苯二甲酸酯类化合物中最重要的品种，具有增塑作用，被广泛应用于玩具、食品包装材料、应用血袋和胶管、乙烯地板和壁纸，清洁剂，润滑油，个人护理用品如指甲油，头发喷雾剂，香皂和洗发液等数百种产品中。邻苯二甲酸二辛酯经口、呼吸道、静脉输液、皮肤吸收等途径摄入，将对人体多个系统产生危害，所引起的系列环境健康危害，已受到环境科学，公共卫生领域，媒体甚至普通大众的广泛关注。研究表明，邻苯二甲酸二辛酯在人体和动物体内发挥着类似雌性激素的作用，可以干扰内分泌，干扰正常生精过程，引起染色体丢失或断裂，导致男子精液量和精子数量减少，精子的运动能力低下，精子形态异常等，严重的会导致睾丸癌及肝癌，美国环境署已将其列入急毒性、致畸、致突物质。随着塑料制品、个人护理用品的需求日益增大，邻苯二甲酸二辛酯的需求液越来越大，但在邻苯二甲酸二辛酯生产中会产生大量含邻苯二甲酸二辛酯的高COD有害的废水，其ρ(COD)高达30000-45000mg/L。因此必须对含邻苯二甲酸二辛酯废水进行有效处理，达标后再排放。

邻苯二甲酸二辛酯废水往往具有有机物含量高、水质复杂，可生化性差等特点，导致处理难度大。目前对邻苯二甲酸二辛酯废水常用的处理方法为芬顿法、电化学法、催化氧化法、焚烧法等，其处理原理往往是通过强氧化反应直接将有机物转化为CO₂、H₂O等无机物，存在操作条件苛刻，运行成本偏高等问题，影响到其的广泛应用和推广，因此需寻找经济高效的替代处理技术，国外研究发现微生物技术不但处理效果较好，而且成本也较低，无二次污染，因而微生物技术受到广泛关注，而相关技术研究我国较少。

目前已知的乳酸乳球菌(及其相近属)用途多为食品发酵与肠道菌群调节的有益微生物，表现出较强的食品风味改善与有害微生物抑制作用，具体如下：

1、苏振博，许云贺，张莉力，乳酸乳球菌LLY003的安全性评价，食品工业科技，2017，38(19)：105-108，113；

2、唐春梅，陈俊亮，任广跃，一株乳酸乳球菌所产细菌素的生物学特性，食品科学，2013，34(1)：248-251；

3、付良，刘飞，霍贵成，乳酸乳球菌抗氧化的研究进展，东北农业大学学报，2009,40(6)：132-136；

4、CN202011337808.0的发明《一株乳酸乳球菌及其应用》告知了：乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)KUST48，保藏编号为GDMCC No：20699。KUST48菌株能显著抑制无乳链球菌在斑马鱼肠道内的繁殖，降低无乳链球菌感染后斑马鱼的死亡率。

至于乳酸乳球菌在对污染物的代谢方面的研究国内外均未见报道。

发明内容

本发明要解决的问题是提供能够用于含邻苯二甲酸二辛酯废水处理的菌株--乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)LXY-2及其用途。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)LXY-2，其保藏编号：CGMCC No.22159。

该菌株16S rDNA基因序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还同时提供了上述乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)LXY-2用途：处理含邻苯二甲酸二辛酯废水。即，去除含邻苯二甲酸二辛酯废水中的邻苯二甲酸二辛酯。

本发明的乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)LXY-2分离自铅锌冶炼厂土壤，保藏信息如下：

保藏名称：乳酸乳球菌Lactococcus lactis，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号：CGMCCNo.22159，保藏时间2021年4月9日。

该菌株的菌落特征如下：为杆菌纲，乳杆菌目，链球菌科，卵圆形，表面粗糙，不产胞子，不产荚膜，分裂方式为二分裂(单体细胞横向分裂形成两个子代细胞)，革兰氏阳性，菌体大小约为长(0.4～0.6)μm、宽(0.3～0.4)μm。在固体培养基上，菌落呈圆形，表面凸起、光滑，边缘完整，呈柠白色，不透明。

