CN115287198B - 一种多功能木霉菌株gddg-as 737及其应用 - Google Patents

一种多功能木霉菌株gddg-as 737及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于微生物技术领域,具体涉及一种多功能木霉菌株GDDG‑AS737及其应用。GDDG‑AS737(Trichodermasp.)为分离自广东东莞桉树根际的木霉菌株,保藏单位为中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC M2022718,保藏日期为2022年05月25日。本发明所提供的多功能木霉菌株GDDG‑AS 737具有很强的转化无效有机磷、促生及广谱拮抗作物病原菌的功能。

Description

一种多功能木霉菌株GDDG-AS 737及其应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域,具体涉及一种多功能木霉菌株GDDG-AS 737及其应用。
背景技术
木霉属(TrichodermaPers.)属于子囊菌门(Ascomycota)粪壳菌纲(Sordariomycetes)肉座菌目(Hypocreales)肉座菌科(Hypocreaceae)。木霉属真菌是一类重要的微生物资源,许多种类能够通过与宿主植物互作诱导植物产生抗逆性和对植物病害的拮抗活性,改善土壤根际微环境等途径来促进植物生长,从而在农业生产实践中,能够有效减少化肥和农药的施用。
磷是农业生产中的一个重要限制因素,磷肥作为常用肥料在农业中的大批量使用,也让难溶性磷不断地在土壤中累积。在土壤生态环境中,大部分磷元素通过与金属阳离子结合,以不溶解无机磷或有机磷的形式存在,植物难以直接吸收利用。近年来,我国的功能性解磷微生物研究还比较少,尤其是在解磷真菌类群的广泛分离筛选和多样性资源方面,不同类群和不同种属之间的溶磷微生物在溶磷作用上也差异明显,使得溶磷微生物肥料的产业化发展受到制约。
尽管木霉菌促生与拮抗功能的研究有很多,但大多是单一促生或拮抗作用,并且只是针对某一种植物病原菌的拮抗,具有溶磷、促生和生防等多功能木霉菌株资源还较少,无法满足绿色农业和生态应用实践的实际需求。
发明内容
为解决现有技术的不足,本发明提供了一种多功能木霉菌株GDDG-AS 737及其应用。本发明所提供的多功能木霉菌株GDDG-AS 737具有促生、溶磷和广谱拮抗病原菌的功能。
本发明所提供的技术方案如下:
一种多功能木霉菌株GDDG-AS 737,该菌株为木霉菌真菌菌株,该木霉菌菌株为Trichoderma sp.GDDG-AS 737,保藏单位为中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC M2022718,保藏日期为2022年05月25日。其为分离自广东东莞桉树根际的木霉菌株。
基于上述技术方案,本发明所提供的多功能木霉菌株GDDG-AS 737,具有促生、溶磷和广谱拮抗病原菌的多种功能,从而在农业和生态领域具有广泛的应用。
本发明还提供了上述多功能木霉菌株GDDG-AS 737的应用,用于制备生防菌剂。
基于上述技术方案,本发明所提供的多功能木霉菌株GDDG-AS 737制备作物病害的生防菌剂,具有广谱拮抗作物病害的功能和较高的抑菌率,适合制备生防菌剂。
具体的,用于制备对油茶炭疽菌、灰葡萄孢霉菌或大豆核盘菌中的任意一种或多种菌进行拮抗的生防菌剂。
基于上述技术方案,本发明所提供的多功能木霉菌株GDDG-AS 737制备生防菌剂,可对上述三种菌体现出很高的抑菌率。本发明还提供了多功能木霉菌株GDDG-AS 737的应用,用于制备促生菌剂。
基于上述技术方案,本发明所提供的多功能木霉菌株GDDG-AS 737具有明显的促生作用,可用于制备作物促生菌肥。具体的,用于制备黄瓜的促生菌剂。
基于上述技术方案,本发明所提供的多功能木霉菌株GDDG-AS 737对对黄瓜苗鲜重和干重都有显著的促生效果,适合制备黄瓜的促生菌剂。另外,也可用于其他的能够被GDDG-AS 737代谢产生的生长素IAA所促生的作物。
本发明还提供了多功能木霉菌株GDDG-AS 737的应用,用于制备转化不溶有机磷溶磷菌剂。
基于上述技术方案,本发明所提供的多功能木霉菌株GDDG-AS 737对有机磷有显著的溶磷功能,适合制备溶磷菌剂。
具体的,用于制备土壤不溶有机磷溶磷菌剂。
基于上述技术方案,本发明所提供的多功能木霉菌株GDDG-AS 737具有显著的溶磷功能,且可用于土壤环境,适合制备土壤溶磷菌剂。
本发明还提供了多功能木霉菌株GDDG-AS 737的应用,用于制备土壤改良菌剂。