本发明菌株由采集的湖南省株洲市某铅锌冶炼厂土壤中筛选获得，根据SherlockMIS软件系统对菌株LYX-2定性和定量的分析生成的脂肪酸图谱，对比Library数据库，初步鉴定菌LYX-2为乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)，相似指数SI(similarity index)为0.96；用16S rDNA测序鉴定方法也证明该菌株为乳酸乳球菌。

本发明还涉及所述的乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)LYX-2在含邻苯二甲酸二辛酯废水处理中的应用。具体的，所述菌株用于去除含邻苯二甲酸二辛酯废水中的邻苯二甲酸二辛酯。将本发明菌株接种至含邻苯二甲酸二辛酯废水中，在15～35℃、150～200r·min^-1的好氧条件下进行培养0.5～2d，可有效去除废水中的邻苯二甲酸二辛酯。

本发明所述的含邻苯二甲酸二辛酯废水，是指主要含邻苯二甲酸二辛酯的废水，废水中邻苯二甲酸二辛酯浓度为20～40000mg·L^-1。

该菌株能用于含邻苯二甲酸二辛酯废水处理，在好氧条件下、pH7.0、温度(25～30)℃、OD_415nm0.2、邻苯二甲酸二辛酯浓度20000mg·L^-1(COD_cr为36000mg·L^-1)转速180r·min^-1的条件下，培养2天，过滤，邻苯二甲酸二辛酯的去除率分别为99.98％，邻苯二甲酸二辛酯浓度降低至4.0mg·L^-1，COD_cr降低至223mg·L^-1，可达到国家污水综合排放标准(GB8978-1996)进入城市污水管网的三级标准(COD_cr为500mg·L^-1)。

乳酸乳球菌在对污染物的代谢方面的研究国内外均未见报道，有关乳酸乳球菌(及其相近属)可降解邻苯二甲酸二辛酯废水的研究尚属空白，本发明涉及一株分离自铅锌冶炼厂土壤的乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)LYX-2及其在含邻苯二甲酸二辛酯废水处理中的应用，属于首次发现。

综上所述，本发明经筛选获得了一株用于含邻苯二甲酸二辛酯废水处理的乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)LYX-2，其具有高效处理含邻苯二甲酸二辛酯废水的潜力，为控制含邻苯二甲酸二辛酯废水排放对环境的影响提供了技术基础，应用前景广阔。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)LYX-2(放大30000倍)；

图2为16S rDNA PCR扩增结果(LYX-2：菌株LYX-2；Marker：DNA标准分子量)；

图3为基于16S rDNA序列的菌株系统发育树。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

培养基使用前需要进行常规的高温灭菌，一般为在1.1个大气压，121℃下灭菌20min，此为常识。

实施例1、降解菌株的筛选与鉴定

1材料与方法

1.1培养基和试剂

富集培养基：邻苯二甲酸二辛酯(5、10、20、30或40g)(逐步提高加入进行驯化富集)，CaCl₂·6H₂O 0.1g，MgCl₂ 0.25g，K₂HPO₄ 1.5g，NH₄Cl 1g，蛋白胨9g，H₂O 1000mL，pH＝6.5～7.5；

基础培养基：NH₄NO₃1.00g，MgSO₄.7H₂O 0.5g，(NH₄)₂SO₄ 0.5g，KH₂PO₄ 0.5g，NaCl0.5g，K₂HPO₄ 1.5g，H₂O 1000mL，pH4.0；

基础培养基加入1.5％(w/v，每100mL加1.5g)琼脂和40g.L^-1的邻苯二甲酸二辛酯，即配成相应的固体基础培养基；

pH7.0、邻苯二甲酸二辛酯浓度20000mg·L^-1(COD_cr为36000mg·L^-1)的含邻苯二甲酸二辛酯废水。

1.2菌株对含邻苯二甲酸二辛酯废水处理效能的测定

将纯化后的单个菌株以菌量OD_415nm＝0.2接种到100mL含邻苯二甲酸二辛酯的废水(pH7.0、邻苯二甲酸二辛酯浓度20000mg·L^-1，COD_cr为36000mg·L^-1)250mL三角瓶中，以不接菌的培养液作对照，在30℃、180r·min^-1的恒温摇床上振荡好氧培养2天。培养结束后，用0.20μm膜过滤，除去菌丝体，滤液用于相应邻苯二甲酸二辛酯和COD_cr的测定，邻苯二甲酸二辛酯的含量用气相色谱测定，COD_cr值采用COD仪测定。

去除率(％)＝(对照样品残留量-处理样品残留量)×100/对照样品残留量

1.3优势降解菌株选育

1.3.1菌株来源

采集湖南省株洲市某铅锌冶炼厂土壤。

1.3.2降解菌株的分离、纯化和筛选

从每份铅锌冶炼厂土壤中取10g，在无菌的条件下，分别加到装有100mL无菌液体富集培养基的250mL三角瓶中.在30℃下180r·min^-1摇床上培养7天后，按10％(体积％)接种量转移到下一批富集培养基上(邻苯二甲酸二辛酯梯度依次为5、10、20、30或40g·L^-1)，同条件驯化培养7天。然后再按10％接种量转接到含80g·L^-1邻苯二甲酸二辛酯的无菌液体基础培养基中，继续培养7天，连续转接2次后从邻苯二甲酸二辛酯浓度为80g·L^-1基础培养基中，取0.1mL基础培养基发酵液反复进行固体基础培养基平板划线分离、纯化，直到筛选得到单个菌落，将纯菌落接种到斜面上，于4℃冰箱内保存。

1.3.3菌株鉴定

菌株鉴定采用美国MIDI公司的Sherlock microbial identity system(MIS)软件系统，该系统将基础培养基上纯化的单菌落按照MIDI公司的操作规范进行脂肪酸的提取和分析，定性(种类)和定量(含量)地分析微生物的脂肪酸成份并生成脂肪酸图谱，将生成的图谱和数据库(Library)进行比对，根据相似指数SI(similarity index)鉴定未知菌种，相似指数SI大于0.9就基本可确定是某种微生物。该系统是一相对快速和具有丰富菌库的微生物鉴定系统，已得到较广泛的应用(吴愉萍，徐建明，汪海珍等.SherlockMIS系统应用于土壤细菌鉴定的研究.土壤学报，2006，43(4):642-647)。

此外，同时用16S rDNA鉴定方法进行验证，与Sherlock microbial identitysystem(MIS)进行比较。以LYX-2菌株总DNA为模板，用16S rDNA基因的通用引物进行PCR扩增，得到的扩增片段经回收、测序可明确其大小，再将测序结果用BLAST软件与GenBank中的序列进行同源性比较。

1.3.4菌株形态特征观察及生理生化特性测定

将菌株接种在固体培养基中，48h后电镜观察菌株形态特征；取纯化的菌株生长的对数期进行革兰氏、结晶紫简单荚膜等染色；生理生化特性测定参照《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠，蔡妙英)。

2.结果

2.1菌株的分离与筛选

经分离、纯化、筛选获得1株能有效处理含邻苯二甲酸二辛酯废水的细菌，命名为LYX-2，而筛选过程中获得的其它菌株降解力都不同程度地衰退，好氧培养2天，发现它对邻苯二甲酸二辛酯的去除率分别为99.98％。