基于上述技术方案,本发明所提供的多功能木霉菌株GDDG-AS 737具有显著的溶磷功能,可解决土壤中难溶性磷不断累积的问题,适合制备土壤改良菌剂。
本发明还提供了多功能木霉菌株GDDG-AS 737的应用,用于制备微生物肥料。
基于上述技术方案,本发明所提供的多功能木霉菌株GDDG-AS 737具有显著的溶磷功能,可解决土壤中难溶性磷不断累积的问题,可复合到微生物肥料中。
附图说明
图1是本发明所提供的GDDG-AS737的菌落特征及溶磷效果(图中,蒙金娜培养基正面左和反面右)。
图2是本发明所提供的GDDG-AS737对黄瓜苗促生作用(图中,上对照,下菌株处理)。
图3是本发明所提供GDDG-AS737对油茶炭疽菌对峙培养(图中,左正面,右背面,下CK)。
图4是本发明所提供GDDG-AS737对灰葡萄孢霉菌对峙培养(图中,左正面,右背面,上CK)。
图5是本发明所提供GDDG-AS737对大豆核盘菌对峙培养(左图中,正面,右背面,上CK)。
图6是本发明所提供GDDG-AS737菌株ITS-PCR电泳图谱。
图7是本发明所提供GDDG-AS 737分子系统发育树。
具体实施方式
以下对本发明的原理和特征进行描述,所举实施例只用于解释本发明,并非用于限定本发明的范围。
实施例1
木霉菌株解磷试验
植物根际土壤样品来源:使用“五点采样法”收集植物根际土壤。在植物靠近根处设点,铲去表层1-2cm的土壤后,取植物根系周围的土壤约200克,混合装入样品袋中,做好采样地点的经纬度、日期、植物名称等信息记录,并对植物进行拍照。土样带回实验室4℃保存备用。
Figure BDA0003703179630000041
培养基:
(1)无机磷培养基(g/L):葡萄糖10g、(NH4)2SO4 0.5g、NaCl 0.3g、KCl 0.3g、MgSO40.3g、MnSO4 0.03g、FeSO4·7H2O 0.03g、酵母膏0.5g、Ca3(PO4)2 3g、琼脂16g、蒸馏水1000mL,pH值6.8-7.0。121℃灭菌30min备用。
(2)有机磷培养基(g/L):葡萄糖10g、(NH4)2SO4 0.5g、NaCl 0.3g、KCl 0.3g、MgSO40.3g、MnSO4 0.03g、FeSO4·7H2O 0.03g、酵母膏0.4g、卵磷脂0.2g、CaCO35 g、琼脂16g、蒸馏水l000 mL,pH值7.0-7.2。121℃灭菌30 min备用
溶磷真菌的分离筛选:
(1)称取10g土样于90mL灭菌水中,于28℃摇床中振荡培养30min,转速为150r/min;
(2)采用梯度稀释法,土壤悬液浓度依次稀释成10-3、10-4和10-5,再依次取100μL分别涂布于无机磷培养基平板和有机磷培养基平板,每种浓度3次重复,28℃恒温暗箱倒置培养;
(3)培养5~7d后,挑取具有溶磷圈的单菌落于无机磷固体平板和有机磷固体平板上进行纯化验证,每个单菌落2次重复,28℃恒温倒置培养;
(4)纯化后对同种作物中形态相似的菌株进行合并保存,其中即包含有 GDDG-AS737。
平板解磷能力测定:
通过平板测定法,将纯化后的解磷真菌GDDG-AS 737接种于无机磷和有机磷培养基平板上,28℃恒温倒置培养,在第3-5d时采用十字交叉法测定菌落的直径(d)和溶磷圈的直径(D),并计算溶磷指数(SPI),SPI=溶磷圈直径/菌落直径。
测定结果:
如图1所示,GDDG-AS737菌株具有很强的溶解有机磷的能力,SPI值达到1.05。
实施例2
木霉菌株促生试验
黄瓜试管苗促生评价实验
将木霉菌株接种到PDA培养平板活化,28℃培养5d后,木霉菌丝和孢子铺满培养平板备用。
本实验选择中农6号黄瓜品种,选用籽粒饱满均一的种子,首先用10%次氯酸钠消毒5分钟,然后用无菌水冲洗5次;将处理的种子蘸1%CMC(羧甲基纤维素钠),然后分别在木霉菌株培养平板上轻轻蘸取菌株的孢子和菌丝体;将上述处理的种子按10粒/皿放在铺有灭菌处理纱布和培养皿中,滴加灭菌蒸馏水保湿,培养箱28℃黑暗培养4d,长出子叶和根,然后光照培养24小时,备用。
采用150*15mm试管,灭菌,1/8MS培养基灭菌,将试管放于试管架上,加入适量1/8MS培养基。将上述黄瓜幼苗移种于试管中,1株/管,每株5 个重复,放在温室中培养,温度25-28℃,组织培养灯白天晚上交替光照黑暗培养,15-20d后收获测定其鲜重和干重。
实验数据分析:
用Excel软件整理数据,选择LSD法检验不同处理间的差异显著性 (p<0.05),DPS软件来进行方差分析。统计黄瓜苗的株高、鲜重和干重等指标,通过如下公式计算木霉菌株对黄瓜试管苗的促生率:
木霉菌促生率(%)=(处理试管苗重量-对照试管苗重量)/(对照试管苗重量)×100%