2.2菌株的鉴定

2.2.1菌株基本形态及生理生化特征

该菌为杆菌纲，乳杆菌目，链球菌科，卵圆形，表面粗糙，不产胞子，不产荚膜，分裂方式为二分裂(单体细胞横向分裂形成两个子代细胞)，革兰氏阳性，菌体大小约为长(0.4～0.6)μm、宽(0.3～0.4)μm(如图1)，在固体培养基上，菌落圆形，表面凸起、光滑，边缘完整，呈白色，不透明。革兰氏染色阳性，乙酰甲基甲醇生成试验(v-p)反应阴性，吲哚实验阴性，不能液化明胶，其他生理生化特性见表1。

表1、乳酸乳球菌的生理生化特性

注：+阳性反应；-阴性反应

2.2.2菌株鉴定

(1)Sherlock MIS系统对菌株的鉴定

根据Sherlock MIS软件系统对菌株脂肪酸定性和定量的分析生成的脂肪酸图谱，对比Library数据库，初步鉴定菌株为乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)，相似指数SI(similarity index)为0.96。

(2)16S rDNA鉴定方法对菌株的验证

I.DNA提取结果

以菌株总DNA为模板，用16S rDNA基因的通用因为进行PCR扩增，得到1条约为1kb的片段(图2)。扩增片段经回收、测序明确其大小为1438bp(SEQ ID NO.1)。

II.16S rDNA基因PCR扩增和序列分析

将测序结果用BLAST软件与GenBank中的序列进行同源性比较发现，菌株LYX-2与乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)具有较高的同源性，同源性接近95％，遗传距离较近。

综合菌株的生理生化性质、Sherlock MIS(MIDI鉴定系统)及16S rDNA系统进化分析可以看出，该菌属于乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)。

菌株LYX-2，保藏名称：乳酸乳球菌Lactococcus lactis，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号：CGMCC No.22159，保藏时间2021年4月9日。

3结论

1)从湖南株洲市某铅锌冶炼厂土壤中分离得到1株能够用于含邻苯二甲酸二辛酯废水处理的高效菌株(CGMCC No.22159)，经Sherlock MIS系统和16S rDNA鉴定为乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)。

实施例2、菌株对含邻苯二甲酸二辛酯废水处理性能检测

1材料与方法

1.1培养基和试剂

基础培养基：NH₄NO₃1.00g，MgSO₄.7H₂O 0.5g，(NH₄)₂SO₄ 0.5g，KH₂PO₄ 0.5g，NaCl0.5g，K₂HPO₄ 1.5g，H₂O1000mL，pH4.0；

邻苯二甲酸二辛酯生产过程产生的pH7.0、邻苯二甲酸二辛酯浓度20000mg·L^-1、COD_cr为36000mg·L^-1的含邻苯二甲酸二辛酯废水。

1.2菌株对对含邻苯二甲酸二辛酯废水处理性能

将纯化后的单个菌株--乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)LYX-2以菌量OD_415nm＝0.2接种到100mL邻苯二甲酸二辛酯废水(pH7.0、邻苯二甲酸二辛酯浓度20000mg·L^-1、COD_cr为36000mg·L^-1的含邻苯二甲酸二辛酯废水)250mL三角瓶中，以不接菌的邻苯二甲酸二辛酯废水作对照，在30℃,180r·min^-1的恒温摇床上振荡好氧培养2天。培养结束后，按照实施例1所述方法测定菌株对邻苯二甲酸二辛酯和CODcr的去除率。

2.结果

菌株在pH7.0、OD_415nm0.2、转速180r·min^-1及好氧环境条件下，对邻苯二甲酸二辛酯的去除率为99.98％，处理后废水中邻苯二甲酸二辛酯浓度为4.0mg·L^-1，COD_cr为223mg·L^-1，可达到国家污水综合排放标准(GB8978-1996)进入城市污水管网的三级标准(COD_cr为500mg·L^-1)，表明本研究分离、筛选的乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)LYX-2是一株可有效处理含邻苯二甲酸二辛酯废水的高效菌株，对控制含邻苯二甲酸二辛酯废水对环境的影响具有一定的应用潜力。

对比实验、将筛选过程中获得的其余菌株以及目前现有的乳酸乳球菌(如下表2所述)，替代LYX-2后，按照实施例2所述方法进行检测，所得结果与LYX-2的结果对比如下表2所述。

表2

可见本发明所发现的乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)LYX-2是一株可有效处理含邻苯二甲酸二辛酯废水的高效菌株，可高效去除废水中的邻苯二甲酸二辛酯，对控制含邻苯二甲酸二辛酯废水对环境的影响具有一定的应用潜力，而其他相近属却没有该能力或者能力较弱。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

序列表

<110> 浙江大学

<120> 分离自冶炼厂土壤的乳酸乳球菌LXY-2及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1438

<212> DNA

<213> 乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)

<400> 1

ctagactcgc acctgagcgc tgatggttgg tacttgtacc gactggatga gcagcgaacg 60

ggtgagtaac gcgtggggaa tctgcctttg agcgggggac aacatttgga aacgaatgct 120

aataccgcat aaaaacttta aacacaagtt ttaagtttga aagatgcaat tgcatcactc 180

aaagatgatc ccgcgttgta ttagctagtt ggtgaggtaa aggctcacca aggcgatgat 240

acatagccga cctgagaggg tgatcggcca cattgggact gagacacggc ccaaactcct 300

acgggaggca gcagtaggga atcttcggca atggacgaaa gtctgaccga gcaacgccgc 360

gtgagtgaag aaggttttcg gatcgtaaaa ctctgttggt agagaagaac gttggtgaga 420

gtggaaagct catcaagtga cggtaactac ccagaaaggg acggctaact acgtgccagc 480

agccgcggta atacgtaggt cccgagcgtt gtccggattt attgggcgta aagcgagcgc 540

aggtggttta ttaagtctgg tgtaaaaggc agtggctcaa ccattgtatg cattggaaac 600

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atatatggag gaacaccggt ggcgaaagcg gctctctggc ctgtaactga cactgaggct 720

cgaaagcgtg gggagcaaac aggattagat accctggtag tccacgccgt aaacgatgag 780

tgctagatgt agggagctat aagttctctg tatcgcagct aacgcaataa gcactccgcc 840

tggggagtac gaccgcaagg ttgaaactca aaggaattga cgggggcccg cacaagcggt 900

ggagcatgtg gtttaattcg aagcaacgcg aagaacctta ccaggtcttg acatactcgt 960

gctattccta gagataggaa gttccttcgg gacacgggat acaggtggtg catggttgtc 1020

gtcagctcgt gtcgtgagat gttgggttaa gtcccgcaac gagcgcaacc cctattgtta 1080

gttgccatca ttaagttggg cactctaacg agactgccgg tgataaaccg gaggaaggtg 1140

gggatgacgt caaatcatca tgccccttat gacctgggct acacacgtgc tacaatggat 1200

ggtacaacga gtcgcgagac agtgatgttt agctaatctc ttaaaaccat tctcagttcg 1260

gattgtaggc tgcaactcgc ctacatgaag tcggaatcgc tagtaatcgc ggatcagcac 1320

gccgcggtga atacgttccc gggccttgta cacaccgccc gtcacaccac gggagttggg 1380

agtacccgaa gtaggttgcc taaccgcaag gagggcgctc ctaagtagac ccagggtc 1438

Claims (4)

1.乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)LXY-2，其特征在于保藏编号：CGMCC No.22159。

2.根据权利要求1所述的乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)LXY-2，其特征在于：该菌株16S rDNA基因序列如SEQ ID NO.1所示。

3.如权利要求1或2所述的乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)LXY-2用途，其特征在于：处理含邻苯二甲酸二辛酯废水。

4.根据权利要求3所述的乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)LXY-2用途，其特征在于：去除含邻苯二甲酸二辛酯废水中的邻苯二甲酸二辛酯。

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