实验结果:
GDDG-AS737对黄瓜苗生长的影响如表1、图2所示。
表1 GDDG-AS737对黄瓜苗生长的影响
Figure BDA0003703179630000061
注:同列数字后不同小写字母表示显著差异(P≤0.05)
黄瓜试管苗评价试验结果表明,相较于对照,菌株GDDG-AS737对黄瓜苗鲜重和干重的促生率分别为23.56%±0.010%和19.56%±0.197%。
实施例3
木霉菌株拮抗试验
供试病原菌
作物病原菌油茶炭疽菌(Colltotrichumcamelliae)、灰葡萄孢霉 (Botrytiscinerea)和大豆核盘菌(Sclerotiniasclerotiorum),由中国农业科学院植物保护研究所李世东实验室提供。
平板对峙法试验方法
将待测的木霉菌株接种到PDA培养平板活化,28℃培养5d后,用0.5cm 打孔器分别取病原菌与待测木霉菌饼,将两菌接种于同一PDA平板上,相距 4cm,每组3个重复,以单接病原菌为对照,置于28℃培养,7d后测量病原菌朝向木霉菌的菌落半径,并计算GDDG-AS737的抑制率。
木霉菌抑制率(%)=(对照病原菌菌落半径-处理病原菌菌落半径)/(对照病
原菌菌落半径)×100%
实验结果:
如表2和图3到5所示,为菌株GDDG-AS737对峙培养对植物病原菌的抑制作用。
表2对峙培养对植物病原菌的抑制作用
Figure BDA0003703179630000071
实施例4
木霉菌株的分子系统发育树构建及种类鉴定
(1)待活化菌株生长至铺满培养平板后,用灭菌手术刀刮取菌丝并收集,采用2%CTAB法提取基因组DNA;
(2)使用真菌ITS通用引物,ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’,SEQ ID NO.1)和ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’,SEQ ID NO.2)进行PCR 扩增。PCR反应体系(25μL):2×Es Taq Master Mix(北京天根生物技术有限公司)12.5μL、DNA模板1μL、通用引物ITS1和ITS4各1μL、 dd H2O 9.5μL,对照加入dd H2O代替DNA模板。PCR扩增条件:94℃预变性5min;94℃变性30s,56℃退火30s,72℃延伸1min,35个循环;72℃延伸10min,8℃∞。扩增产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测后,送上海生工公司进行测序,得到长约551bp的序列,如SEQ IDNO.3所示;
(3)将测序结果与NCBI的GenBank中的ITS序列进行比对,选取序列相似性较高的作为参考序列,再用BioEdit软件(version 7.0.9)进行序列比对并手动校正,将处理好的数据通过MEGA6.0软件和测序序列进行多位点序列比对,手动剪切校正序列,选择邻接法(Neighbor-Joining Tree)构建分子系统发育树,鉴定木霉菌株的分类地位。
ITS rDNA扩增结果如图6所示。
GDDG-AS737的SEQ ID NO.3如下:
CTCCCAAACCCAATGTGAACCATACCAAACTGTTGCCTCGGCGGGGTC ACGCCCCGGGTGCGTCGCAGCCCCGGAACCAGGCGCCCGCCGGAGGG ACCAACCAAACTCTTTCTGTAGTCCCCTCGCGGACGTTATTTCTTACAG CTCTGAGCAAAAATTCAAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTC TTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGT GAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCC CGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCAACCCTCG AACCCCTCCGGGGGGTCGGCGTTGGGGATCGGGAACCCCTAAGACGG GATCCCGGCCCCGAAATACAGTGGCGGTCTCGCCGCAGCCTCTCCTGC GCAGTAGTTTGCACAACTCGCACCGGGAGCGCGGCGCGTCCACGTCC GTAAAACACCCAACTTCTGAAATGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATA CCCGCTGAACTTAAGCATATCAA
分子系统发育学鉴定
菌株GDDG-AS 737与多罗西木霉Trichoderma dorotheae和康宁木霉Trichoderma koningiopsis聚为一类,初步鉴定GDDG-AS 737为它们近源种类的木霉真菌,见图7。
实施例5
多功能木霉菌株GDDG-AS 737,进行保藏,该菌株为木霉菌真菌菌株,该木霉菌菌株为Trichoderma sp.GDDG-AS 737,保藏单位为中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC NO:M 2022718,保藏地址为中国武汉武汉大学,保藏日期为2022年05月25日。
以上所述仅为本发明的较佳实施例,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 贵州民族大学
<120> 一种多功能木霉菌株GDDG-AS 737及其应用
<141> 2022-06-08
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> tongyongyinwu
<400> 1
tccgtaggtg aacctgcgg 19
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> tongyongyinwu
<400> 2
tcctccgctt attgatatgc 20
<210> 3
<211> 551
<212> DNA
<213> GDDG-AS737
<400> 3
ctcccaaacc caatgtgaac cataccaaac tgttgcctcg gcggggtcac gccccgggtg 60
cgtcgcagcc ccggaaccag gcgcccgccg gagggaccaa ccaaactctt tctgtagtcc 120
cctcgcggac gttatttctt acagctctga gcaaaaattc aaaatgaatc aaaactttca 180
acaacggatc tcttggttct ggcatcgatg aagaacgcag cgaaatgcga taagtaatgt 240
gaattgcaga attcagtgaa tcatcgaatc tttgaacgca cattgcgccc gccagtattc 300
tggcgggcat gcctgtccga gcgtcatttc aaccctcgaa cccctccggg gggtcggcgt 360
tggggatcgg gaacccctaa gacgggatcc cggccccgaa atacagtggc ggtctcgccg 420
cagcctctcc tgcgcagtag tttgcacaac tcgcaccggg agcgcggcgc gtccacgtcc 480
gtaaaacacc caacttctga aatgttgacc tcggatcagg taggaatacc cgctgaactt 540
aagcatatca a 551

Claims (9)

1.一种多功能木霉菌株GDDG-AS 737,其特征在于:该菌株为木霉菌真菌菌株,该木霉菌菌株为Trichodermasp.GDDG-AS 737,保藏单位为中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC M 2022718,保藏日期为2022年05月25日。
2.一种根据权利要求1所述的多功能木霉菌株GDDG-AS 737的应用,其特征在于:用于制备生防菌剂。
3.根据权利要求2所述的应用,其特征在于:用于制备对油茶炭疽菌、灰葡萄孢霉菌或大豆核盘菌中的任意一种或多种菌进行拮抗的生防菌剂。
4.一种根据权利要求1所述的多功能木霉菌株GDDG-AS 737的应用,其特征在于:用于制备促生菌剂。
5.根据权利要求4所述的应用,其特征在于:用于制备黄瓜的微生物菌肥。
6.一种根据权利要求1所述的多功能木霉菌株GDDG-AS 737的应用,其特征在于:用于制备降解或转化不溶性有机磷菌剂。
7.根据权利要求6所述的应用,其特征在于:用于制备土壤有机磷溶磷菌剂。
8.一种根据权利要求1所述的多功能木霉菌株GDDG-AS 737的应用,其特征在于:用于制备土壤改良菌剂。
9.一种根据权利要求1所述的多功能木霉菌株GDDG-AS 737的应用,其特征在于:用于制备微生物肥料。
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